屢配不孕母牛FOXP3、FSHR、FMR1基因多態性與生殖激素相關性分析

摘 要：旨在研究叉頭框蛋白P3基因（forkhead box protein P3，FOXP3）、促卵泡激素受體基因（follicle stimulating hormone receptor，FSHR）、智力低下1基因（fragile Xmental retardation1，FMR1）的多態性，并探討了基因多態性對母牛屢配不孕以及母牛激素水平的影響。通過PCR方法擴增基因突變位點的序列，對PCR結果進行酶切鑒定和測序峰圖分析，統計三種基因的基因型。分析三種基因突變的組間差異。使用ELISA法檢測兩組雌激素（estrogen，E）、促卵泡激素（follicle-stimulating hormone，FSH）、催乳素（prolactin，PRL）、睪酮素（testosterone，T）、促黃體生成素（luteinizing hormone，LH）激素濃度。并將基因多態性與激素水平進行關聯分析。FOXP3基因檢測出3種基因型：AA、AG和GG型；FSHR基因檢測出3種基因型：AA、AC和CC型；FMR1基因5′UTR端302bp處檢測到T堿基插入。卡方適應性檢驗結果表明，FOXP3基因g.92，377，635Agt;G位點、FSHR基因g.31，450，279Agt;C位點均低于哈代-溫伯格平衡狀態（Plt;0.05）。關聯性分析表明，FOXP3基因G等位基因、FSHR基因C等位基因與母牛屢配不孕顯著正相關性。屢配不孕組E、FSH、PRL、T激素與健康母牛組差異顯著（Plt;0.05）。FOXP3基因AA、GG基因型E激素濃度與AG基因型差異顯著（Plt;0.05）；FSHR基因AA、AC基因型E激素濃度與CC基因型差異顯著（Plt;0.05）。FOXP3基因、FSHR基因在西門塔爾牛、褐牛及安格斯牛群體中具有多態性，這說明基因可能是影響母牛屢配不孕的潛在遺傳因素。其中，FOXP3基因G等位基因在健康組與屢配不孕組中差異顯著（Plt;0.05），FSHR基因C等位基因在健康組與屢配不孕組中差異顯著（Plt;0.05）。FOXP3基因的g.92，377，635Agt;G位點G等位基因與母牛患屢配不孕疾病呈顯著正相關（Plt;0.05，r=0.16），FSHR基因的g.31，450，279Agt;C位點C等位基因與母牛屢配不孕具有顯著正相關性（Plt;0.05，r=0.14）。FOXP3基因以及FSHR基因的多態性位點可能作為母牛屢配不孕的標志性識別位點，可用于篩選屢配不孕母牛的潛在候選遺傳標記，這需要進一步的證明。FOXP3基因G等位基因與E濃度呈弱正相關（Plt;0.05，r=0.16），FMR1基因T堿基的插入與E濃度呈弱正相關（Plt;0.05，r=0.187）。然而FOXP3基因、FSHR基因的變異如何調控母牛繁殖能力還需進一步研究證實。

關鍵詞：牛；屢配不孕；基因多態性；激素；關聯分析

中圖分類號：S857.22

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）06-2727-14

收稿日期：2023-08-10

基金項目：新疆維吾爾自治區科技成果轉化示范專項--鄉村振興產業發展科技行動項目（2022NC098）

作者簡介：王選藝（1998-），女，新疆五家渠人，碩士生，主要從事動物生長發育與繁殖疾病研究，E-mail：1020877416@qq.com；Tel：13109015778

