阿霉素處理后對犬乳腺腫瘤細胞系CHMp lncRNAs差異表達的影響

摘 要：為了旨在探究阿霉素對犬乳腺腫瘤細胞中lncRNAs分子的影響，尋找犬乳腺腫瘤潛在生物標志物和治療靶點，本試驗采用RNA-Seq技術對經阿霉素處理的犬乳腺腫瘤細胞進行轉錄組測序分析，篩選差異表達lncRNAs，應用GO富集和KEGG富集分析進行基因功能和途徑注釋并驗證其表達情況。結果顯示，經阿霉素處理后的犬乳腺腫瘤細胞中共有277個差異表達的lncRNAs，其中，147個表達上調，130個表達下調，主要涉及細胞新陳代謝、轉錄程序失調、ECM受體相互作用以及細胞壞死性凋亡等生物學過程。實時熒光定量PCR技術隨機檢測3個差異表達的lncRNAs，其表達趨勢與RNA-Seq一致，表明RNA-Seq測序結果的準確性。本研究基于轉錄組學技術，綜合分析阿霉素抗犬乳腺腫瘤細胞相關lncRNAs表達變化的整體特征，揭示其可能的調控新機制，為犬乳腺腫瘤的靶向治療和潛在生物標志物的開發利用提供參考。

關鍵詞：lncRNA；犬；乳腺腫瘤細胞；阿霉素；RNA-Seq

中圖分類號：S857.26

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）06-2716-11

收稿日期：2023-10-10

基金項目：國家自然科學基金青年基金項目（32302946）；福建省教育廳中青年教師教育科研項目（JAT210085）；新瑞鵬寵物醫療集團有限公司、深圳市瑞鵬公益基金會（KH210163A）

作者簡介：張 琰（2000-），女，福建龍巖人，碩士，主要從事lncRNA與犬腫瘤研究，E-mail：mszyzhangyan@foxmail.com

*通信作者：刁洪秀，主要從事小動物腫瘤、獸醫麻醉與鎮痛研究，E-mail：diaohongxiu@yeah.net

The Effect of Doxorubicin Treatment on the Differential Expression of

lncRNAs in Canine Mammary Tumor CHMp Cell Line

ZHANGYan，WUMeijin，ZHOUJiahao，DIAOHongxiu^*

（College of Animal Sciences（College of Bee Science），Fujian Agriculture and Forestry University，Key Laboratory of

Animal Pathogen Infection and Immunology of Fujian Province，Fuzhou350002，China）

Abstract：To explore the effect of doxorubicin on lncRNAs in canine breast tumor cells and find potential biomarkers and therapeutic targets for canine mammary tumor，RNA-Seq technology was used to perform transcriptome sequencing analysis on canine breast tumor cells treated with doxorubicin，and differentially expressed lncRNAs were screened.GO enrichment and KEGG enrichment analysis were used to annotate gene functions and pathways and verify their expression.The results showed that there were277differentially expressed lncRNAs in canine breast tumor cells after doxorubicin treatment，of which147were up-regulated and130were down-regulated，mainly involving biological processes such as cell metabolism，transcriptional program disorder，ECM receptor interaction and cell necroptosis.Three differentially expressed lncRNAs were randomly detected by real-time quantitative PCR，and their expression trends were consistent with RNA-Seq，indicating the accuracy of the RNA-Seq sequencing results.Based on transcriptomics technology，this study comprehensively analyzed the overall characteristics of the expression changes of lncRNAs related to doxorubicin against canine breast tumor cells，revealed its possible new regulatory mechanisms，and provided areference for the targeted therapy of canine mammary tumor and the development and utilization of potential biomarkers.

Key words：lncRNA; canine; mammary tumor cells; doxorubicin; RNA-Seq

*Corresponding author：DIAO Hongxiu，E-mail：diaohongxiu@yeah.net

乳腺癌是人與犬高發的重要腫瘤性疾病，2020年，人乳腺癌超越肺癌成為全球癌癥發生率最高的癌種，且呈現年輕化趨勢^[1]。犬乳腺腫瘤（canine mammary tumor，CMT）是獸醫臨床最常見的腫瘤之一，其發生率可占全部腫瘤性疾病50%～70%^[2]，且超過50%的腫瘤會向局部淋巴結轉移^[3]，而癌癥死亡超過90%是因轉移引起^[4]，因此犬乳腺腫瘤是獸醫臨床急需解決的重要性疾病。此外，越來越多研究證實，自發性犬乳腺腫瘤可作為人乳腺癌研究的理想模型^[3]，能夠更快地完成抗癌藥物在不同臨床分期的測試，有助于抗癌藥物的研發。因此，深入研究犬乳腺腫瘤的發生發展與治療不僅在獸醫臨床中具有重要意義，對人乳腺腫瘤治療方案的拓展也具有重要借鑒意義。

