甘草多糖對LPS誘導小鼠睪丸炎的調節作用

摘 要：本研究旨在探討甘草多糖（glycyrrhiza polysaccharide，GPS）對LPS誘導小鼠睪丸炎的調節作用及其可能機制。將60只8周齡的雄性C57BL/6J小鼠，隨機分為6組（每組10只）：空白對照組、模型組（LPS組）、陽性對照組（地塞米松組）、GPS低中高劑量組（100、200、400mg·kg^-1）。試驗前20d GPS低中高劑量組灌胃給予相應劑量的GPS，其他組灌胃同等劑量的生理鹽水，第21天模型組腹腔注射5mg·kg^-1LPS，其他組腹腔注射等量的生理鹽水，2h后，陽性對照組灌胃給予5mg·kg^-1的地塞米松，12h后，按照動物倫理學標準處死小鼠，收集小鼠血液及睪丸組織。運用HE染色法觀察小鼠睪丸組織結構形態學變化，酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測血清中睪酮激素（testosterone，T）含量及乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）水平，南京建成試劑盒檢測氧化損傷指標（T-SOD、CAT、GSH）變化，實時熒光定量PCR法檢測睪丸組織中緊密連接蛋白（Occludin、ZO-1）、炎癥因子（IL-18、IL-1β、IL-6、TNF-α）及細胞焦亡關鍵因子（caspase-1、NLRP3、GSDMD）mRNA表達變化，Western blot法檢測IL-18、IL-1β、NLRP3、GSDMD的蛋白表達水平。結果顯示，陽性對照組與GPS中高劑量組可以顯著緩解LPS誘導的小鼠睪丸組織結構損傷，增加血清睪酮含量，改善氧化損傷，降低促炎因子mRNA表達水平，并抑制細胞焦亡發生。綜上所述，GPS可以有效緩解LPS誘導的睪丸炎損傷，其作用機制可能與改善睪丸組織氧化損傷，抑制細胞焦亡，阻止炎癥反應相關。

關鍵詞：甘草多糖；LPS；睪丸炎；細胞焦亡

中圖分類號：S853.74

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）06-2741-10

收稿日期：2023-09-25

基金項目：山西省基礎研究計劃項目（202103021223329）；山西省優秀博士來晉工作獎勵資金科研項目（I0210261）；太原師范學院科研啟動經費項目

作者簡介：李美艷（1990-），女，博士生，主要從事環境獸醫學、天然產物的開發利用研究，E-mail：limeiyansx@163.com

*通信作者：武曉英，主要從事環境獸醫學、天然產物的開發利用研究，E-mail：wuxy@tynu.edu.cn

Regulation of Glycyrrhizol Polysaccharide Alleviate LPS-induced Orchitis in Mice

LIMeiyan^1，2，XINGXiaoying¹，LINa¹，ZHANGYeli¹，QIAOHongping¹，WUXiaoying^1*

（1.College of Biological Sciences and Technology，Taiyuan Normal University，Taiyuan030000，

China; 2.College of Veterinary Medicine，Shanxi Agricultural University，Taigu030800，China）

Abstract：The present study aimed to investigate the regulation and its possible mechanism of glycyrrhiza polysaccharide（GPS）on LPS-induced orchitis in mice.Sixty8-week-old male C57BL/6J mice were randomly divided into6groups（10mice per group）：Blank control group，model group（LPS group），positive control group（dexamethasone group）and GPS low，medium，high dose（100，200，400mg·kg^-1）group.On the first20days，GPS low，medium，high dose group was given the corresponding dose of GPS by intragastric，and other groups were given the same dose of physiological saline by intragastric.On the21st day，model group was intraperitoneally injected with5mg·kg^-1LPS，and other groups were intraperitoneally injected with the same amount of physiological saline，2h later，the positive control group was given5mg·kg^-1dexamethasone by intragastric，12h later，the mice were sacrificed according to animal ethical standards，blood and testicular tissues were collected.The morphological changes of testicular tissue were observed by HE staining，the content of testosterone（T）and the level of lactate dehydrogenase（LDH）in serum were detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA），and the changes of oxidative damage indexes（T-SOD，CAT，GSH）were detected by Nanjing Jiancheng Kit.Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect mRNA expression changes of tight junction proteins（Occludin，ZO-1），inflammatory factors（IL-18，IL-1β，IL-6，TNF-α）and key cytokines of pyroptosis（caspase-1，NLRP3，GSDMD）in testis，western blot was used to detect the protein expression of IL-18，IL-1β，NLRP3，GSDMD.The results showed that dexamethasone group and GPS medium，high dose groups could significantly relieve the LPS-induced testicular damage，increase the serum testosterone content，reduce oxidative damage，decrease the mRNA expressions of pro-inflammatory cytokines，and inhibit the occurrence of pyroptosis.In summary，GPS could effectively alleviate LPS-induced orchitis injury，which may related to reducing oxidative damage，inhibiting pyroptosis and preventing inflammatory response.