*通信作者：孫亞偉，主要從事動物形態學及家畜肌肉生長發育研究，E-mail：sunyawei2008@163.com

Correlation Analysis of FOXP3，FSHR，FMR1Gene Polymorphisms and

Reproductive Hormones in Infertile Cows

WANGXuanyi，SUNYawei^*，LONGYuwei，WANGLiying，ZHOUYuxin，

LINa，MAXuelian，ZHAOHongqiong，YAOGang

（College of Animal Medicine，Xinjiang Agricultural University，Urumqi830052，China）

Abstract：The polymorphisms of forkhead box protein P3（FOXP3），follicle stimulating hormone receptor（FSHR）and fragile Xmental retardation1（FMR1）were studied，and the effects of gene polymorphisms on infertility and hormone levels in cows were discussed.（Method）The sequence of the gene mutation site was amplified by PCR，and the PCR results were identified by enzyme digestion and sequencing peak analysis，and the genotypes of the three genes were counted.The intergroup differences in the mutations of the three genes were analyzed.The concentrations of estrogen（E），follicle-stimulating hormone（FSH），prolactin（PRL），testosterone（T）and luteinizing hormone（LH）in the two groups were detected by ELISA.The correlation between gene polymorphism and hormone level was analyzed.Three genotypes of FOXP3gene were detected：AA，AG and GG; three genotypes of FSHR gene were detected：AA，AC and CC; T base insertion was detected at302bp of5′UTR of FMR1gene.The results of chi-square adaptability test showed that the92377635Agt;G loci of FOXP3gene and the31450279Agt;C loci of FSHR gene were lower than Hardy-Weinberg equilibrium（Plt;0.05）.Correlation analysis showed that FOXP3gene Gallele and FSHR gene Callele were significantly positively correlated with repeated infertility in cows.There were significant differences in E，FSH，PRL and Thormones between the infertile group and the healthy mother group（Plt;0.05）.The Ehormone concentration of FOXP3AA and GG genotypes was significantly different from that of AG genotype（Plt;0.05）.FSHR gene AA，AC genotype Ehormone concentration was significantly different from CC genotype（Plt;0.05）.（concentration）was significantly different from AG genotype（Plt;0.05）; FSHR gene31450279Agt;C locus AA，AC genotype Ehormone content（concentration）FOXP3gene and FSHR gene are polymorphic in Simmental，Brown and Angus populations，which indicates that the gene may be apotential genetic factor affecting the infertility of cows.The Gallele of FOXP3gene was significantly different between the healthy group and the multiple infertility group（Plt;0.05），and the Callele of FSHR gene was significantly different between the healthy group and the multiple infertility group（Plt;0.05）.The Gallele of g.92377635Agt;G locus of FOXP3gene was significantly positively correlated with multiple infertility in cows（the Callele of PC locus was significantly positively correlated with multiple infertility in cows（Plt;0.05，r=0.14）.The polymorphism sites of FOXP3gene and FSHR gene may be used as the marker identification sites of repeated mating infertility in cows，which can be used to screen the potential candidate genetic markers of repeated mating infertility cows，which needs further proof.The Gallele of FOXP3gene was weakly positively correlated with Econcentration（Plt;0.05，r=0.16），and the Tbase insertion of FMR1gene was weakly positively correlated with Econcentration（Plt;0.05，r=0.187）.However，how the variation of FOXP3gene and FSHR gene regulates the reproductive ability of cows needs further study.

Key words：cattle; infertility cows; gene polymorphism; hormone; relevance analysis