阿霉素（doxorubicin，DOX）是乳腺癌治療一線化療藥物，其可直接插入DNA堿基中，抑制拓撲異構酶Ⅱ活性，影響DNA合成，同時促進自由基形成，最終激活caspases途徑誘導腫瘤細胞凋亡^[5]，但其與長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）的關系尚不清楚。lncRNA是長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，曾一度被認為是“轉錄噪音”。隨著研究的不斷深入發現，lncRNA能與DNA、RNA和蛋白質進行結合，在基因轉錄、轉錄后加工、RNA代謝、翻譯和翻譯后修飾等多個層面參與機體的生命活動調節。更重要的是，lncRNA在多種疾病發生發展中被賦予重要的調節功能，其有望成為疾病診斷的潛在生物標志物和治療靶點。在腫瘤學領域研究證實lncRNA參與腫瘤細胞增殖、代謝以及腫瘤微環境的調節^[6]。在白血病的研究中發現，敲低lncRNA IUR1能夠促進Abl介導的小鼠原代骨髓細胞轉化與白血病的形成，進一步對其機制研究發現lncRNA IUR1通過負向調控STAT5介導GATA3的表達發揮抗癌作用^[7]。此外，在Groff等^[8]研究發現，lncRNA p21基因位點存在多個啟動增強子，可通過順式作用周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（CDKN1A）參與細胞周期的調控。這些研究為lncRNA參與腫瘤發生發展等過程提供了有力的科學依據。

本研究以犬乳腺腫瘤CHMp細胞系為模型，采用轉錄組測序（RNA-Sequence，RNA-Seq）和分析技術，篩選出阿霉素調節犬乳腺腫瘤細胞差異表達的lncRNAs，并進行生物信息學分析，探究阿霉素抗腫瘤新的潛在機制，為犬乳腺腫瘤的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

犬乳腺腫瘤細胞系CHMp，由日本東京大學獸醫學院外科教研室饋贈。阿霉素購自美國APExBIO公司，DMEM培養基、胎牛血清、胰酶和青霉素-鏈霉素溶液均購自美國Gibco公司，CCK8試劑盒購自日本東仁化學科技有限公司，RNA提取試劑盒購自北京聚合美生物科技有效有限公司。

1.2 阿霉素對CHMp細胞活力的影響

將對數生長期的CHMp細胞按照2000·孔^-1接種于96孔細胞板，37℃，5%CO₂細胞培養箱中培養，待細胞貼壁后，分別加入終濃度0.11、0.33、1.00和3.00μg·mL^-1的阿霉素，每個處理設置5個重復，48h后每孔加入CCK8試劑10μL，37℃孵育1h左右，450nm處測定吸光度（OD值），細胞存活率（%）=（OD試驗孔-OD空白孔）/（OD對照孔-OD空白孔）×100%，利用Graphpad Prism8.0計算IC₅₀。

1.3 阿霉素處理后的CHMp細胞轉錄組測序分組及RNA提取

對數生長期CHMp細胞按照5×10⁶·孔^-1接種于6孔細胞板，37℃，5%CO₂細胞培養箱中培養，待細胞貼壁后，參照“1.2”試驗方法中阿霉素的IC₅₀處理細胞，48h后收集細胞，并根據RNA提取試劑盒進行總RNA的提取，使用NanoDrop^TM2000對RNA樣品進行濃度測定，A_260nm/A_280nm在1.9～2.1之間的RNA樣本用于后續試驗。

1.4 阿霉素處理后的CHMp細胞轉錄組測序及分析

轉錄組文庫的制備和測序由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成，應用二代高通量測序平臺（IlluminaHiSeq）進行樣本的測序，并將其以fastq格式儲存起來作為raw data樣本的原始測序數據進行測序相關質量評估，包括堿基質量分布統計、堿基錯誤率分布統計、堿基含量分布統計，使用SeqPrep軟件和Sickle進行指控數據統計，從而獲得高質量的clean data，應用TopHat2軟件和HISAT2將clean data與犬基因組（Canis familiaris）進行匹配比對，獲得mapped data（reads）。使用StringTie或Cufflinks軟件對mapped reads進行拼接，并與原有的基因組注釋信息進行比較，發掘新的轉錄本。