Key words：glycyrrhizol polysaccharide; LPS; orchitis; pyroptosis

*Corresponding author：WU Xiaoying，E-mail：wuxy@tynu.edu.cn

睪丸炎是一種以睪丸內白細胞浸潤，曲細精管損傷為特征的炎癥性病變。睪丸炎嚴重影響動物的繁殖發育^[1-4]。LPS是革蘭陰性菌的重要成分，常用于感染性睪丸炎模型的制備^[5]。研究表明，長期生活在LPS環境下的小鼠，其雄性后代的血清睪酮水平顯著降低，精子數量顯著減少^[6]。因此，本研究中，我們用LPS感染構建小鼠睪丸炎模型，以探究甘草多糖（glycyrrhiza polysaccharide，GPS）是否可以預防睪丸炎的發生及其作用機制。

甘草多糖是從甘草中萃取的一種天然植物多糖，具有抗炎、抗腫瘤、增強免疫和抗氧化等藥物學功能^[7]，在醫藥衛生和食品領域有極大的利用價值。研究表明，甘草多糖可以減弱炎性因子和炎性介質的生成^[8]，對肝損傷及肺部炎癥和氧化損傷具有良好的修復作用^[9-10]。

本試驗通過構建小鼠睪丸炎模型，檢測血清中睪酮含量的變化、觀察睪丸組織結構形態學變化、檢測炎癥相關因子表達量變化，旨在闡明甘草多糖對LPS誘導小鼠生殖系統損傷的影響及其作用機制，為進一步研究睪丸炎癥的預防、甘草多糖的功能提供理論依據，并為其臨床應用提供一定的科學基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8周齡雄性C57BL/6J小鼠，購自山西省人民醫院動物中心，生產許可證號SCXK（晉）2019-0001。在適應期和試驗期，所有小鼠均飼養于標準環境，溫度維持在22～25℃，濕度維持在55%～60％，12h光照黑暗循環，通風良好，飼料和飲用水自由采食。

1.2 主要試劑

甘草多糖為本實驗室從甘草中提取，多糖含量為85.88%^[11]；LPS購自Sigma公司；地塞米松（DEX）、蘇木精-伊紅染色液、PMSF和RIPA裂解液、BCA蛋白測定試劑盒均購自北京索萊寶公司；小鼠睪酮（testosterone，T）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自武漢賽維爾生物有限公司；總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；qRT-PCR試劑盒購自大連TaKaRa公司；Anti-NLRP3抗體（Cat No.68102-1-Ig）、Anti-IL-18抗體（Cat No.10663-1-AP）、Anti-IL-1β抗體（Cat No.29530-1-AP）、Anti-GSDMD抗體（Cat No.20770-1-AP），山羊抗鼠IgG二抗（Cat No.SA00001-1），山羊抗兔IgG二抗（Cat No.SA00001-2）購自武漢三鷹生物技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組、造模及給藥

60只8周齡雄性C57BL/6J小鼠，適應實驗室環境1周后，將所有小鼠隨機分為6組（每組10只小鼠）：空白對照組（C）、模型組（LPS，0.5mg·kg^-1）、GPS低劑量組（GPS-L，100mg·kg^-1）、GPS中劑量組（GPS-M，200mg·kg^-1）、GPS高劑量組（GPS-H，400mg·kg^-1）、地塞米松組（DXM，5mg·kg^-1）。GPS低、中、高劑量組連續20d每日根據體重灌胃給予100、200、400mg·kg^-1的甘草多糖，空白對照組、模型組、地塞米松組灌胃給予同等體積的生理鹽水。第21天，除空白對照組外，其余各組腹腔注射5mg·kg^-1的LPS，空白對照組給予等體積的生理鹽水。2h后，地塞米松組灌胃給予5mg·kg^-1的地塞米松；12h后，按照動物倫理學標準處死小鼠，收集小鼠血液及睪丸組織。睪丸炎模型設置參考Pan等^[12]和張逢等^[13]的研究，GPS設置參考本實驗室前期研究^[11]，DXM陽性對照組中，地塞米松是一種激素類藥物，其設置參考趙欣等^[14]的研究。