*Corresponding author：SUN Yawei，E-mail：sunyawei2008@163.com

繁殖母牛的屢配不孕疾病嚴重損害牛養殖業的經濟效益。據報道，引起繁育率降低的原因中，屢配不孕占53.06^[1]，在導致牛淘汰的疾病中，屢次配種不孕的比例達到了40%，因屢配不孕造成的經濟損失占總損失的57.6%^[2]。屢配不孕是指發情周期及發情期正常，臨床檢查沒有明顯癥狀，在連續3個發情周期配種3次及以上不受孕即為屢配不孕^[3]。動情行為、激素模式和卵巢動力學之間微妙的相互作用還有基因的表達都可能影響母牛屢配不孕。這些因素最終決定交配或人工授精的結果。有學者發現部分基因的功能和表達可能與牛的繁殖性能相關^[4]。過往研究發現FOXP3基因^[5]、FSHR基因^[6]、FMR1基因^[7]的變異很大概率上會導致母牛屢配不孕。FMR1基因被發現當其5′端非編碼區發生突變時會導致其發生屢配不孕^[5]。FOXP3基因上游區域的SNP可能影響FOXP3啟動子的活性^[6]。有學者研究FSHR基因多態性發現其10號外顯子區域有一個SNP位點，該位點有3個基因型：CG基因型妊娠率為66%，GG基因型妊娠率為58%，CC基因型妊娠率為64%^[7]。然而，FSHR基因多態性對不同品種間妊娠率的影響尚未建立^[8]。基因與屢配不孕之間的關系逐漸引起了注意。然而，想要從遺傳角度上解決問題應該關注到屢配不孕與染色體基因異常的關系^[9]。

母牛在發情期間，雌激素濃度上升，子宮內膜增厚，為受精卵提供營養和生長環境^[10-11]。如果母牛的激素水平異常，可能會影響卵泡的發育和排卵，從而導致配種不成功^[12]。如果繁殖母牛患有卵巢囊腫^[13-14]、子宮內膜炎^[15-17]等疾病，可能導致屢配不孕。屢配不孕治療的方法常用激素來治療，在屢配不孕治療手段中激素刺激是較為常用的，對屢配不孕母牛使用激素刺激可使其卵巢的活動恢復^[18]，提高母牛繁殖力^[19]。因此，母牛屢配不孕可能與激素濃度相關。及時關注繁殖母牛激素水平的變化，可以提高母牛的繁殖能力。

許多基因參與編碼信號轉導和卵巢發育的蛋白質^[18]。一些基因變異可能會影響母牛的生殖器官發育或功能，從而影響母牛繁殖能力^[19]。在母牛生殖器官發育或功能被影響時其激素水平也會發生相應的改變。所以母牛屢配不孕的基因變異可能與其部分激素水平變化有相關性。

本試驗以不同品種母牛為研究對象，探究不利于母牛繁殖的基因多態性位點，從而篩選出存在屢配不孕風險的母牛。并用ELISA法檢測雌激素（estrogen，E）、促卵泡激素（follicle-stimulating hormone，FSH）、催乳素（prolactin，PRL）、睪酮素（testosterone，T）、促黃體生成素（luteinizing hormone，LH）在血清中濃度。探究母牛屢配不孕與其激素水平的相關性，以及導致母牛屢配不孕的基因變異與生殖激素水平變化的相關性。為提高母牛繁殖能力提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

試驗動物為在新疆不同牛場采集的褐牛、西門塔爾牛、安格斯牛，按其配種與受孕情況分為屢配不孕組和健康對照組，屢配不孕組母牛均為經過牛場具有豐富經驗的獸醫檢查篩選過的無解剖學異常的；沒有感染的；連續3個發情周期及其以上配種但沒有受孕的母牛。健康組為同一時期，同一營養及環境下的配種1或2次能夠正常受孕的母牛。在健康組母牛產后對兩組母牛進行同期發情處理，每次注射氯前列醇鈉注射液3mL·頭^-1（0.1mg·mL^-1），注射3次，注射后第（13±3）天內使用EDTA抗凝管采集兩組母牛新鮮血液及血清并立即放入-20℃保存備用。試驗動物中褐牛共63頭，其中，屢配不孕組31頭，健康組32頭；西門塔爾牛共54頭，其中，屢配不孕組35頭，健康19頭；安格斯牛共50頭，其中，屢配不孕組29頭，健康21頭。共采集167份樣本。