1.5 阿霉素處理后的CHMp細胞lncRNA的鑒定及表達量分析

從NONCODE、GreeNC、Ensembl、NCBI數據庫下載已經報道的lncRNA的序列，基于這些數據庫進行已知lncRNA的鑒定。同時，篩選新轉錄本預測結果中class code分類信息為‘x’‘i’‘j’‘u’‘o’類型的轉錄本，在此基礎上，選擇長度≥200bp，Exon個數≥2，ORF長度≤300bp的轉錄本作為初步篩選的候選lncRNA。然后利用CPC分析、CNCI分析、CPAT分析、Pfam蛋白結構域分析預測編碼能力，最終選取這四個軟件的交集為最終的lncRNA數據集。

使用TPM定量估計基因表達值，運用DEseq2軟件進行不同組別之間差異表達基因分析，以|log₂FC|≥1和P adjust＜0.05為篩選條件，統計表達具有顯著差異性的基因。

1.6 阿霉素處理后的CHMp細胞差異表達基因的功能分析

采用軟件Goatools對基因集中的轉錄本進行GO富集分析，使用方法為Fisher精確檢驗，采用BH方法對P值進行校正，當經過校正的P值（FDR）＜0.05時，認為此GO功能存在顯著富集情況。通路富集分析采用KEGG獲得功能注釋，同樣采用Fisher精確檢驗，確定差異表達基因顯著性富集的通路。

1.7 阿霉素處理后的CHMp細胞差異表達基因的驗證

為驗證測序數據的準確性，隨機選擇3個lncRNAs進行驗證。采用1μg·mL^-1阿霉素處理CHMp細胞24和48h后，利用TRIzol法提取細胞總RNA進行實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測，每個樣品進行三次生物學重復。引物信息見表1。

1.8 統計學分析

數據均以“x-±s”表示，采用SPSS18進行單因素方差分析，其中，P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為極顯著差異。

2 結 果

2.1 阿霉素對CHMp細胞增殖效果的影響

用不同濃度的阿霉素處理CHMp細胞48h后，細胞存活率如圖1所示，阿霉素抑制CHMp細胞增殖，并呈現劑量依賴性關系。CHMp細胞在48h的IC₅₀為1.01μg·mL^-1。為進一步探究lncRNA在阿霉素抗犬乳腺腫瘤中的作用及機制，選擇1μg·mL^-1阿霉素處理CHMp細胞，應用轉錄組學技術篩選關鍵的lncRNAs。

2.2 測序數據質量評估

利用Illumina novaseq6000進行轉錄組測序，得到130.74Gb clean data，各樣品clean data均達到20.62Gb以上，Q30堿基百分比在93.85%及以上，詳見表2。各樣本與參考基因組序列比對效率在93.49%～94.5%，匹配率高，表明測序質量可靠。

2.3 樣本相關性分析

對樣本生物重復性相關分析發現，各組生物學重復間相關系數均在0.99以上（圖2），表明組內一致性較高，生物學重復性較好。PCA分析發現，樣本組間區分明顯（圖3），組間重復性良好。

2.4 阿霉素處理后CHMp細胞差異表達lncRNA的篩選

經RNA-Seq分析，在對照組和試驗組中分別檢測到795和917個lncRNAs，其中，共表達lncRNAs有719個。將|log₂FC|≥1和P adjust＜0.05定義為差異顯著，共檢測到277個差異表達的lncRNAs，其中，147個表達上調，130個表達下調，差異表達lncRNAs火山圖見圖4。為了更好反映對照組與試驗組差異lncRNAs的表達情況，對不同表達模式的轉錄本進行聚類。由圖5可見，經阿霉素處理后細胞內lncRNAs的差異變化情況，不同樣品組相互之間的轉錄本表達差異顯著，彼此之間可以較好區分。

2.5 阿霉素處理后CHMp細胞差異表達lncRNA的靶基因功能分析

對277個差異表達lncRNAs靶基因進行預測與GO功能注釋，差異表達lncRNAs的靶基因富集到36條GO條目中，細胞組分（cellular component）13條，分子功能（molecular function）7條，生物過程（biological process）16條。主要富集在細胞進程、細胞組分組成或再生、綁定和細胞器等方面，顯示豐度前20見圖6。

對差異表達lncRNAs靶基因進行KEGG富集分析發現，其主要富集在全身性紅斑狼瘡、酒精中毒、病毒的致癌作用、細胞壞死性凋亡、癌癥中的轉錄失調和ECM受體相互作用等生物過程，詳見圖7。