1.3.2 睪丸組織形態學觀察

將收集的睪丸組織迅速固定于波恩氏液中，24h后流水沖洗過夜，梯度酒精脫水，二甲苯透明，并將組織包埋于石蠟中。修石蠟塊至合適形狀，并在切片機上切成5μm的切片，用蘇木精和伊紅（HE）染色，然后在光學顯微鏡下觀察拍照。

1.3.3 競爭性酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測血清中T、LDH的含量

將收集到的血液3000r·min^-1條件下離心勻漿10min，取上清液。按照ELISA試劑盒說明書檢測血清中T、LDH的含量。

1.3.4 睪丸組織中T-SOD、CAT、GSH含量的測定

將睪丸組織剪碎，根據質量體積比1∶9加入適量的PBS勻漿組織，4℃3000r·min^-1條件下離心勻漿組織液10min，取上清液。根據南京建成試劑盒說明書測定睪丸勻漿組織上清液中T-SOD、CAT、GSH的含量。

1.3.5 實時熒光定量PCR法（qRT-PCR）測定mRNA相對表達含量

采用qRT-PCR法檢測睪丸組織中炎癥因子（IL-18、IL-1β、IL-6、TNF-α）、緊密連接蛋白（Occludin、ZO-1）及細胞焦亡關鍵因子（caspase-1、NLRP3、GSDMD）mRNA表達變化。用Trizol法提取睪丸組織中總RNA，用Nanodrop2000分光光度計檢測RNA濃度及質量，將RNA反轉錄為cDNA，以cDNA為模板，運用TaKaRa試劑盒，在95℃15s，95℃10s、60℃30s、40個循環，72℃15s條件下進行實時熒光定量PCR反應。目的基因的表達以β-actin為內參，用2^-ΔΔCt法進行計算。引物用Primer3.0Plus設計，由生工生物工程有限公司合成，具體序列見表1。

1.3.6 Western blot法測定細胞焦亡相關因子蛋白表達相對變化

用Western blot法檢測空白對照組、模型組、GPS-H組細胞焦亡相關因子（NLRP3、GSDMD、IL-18、IL-1β）蛋白表達水平變化。用含有PMSF的RIPA裂解液裂解睪丸組織，BCA法測定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉膜，封閉，一抗（NLRP3、GSDMD、IL-18、IL-1β抗體）4℃孵育過夜，TBST清洗，二抗（山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG）孵育，TBST清洗，ECL顯色液成像，最后用AlphaView軟件對蛋白條帶進行分析。

1.3.7 數據統計學分析

數據用“x-±s”來表示，所有處理重復3～6次。試驗數據運用GraphPad Prism5軟件進行統計及顯著性分析，運用單因素方差分析法比較組間差異。與空白對照組比較，#.Plt;0.05，##.Plt;0.01，###.Plt;0.001; 與模型組比較，*.Plt;0.05，**.Plt;0.01，***.Plt;0.001。

2 結 果

2.1 睪丸組織形態學變化

如圖1所示，空白對照組生精小管排列緊密整齊，有大量的生精細胞及精子；模型組和GPS低劑量組生精小管間距較大，管腔有細胞脫落，曲細精管里生殖細胞排列松散，精子數量較少，生精上皮空泡

化；GPS中劑量組曲細精管里生殖細胞排列松散，GPS高劑量組與地塞米松組生精小管排列緊密，曲細精管中生殖細胞排列整齊。與空白對照組相比，模型組生精小管間距增大，生精上皮有空泡化現象；GPS低劑量組生精小管間距較模型組有所減小，但相比對照組仍有較大間距，生精上皮空泡化仍有出現；GPS中、高劑量組較模型組生精小管排列緊密，未見出現生精上皮空泡化現象，GPS中劑量組曲細精管里生殖細胞排列稍有松散。表明GPS可以緩解LPS誘導的睪丸組織結構損傷，其中，GPS高劑量組緩解作用最為顯著。

2.2 睪酮激素含量變化

如圖2所示，與空白對照組相比，模型組小鼠血清睪酮水平顯著下降（Plt;0.01）；與模型組相比，GPS低、中、高劑量組小鼠血清睪酮水平有不同程度的提升，且呈劑量依賴性，并在中、高劑量組顯著升高（Plt;0.05，Plt;0.01），提示GPS可以緩解LPS誘導的睪丸損傷。