1.1.2 主要試劑及儀器

紅細胞裂解液的制備：碳酸氫鉀（KHCO₃）1.0g；氯化氨（NH₄Cl）8.3g；EDTA-Na₂0.037g，加雙蒸水定容至1000mL。白細胞裂解液的制備：0.2422g Tris溶于蒸餾水中，調節其pH為8.0，然后加入0.149g EDTA和0.16g SDS。10%SDS的制備：稱取10g SDS融于60mL高壓滅菌蒸餾水中，混合液置于水浴鍋中65 ℃加熱助融10min，定容至100mL。蛋白酶K的制備：蛋白酶K100mg；Tris（10mmol·L^-1）10mL在冰盒上混勻后保存在-20 ℃。酚氯仿異戊醇混合液：25mL飽和酚試劑；24mL三氯甲烷；1mL異戊醇混勻。酚氯仿混合液：25mL飽和酚試劑；25mL三氯甲烷混勻；高GC含量PCR擴增試劑盒（B639283-0001）、DNA分子量標準Maker A（25～500bp）（B600303）購自上海生物技術有限公司提供。

牛促卵泡素（FSH）試劑盒（貨號：JYM0055Bo；生產批次GR20230210），牛催乳素（PRL）試劑盒（貨號：JYM0095Bo；生產批次：GR20230210），牛睪酮（T）試劑盒（貨號：JYM0282Bo；生產批次：GR20230210），牛促黃體激素（LH）試劑盒（貨號：JYM0054Bo；生產批次：GR20230210），牛雌激素（E）試劑盒（貨號：JYM0045Bo；生產批次：GR20230210）均購自武漢基因美生物科技有限公司。

主要儀器：Eppendorf離心機、NanoDrop2000微量分光光度計、Tanon-2500凝膠成像系統、ST-360KHB酶標儀。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取

采用《分子克隆實驗指南》的酚氯仿法提取DNA^[20]，并使用紫外分光光度計檢測所提取DNA的濃度與光密度比值（OD_260nm/OD_280nm），提取后使用0.7%瓊脂糖凝膠檢測DNA特異性與完整性。

1.2.2 位點信息及引物合成

參考NCBI提供的牛（Bos taurus；登錄號：NC_037 357.1）FOXP3、FSHR和FMR1基因序列號，根據過往研究結果確定FOXP3基因與屢配不孕母牛相關的SNP位點存在于5′UTR區域上游（NC_037 357.1：g.92，377，635Agt;G，rs135720414）、FSHR基因10號外顯子區域、FMR1基因變異區在5′UTR區域。利用軟件Prime5設計特異性PCR引物（表1）擴增FOXP3基因g.92，377，635Agt;G、FSHR基因10號外顯子、FMR1基因5′UTR端。引物由上海生物工程股份有限公司合成。

1.2.3 基因分型

FOXP3基因、FMR1基因擴增DNA片段由上海生物有限公司測序，測序結果利用Snpgene軟件進行基因型分析。FSHR基因利用AulⅠ限制性內切酶酶切，將酶切產物在3.5%的瓊脂糖凝膠中檢測酶切結果，通過酶切結果結合測序峰圖分析其基因型。

1.2.4 激素水平檢測

使用ELISA法檢測健康組與屢配不孕組的E、FSH、PRL、T和LH濃度^[21]。

1.2.5 數據分析

通過Excle2019計算基因SNP位點的基因頻率、基因型頻率、純和度（homozygosity，Ho）、雜合度（heterozygosity，He）、有效等位基因數（effectively allele number，Ne）。通過χ²檢驗FOXP3基因在群體中是否處于Hardy-Weinberg平衡狀態。通過多態信息含量（polymorphic information content，PIC）檢測基因的變異程度，其中，PIClt;0.05表示為低度多態性；0.05lt;PIClt;0.50表示為中度多態性；PICgt;0.50表示為高度多態性。利用SPSS25.0軟件對健康組和屢配不孕組母牛基因型進行秩和檢驗。激素結果用“平均值±標準誤（x-±s_x-）”表示，對健康組與屢配不孕牛組的各生殖激素濃度進行差異分析。最后將基因變異情況與激素水平進行相關性分析。