2.6 差異表達lncRNA的驗證

為驗證RNA-Seq測試結果的準確性，隨機選擇3個差異表達的lncRNAs進行qRT-PCR檢測，結果如圖8所示，與對照組相比，基因MSTRG.21 292.1、MSTRG.21 304.2、MSTRG.21 335.2在經阿霉素處理后犬乳腺腫瘤細胞中表達水平極顯著下調（Plt;0.001），與RNA-Seq的檢測結果一致，進一步表明本次RNA-Seq測序結果的可靠性。

3 討 論

犬乳腺腫瘤是一種高度異質性腫瘤，嚴重威脅犬生命和健康。隨著犬生存期不斷延長，越來越多中老年犬患有乳腺腫瘤，且惡性率高達51.59%^[9]。

乳腺腫瘤不僅是雌性中老年犬中最常見的惡性腫瘤之一，同時也是全球女性最常見的癌癥之一，是導致死亡的第二大原因^[10]。值得注意的是，犬乳腺癌在流行病學、組織學、遺傳學及病理學上與人類乳腺癌十分相似，可作為人類乳腺癌研究的理想動物模型^[11]。

阿霉素又稱多柔比星，具有廣泛的抗癌活性。自20世紀70年代以來，一直被認為是治療乳腺癌最有效的化療藥物之一，現已成為臨床化療首選藥物之一^[12]。在轉移性犬乳腺腫瘤中，一定濃度范圍（0.1～100.0μmol·L^-1）的阿霉素可以有效抑制犬乳腺腫瘤細胞體外增殖^[13]，使細胞周期阻滯于S期，并引起細胞死亡，調節細胞活力^[14]?；熕幬锫摵蠎檬前┌Y治療中最有效手段之一，Bakirel等^[15]研究發現德拉昔布（deracoxib，DER）能夠協同阿霉素發揮抗腫瘤活性，降低阿霉素在犬乳腺腫瘤細胞中IC₅₀，調節細胞周期并促進凋亡。與之相似，阿霉素與犬羊膜干細胞（canine amniotic membrane stem cells，AMCs）聯合使用也能增強抗腫瘤活性，有望成為犬乳腺癌治療有效方法之一^[16]。而與分子碘（I₂）結合后，不僅增加了阿霉素抗腫瘤作用，還減弱了阿霉素引起的正常組織氧化損傷，有效改善犬乳腺癌治療效果，提高了犬生存率和無復發生存率^[17]。

隨著高通量測序技術的發展和廣泛應用，lncRNA成為一種新型受到重視的非編碼RNA，其表達和失調比蛋白質編碼基因更具有癌癥特異性。最新研究表明lncRNA與腫瘤發生發展及耐藥相關，并在乳腺癌中發揮重要生物學功能，如細胞增殖、黏附、遷移、侵襲、凋亡和血管生成^[18-19]。乳腺癌中具有大量差異表達的lncRNA分子，且多種lncRNA已被證實具有致癌作用，如H19、HOTAIR、MALAT-1、CCAT1、CCAT2和UCA1等，相反GAS5、EPB41L4A-AS2、BC040587和FGF14-AS2等具有抑癌作用^[20]。郭晨明等^[21]發現lncRNA XIST在miR-20a-5p/HMGA2軸上抑制乳腺癌細胞增殖、侵襲及遷移，促進細胞凋亡，為乳腺癌的靶向治療提供了新靶點。lncRNA FAR2P1在乳腺癌中高表達，可促進乳腺癌細胞的增殖遷移并抑制其凋亡^[22]，而lncRNA LOXL1-AS1則可以通過miR-28-5p/IGF-1軸調控乳腺癌細胞的增殖、侵襲與凋亡，具有促癌功能^[23]，這些結果強調了lncRNA在人類乳腺癌發生發展中起重要作用。近年來，lncRNA在獸醫學領域同樣也備受矚目，近期發現了一條新型lncRNA42060可作為一個腫瘤促進因子，通過miR-204-5p靶向SOX4調控犬乳腺腫瘤細胞的增殖、遷移、克隆和微乳球形成能力，可作為犬乳腺癌治療潛在生物標志物^[24]。相似的是，lncRNA34977通過調節miR-8881/ELAVL4表達，促進犬乳腺腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲，并抑制凋亡，而lncRNA40589作用則相反，其抑制乳腺腫瘤細胞增殖和遷移^[25-26]。由此可見，lncRNA在癌癥中的異常表達可以通過直接或間接作用參與癌癥的發生、進展，有望成為癌癥診斷和治療的潛在生物標志物和治療靶點。