2.3 睪丸組織中T-SOD、CAT、GSH含量的測定

如圖3所示，與空白對照組相比，模型組小鼠睪丸組織中T-SOD活力、CAT活力，GSH含量顯著下降（Plt;0.01）；與模型組相比，GPS低、中、高劑量組小鼠睪丸組織中T-SOD活力、CAT活力和GSH含量都升高，其中，T-SOD活力和CAT活力在高劑量組升高最顯著（Plt;0.001，Plt;0.05），GSH含量在GPS中、高劑量組都升高顯著（Plt;0.05，Plt;0.01），表明GPS可以緩解LPS誘導的睪丸組織氧化損傷。

2.4 睪丸組織中炎癥因子表達變化

如圖4所示，與空白對照組相比，模型組小鼠睪丸組織中IL-18、IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表達量都顯著上升（Plt;0.01）；與模型組相比，IL-18、IL-1β、IL-6mRNA表達量在GPS低劑量組有所降低，但沒有統計學顯著性，在GPS中、高劑量組顯著降低（Plt;0.05，Plt;0.01，Plt;0.001），TNF-α mRNA表達量在GPS低、中、高劑量組都降低，在GPS高劑量中顯著降低（Plt;0.01），表明GPS可以顯著緩解LPS誘導的睪丸組織炎癥損傷。

2.5 睪丸組織中緊密連接相關因子mRNA的表達

如圖5所示，與空白對照組相比，模型組小鼠睪丸組織中Occludin、ZO-1mRNA表達量顯著降低（Plt;0.001，Plt;0.01）；與模型組相比，GPS3個組Occludin、ZO-1mRNA表達量呈劑量依賴性升高，其中，中劑量組、高劑量組升高顯著（Plt;0.05，Plt;0.01，Plt;0.001），表明GPS可以顯著緩解LPS誘導的睪丸組織緊密連接損傷。

2.6 甘草多糖對LPS誘導的睪丸組織細胞焦亡的影響

如圖6A～C所示，與空白對照組相比，模型組小鼠睪丸組織中NLRP3、caspase-1、GSDMD mRNA表達量均顯著上調（Plt;0.05，Plt;0.01），提示LPS誘導小鼠睪丸組織發生細胞焦亡；與模型組相比，GPS組NLRP3、caspase-1、GSDMD mRNA表達量呈劑量依賴性降低，其中，GPS中劑量組caspase1mRNA表達量顯著下調（Plt;0.05），GPS高劑量組NLRP3、caspase-1、GSDMD mRNA表達量均顯著下調（Plt;0.05，Plt;0.01），表明GPS可以顯著緩解LPS誘導的睪丸組織細胞焦亡發生。

如圖6D所示，模型組小鼠睪丸組織上清液中LDH水平較空白對照組顯著升高（Plt;0.05），GPS低、中劑量組LDH水平較模型組有所降低（Pgt;0.05），高劑量組顯著降低（Plt;0.01），表明LPS可以破壞小鼠睪丸組織細胞膜的完整性，而GPS可以緩解LPS誘導的細胞膜完整性受損。

根據圖6A～D結果，細胞焦亡相關因子的蛋白表達情況只在空白對照組、模型組、GPS高劑量組中進行了檢測（圖6E～I）。如圖所示，相比空白對照組，NLRP3、GSDMD、IL-18及IL-1β蛋白表達水平在模型組均顯著升高（Plt;0.001）；相比模型組，NLRP3、GSDMD、IL-18及IL-1β蛋白表達水平在GPS高劑量組表達均顯著降低（Plt;0.05，Plt;0.01），進一步證實LPS可以誘導小鼠睪丸組織發生細胞焦亡，而GPS高劑量組可以緩解小鼠睪丸組織細胞焦亡的發生。