2 結 果

2.1 DNA提取

0.7%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA帶型清晰可見，表明總DNA無降解（圖1）。提取的總DNA經紫外分光光度計測定后260與280nm的吸光值之比均在1.75～2.00，表明提取的總DNA符合后續試驗要求。

2.2 FOXP3基因

2.2.1 FOXP3基因PCR擴增結果

PCR擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖2所示，引物擴增片段為618bp左右，與預期片段大小相符，且無雜帶。

2.2.2 測序驗證

測序結果經snpgene軟件分析發現，FOXP3基因在g.92，377，635Agt;G存在一處突變，測序峰圖可分為3種基因型：AA、AG、GG。峰圖如圖3。

2.2.3 基因位點分型及多態性分析

通過測序得到FOXP3基因有3種基因型分為AA、AG、GG型，詳見表2，χ²檢驗結果表明，FOXP3基因g.92，377，635Agt;G位點在西門塔爾牛、褐牛群體中處于Hardy-Weinberg平衡狀態；安格斯牛群體偏離Hardy-Weinberg平衡狀態。該基因多態信息含量為0.33，屬于中度多態；純和度、雜合度及有效等位基因數詳見表3。

2.2.4 不同品種健康組與屢配不孕組FOXP3基因型差異分析

圖4為不同品種健康組與屢配不孕組基因型頻率分析，其中，圖4a為安格斯牛，圖4c為西門塔爾牛，圖4d為褐牛，圖4b為總計。經過SPSS及Graphpad軟件分析發現：總的來說屢配不孕組FOXP3基因的G基因型頻率顯著高于健康組，如圖4a所示。各品種中：安格斯牛屢配不孕組FOXP3基因的G基因型頻率顯著高于健康組，如圖4d中所示。西門塔爾牛和褐牛未發現有差異。對FOXP3基因G等位基因與母牛屢配不孕情況進行相關性分析得出G等位基因與母牛屢配不孕具有相關性，且G等位基因與母牛患屢配不孕疾病呈弱正相關（Plt;0.05，r=0.16）。

2.3 FSHR基因

2.3.1 FSHR基因PCR擴增結果

PCR擴增產物用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖5所示，產物大小為306bp，與預期片段大小相符，且無雜帶。

2.3.2 酶切分析

將酶切產物在3.5%的瓊脂糖凝膠中檢測酶切結果如圖6，可得到3種基因型：CC、CG、GG型。

2.3.3 測序驗證

測序結果經snpgene軟件分析發現，FSHR基因存在一處突變，通過測序峰圖可分為3種基因型：AA、AC、CC，如圖7所示。

2.3.4 基因位點分型及多態性分析

通過測序得到FSHR基因3個基因型AA、AC、CC（表4）。χ²檢驗結果表明，FSHR基因突變位點在西門塔爾牛、褐牛群體中處于Hardy-Weinberg平衡狀態；安格斯牛群體偏離Hardy-Weinberg平衡狀態。該基因多態信息含量為0.35，屬于中度多態；純和度、雜合度及有效等位基因數見表5。

2.3.5 不同品種健康組與屢配不孕組FSHR基因型差異分析

圖8為不同品種健康組與屢配不孕組母牛基因型頻率分析，總的來說，屢配不孕組FSHR基因的C基因型頻率顯著高于健康組，如圖8a（圖8a為所有品種總計，Plt;0.05）所示。各品種中，安格斯牛（圖8b）屢配不孕組FSHR基因的C基因型頻率顯著高于健康組，且差異極顯著（Plt;0.01）如圖中所示。西門塔爾牛（圖8d）和褐牛（圖8c）未發現有差異。對FSHR基因C等位基因與母牛屢配不孕情況進行相關性分析得出C等位基因與母牛屢配不孕具有相關性，且C等位基因與母牛患屢配不孕疾病呈弱正相關（Plt;0.05，r=0.14）。

2.4 FMR1基因

2.4.1 FMR1基因PCR擴增結果

PCR擴增產物用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖9所示，產物大小為310bp，與預期片段大小相符，且無雜帶。