因此，本研究利用阿霉素處理的犬乳腺腫瘤細胞系進行高通量測序分析，檢測lncRNA表達譜變化，篩選出277個差異表達lncRNAs，其中，147個表達上調，130個表達下調，通過GO功能注釋和KEGG富集分析發現，這些lncRNA分子在細胞新陳代謝、轉錄程序失調、ECM受體相互作用以及細胞壞死性凋亡通路中發揮關鍵作用。ECM是一種阻止腫瘤細胞遷移至新組織的物理屏障，由原纖維或非原纖維膠原、彈性蛋白、蛋白多糖、糖蛋白、層粘連蛋白、纖維連接蛋白等組成，這些蛋白結構的改變可影響腫瘤細胞黏附、腫瘤生長、侵襲和轉移^[27]。研究發現，犬乳腺腫瘤中ECM的結構和成分均會發生變化，造成基底膜降解，IV型膠原和層粘連蛋白減少，最終導致細胞骨架結構和組織功能喪失，促進腫瘤細胞擴散^[28]。另一方面，ECM硬化可以誘導乳腺上皮細胞惡性轉化，通過下調miR-203表達和激活ZNF217介導的AKT通路來刺激乳腺上皮細胞增殖，同時增強間充質干細胞分化為成纖維細胞，間接促進乳腺癌細胞增殖^[29-30]。但lncRNA與ECM的關系尚不清楚，可能成為犬乳腺腫瘤研究和治療的新方向。壞死性凋亡在腫瘤中的作用存在爭議性，有研究認為壞死性凋亡是惡性乳腺腫瘤主要的程序性細胞死亡途徑，其可通過TNF-α、干擾素、Toll樣受體（toll-like receptors，TLRs）、病毒及各種物理和化學應激源等刺激觸發^[31]。在MDA-MB-231、MCF-7等乳腺癌細胞系中，參與壞死性凋亡的調節因子RIPK1、RIPK3與MLKL高度表達^[32]。但也有研究發現腫瘤介導細胞壞死性凋亡后，細胞表面蛋白脫落可以抑制T細胞的抗腫瘤活性而促進癌癥轉移^[33]。Karsch-Bluman等^[34]發現壞死性惡性乳腺癌細胞裂解后將誘發血管生成和內皮細胞增殖，并促進遷移、侵襲和細胞間相互作用。與壞死性凋亡相似，轉錄調控過程在惡性細胞中也可能失調或紊亂，致癌或腫瘤抑制轉錄因子以及細胞調節因子與腫瘤微環境誘導因子的失調共同影響多個生物過程，如腫瘤細胞的表觀遺傳學改變、腫瘤的增殖、侵襲和轉移。與癌癥相關基因的改變可以影響轉錄調控水平的蛋白質，包括反式因子（轉錄因子、信號蛋白、輔因子、染色質調節因子和染色體結構蛋白）及順式元件（增強子、啟動子和絕緣體）^[35]。轉錄程序的失調將導致癌細胞高度依賴基因表達的調節因子，這可能與早期腫瘤發生過程中細胞生長和存活有關。作為一種與細胞增殖相關的轉錄因子FOXM1能直接或間接激活靶基因的表達來維持病變特征，其表達失調可促進腫瘤發生發展^[36]。ELF5轉錄因子通常在乳腺腫瘤中失調，并被證明是通過轉錄抑制SNAI2的表達抑制癌細胞上皮間充質轉化^[37]。本實驗研究結果分析發現，阿霉素在犬乳腺腫瘤細胞中的抗腫瘤活性與上述一種或多種途徑密切相關，差異表達的lncRNA可能影響著轉錄調控機制，同時可能通過ECM蛋白相互作用誘導細胞壞死性凋亡，但其具體的作用及機制尚需更多研究來證實。

4 結 論

本研究運用RNA-Seq技術探索了經阿霉素處理的犬乳腺腫瘤細胞lncRNA表達譜，篩選出277個差異表達的lncRNAs，進一步分析發現這些lncRNAs與細胞進程、壞死性凋亡、ECM蛋白相互作用及癌癥中的轉錄失調密切聯系，提示阿霉素潛在的抗腫瘤新機制，為犬乳腺腫瘤的診斷和治療提供潛在生物標志物和治療靶點。

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（編輯 白永平）