3 討 論

睪丸是雄性最為重要的生殖器官，是精子發生和雄激素生成的主要場所。睪丸炎可破壞睪丸的組織結構與功能，甚至導致不育^[15]。Shen等^[16]的研究顯示，腹腔注射LPS誘導的急性全身炎癥中，雄性生殖能力和睪丸激素水平顯著下降，精子發生受損。張逢等^[13]的研究表明，LPS可通過炎癥反應誘導小鼠睪丸損傷。本研究結果顯示，LPS處理使睪丸組織生精小管間距增大，管腔細胞脫落，曲細精管里生殖細胞排列松散，精子數量減少，生精上皮空泡化；同時雄激素睪酮水平顯著降低，促炎因子IL-18、IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達顯著上升，表明LPS誘導了小鼠睪丸炎癥，損傷了睪丸組織的結構和功能。劉陽等^[17]發現，甘草對醋酸鉛引起的小鼠雄性生殖細胞遺傳損傷有防護作用。Huang等^[18]的研究顯示，甘草多糖可以緩解右旋糖酐硫酸鈉（DSS）誘導的潰瘍性結腸炎，Zhao等^[8]發現，GPS可以降低肉雞下丘腦中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達水平。本試驗中，GPS處理后因LPS誘導產生的睪丸組織結構損傷得到較大改善，尤其是GPS高劑量組作用后，生精小管排列緊密，曲細精管里生殖細胞排列整齊，基本恢復到對照組水平；血清中睪酮水平呈劑量依賴性上升，促炎因子mRNA的表達量在GPS中、高劑量組也顯著降低，表明GPS可以顯著緩解LPS誘導的睪丸炎癥，增加睪酮水平，調節睪丸組織結構損傷，與前人研究結果一致。

正常情況下，機體氧化與抗氧化系統處于動態平衡，當機體受到刺激時，會產生強氧化自由基，使機體氧化與抗氧化系統失衡。機體氧化與抗氧化系統失衡與雄性生殖損傷息息相關^[19]。LPS可誘導機體產生氧化應激^[20]，Kumar等^[21]的研究顯示，LPS可誘導睪丸發生氧化應激，降低CAT、SOD水平。GPS具有抗氧化功能^[22]，可清除DPPH·、ABTS+·自由基，顯著提高SOD、CAT、GSH水平，降低丙二醛（MDA）含量，調節鼠傷寒沙門菌誘導的巨噬細胞氧化-抗氧化平衡紊亂^[23]。本試驗中，LPS顯著降低了睪丸組織中SOD、CAT、GSH水平，GPS處理后SOD、CAT、GSH水平顯著升高，提示GPS可以緩解LPS誘導的睪丸氧化損傷。

緊密連接是細胞之間相互連接的一種重要方式。睪丸支持細胞間緊密連接受損，將破壞血睪屏障，進而導致精子微環境紊亂，引起雄性生殖障礙^[24]。LPS處理會損傷支持細胞間的緊密連接^[25]，破壞血睪屏障^[12]，損傷睪丸正常功能。甘草提取物可以增加結腸緊密連接蛋白的表達，緩解DSS誘導的結腸屏障損傷^[26]。Occludin和ZO-1是常見的緊密連接蛋白，本試驗中，LPS顯著下調了Occludin、ZO-1mRNA的表達，GPS中、高劑量組顯著上調了LPS導致的Occludin、ZO-1mRNA表達下調，保護了睪丸組織緊密連接屏障的完整性。

細胞焦亡，是一種促炎形式的程序性細胞死亡^[27]。研究顯示，LPS可誘導肺組織^[28]、H9C2心肌細胞^[29]、人牙齦成纖維細胞^[30]等發生細胞焦亡，本試驗中，LPS上調了NLRP3、Caspase-1、GSDMD的mRNA表達水平，并增加了血清LDH水平，表明LPS誘導睪丸組織發生了細胞焦亡；GPS組呈劑量依賴性下調了NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA表達水平，其中，GPS高劑量組下調顯著，并減少了NLRP3、GSDMD、IL-18、IL-1β蛋白表達水平，降低了血清LDH水平，表明GPS抑制了LPS誘導的睪丸組織細胞焦亡。喻浩恒^[31]的研究顯示，甘草的主要有效成分之一甘草苷可抑制小膠質細胞發生細胞焦亡，與本試驗結果基本一致。

4 結 論

GPS有效緩解LPS誘導的睪丸組織結構損傷，增加血清睪酮含量，降低促炎因子IL-18、IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達，提高睪丸組織中SOD、CAT、GSH水平，增加緊密連接因子Occludin、ZO-1mRNA表達，下調NLRP3、caspase-1、GSDMD mRNA水平，降低血清LDH含量，減少NLRP3、GSDMD、IL-18、IL-1β蛋白表達水平，表明GPS可以有效緩解LPS誘導的睪丸炎損傷，其作用機制可能與改善睪丸組織氧化損傷，抑制細胞焦亡，阻止炎癥反應相關。

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（編輯 白永平）