2.4.2 測序結果

測序結果經snpgene軟件分析發現，FMR1基因存在一處T堿基插入，測序峰圖詳見圖10。

2.4.3 基因位點分型及多態性分析

通過分析發現FMR1基因健康組與屢配不孕組FMR1基因T堿基插入無差異，該基因多態信息含量為0.35，屬于中度多態；純和度、雜合度及有效等位基因數詳見表6。對FMR1基因T堿基的插入與母牛屢配不孕情況進行相關性分析得出T堿基的插入與母牛屢配不孕不具有相關性（Pgt;0.05）。

2.5 激素檢測結果

2.5.1 激素水平標準曲線的繪制

參照E、FSH、PRL、T和LH的ELISA試劑盒說明書繪制其激素的標準曲線，結果如圖11。由標準曲線可知，E（圖11A）、FSH（圖11B）、PRL（圖11C）、T（圖11D）和LH（圖11E）線性回歸曲線的相關系數分別是0.9976、0.9968、0.9973、0.9971和0.9940，均大于試劑盒所提供的相關系數（R²gt;0.92）。本次標準曲線具有良好的線性關系，可用于后續試驗的計算。

2.5.2 兩組生殖激素濃度比較

如圖12可知，健康組E、FSH、PRL、T的濃度含量高于屢配不孕組，且健康組E和FSH激素濃度含量極顯著高于屢配不孕組（Plt;0.01）；健康組T和PRL激素濃度含量顯著高于屢配不孕組（Plt;0.05）；健康組LH激素濃度含量與屢配不孕組差異不顯著（Pgt;0.05）。

2.6 FOXP3、FSHR、FMR1基因多態性與激素濃度關聯分析

已知FOXP3、FSHR、FMR1基因均檢測到了出變異情況。將各基因變異情況與激素水平變化進行關聯分析。由表7可知，牛FOXP3基因g.92377635Agt;G位點AA、GG基因型E激素濃度與AG基因型差異顯著（Plt;0.05），其余激素含量各基因型間差異均不顯著（Pgt;0.05）。FSHR基因g.31450279Agt;C位點AA、AC基因型E激素濃度與CC基因型差異顯著（Plt;0.05），其余激素含量各基因型間差異均不顯著（Pgt;0.05），見表8。FMR1基因5′UTR端302bp處T堿基插入的基因型PRL激素濃度與正常基因型差異顯著（Plt;0.05），其余激素在各基因型間差異均不顯著（Pgt;0.05），見表9。但相關性分析發現FOXP3基因g.92，377，635位點的突變與E濃度無相關性（P=0.347gt;0.05）

3 討 論

繁殖力是決定動物生產效率的重要因素。高效的管理和整體生產對于良好的繁殖性能至關重要，然而，無論規模大小，牛場經濟高低取決于每頭母牛都在合適的正常生理范圍內和最佳的繁殖節律中^[22]。母牛屢配不孕是世界各地乳制品和牛肉行業主要關切的疾病之一，屢配不孕與遺傳、生理、環境和管理因素之間的相互作用有關^[6]。識別遺傳標記和了解母牛生育遺傳機制將有助于選擇具有更好繁殖性能的母牛。

3.1 FOXP3基因

FOXP3基因的g.92，377，635Agt;G位點是最接近母牛屢配不孕的SNP位點^[23]。FOXP3是調節性Treg細胞的線性特異性轉錄因子^[24-25]。母體的Treg細胞在懷孕期間在血液和胎盤中積聚^[26]，切除母體的FOXP3細胞會觸發胎兒特異性效應T細胞的激活，進而導致妊娠丟失^[27]。FOXP3基因上游區域的SNP影響了FOXP3啟動子的活性以及mRNA的表達水平，進而降低母體Treg細胞的分化^[5，27]。因此，Treg細胞數量的減少會觸發胎兒特異性效應器T細胞的激活，從而母牛導致屢配不孕。要闡明FOXP3在屢配不孕中的作用機制，還需要進一步研究FOXP3mRNA在屢配不孕母牛中的表達水平和Treg細胞的數量^[26]。有學者使用RT-qPCR研究了滋養細胞中FOXP3的表達譜，他們的結論是結果表明，FOXP3在滋養層細胞中表達，并且在屢配不孕中減少^[5]。總之，過往研究均提示，位于牛FOXP3基因上游的X連鎖母源單核苷酸多態（NC_037 357.1：g.92，377，635Agt;G，rs135720414），與母牛屢配不孕有關^[25]。關于FOXP3基因多態性與西門塔爾牛、褐牛、安格斯牛屢配不孕及E、FSH、PRL、T和LH激素水平相關分析尚未見報道。本研究擴增FOXP3基因，通過DNA直接測序技術在母牛的FOXP3基因中分別檢測到了rs135720414位點Agt;G突變產生的3種基因型AA、AG、GG，對健康組與屢配不孕組進行檢驗發現兩組基因型有顯著差異（Plt;0.05），卡方檢驗顯示，該位點符合Hardy-Weinberg平衡，遺傳純和度高于雜合度，說明這個位點在該群體種變異程度較小，位點多態信息含量為中度多態（0.25lt;PIClt;0.50），說明該群體具有較為豐富的遺傳基礎，FOXP3基因rs135720414位點不同基因型關于母牛屢配不孕發病情況存在顯著差異。說明FOXP3基因可能可以用于評估母牛的繁殖狀態。

3.2 FSHR基因

FSHR基因位于11號染色體上，由10個外顯子和11個內含子組成，前9個外顯子包含細胞外結構域，第10個外顯子包含跨膜結構域^[28]。在母牛卵巢中表達，并通過與促卵泡激素^[29]結合來發揮作用，以刺激配子發生過程^[30]。在卵巢卵泡發育中發揮重要作用^[31]。FSH是卵巢發生排卵反應的主要因素^[32]。FSHR基因的C和G等位基因與屢配不孕的發生率顯著相關；G等位基因顯著高于C等位基因。以往的研究報道了FSHR位點多態性與母牛屢配不孕發生率之間的關聯^[33]。FSHR基因可作為屢配不孕母牛早期淘汰的標記，避免因屢配不孕母牛遭受經濟損失，從而實現高效的標記輔助選擇^[17]。關于FSHR基因多態性與西門塔爾牛、褐牛、安格斯牛屢配不孕及E、FSH、PRL、T和LH激素水平相關性尚未見報道。本研究擴增FSHR基因，通過DNA直接測序技術在母牛的FSHR基因中檢測到1個SNP位點突變產生的3種基因型AA、AC、CC，對健康組與屢配不孕組進行分析發現兩組基因型有顯著差異，卡方檢驗顯示該位點符合Hardy-Weinberg平衡，遺傳純和度高于雜合度，說明這個位點在該群體種變異程度較小，位點多態信息含量為中度多態（0.25lt;PIClt;0.5），說明該群體具有較為豐富的遺傳基礎，FSHR基因不同基因型關于母牛屢配不孕發病情況存在顯著差異。說明FSHR基因可能可以用于評估母牛的繁殖狀態。

3.3 FMR1基因

FMR1基因編碼的FMRP，是一種mRNA結合蛋白，在蛋白質翻譯、mRNA運輸和RNA降解中發揮重要作用，FMR1突變導致基因高度甲基化、基因沉默和FMRP不表達，導致屢配不孕的發生^[34]。然而本研究對167頭母牛5′UTR區域的檢測中未檢測到差異顯著的變異情況。分析其原因可能為前人的研究多偏向于以人為研究對象，牛與人基因編碼差異過大，該基因在牛上未表現出變異情況。

3.4 激素水平

生殖激素濃度變化是引起牛屢配不孕的主要因素之一^[35]。近年來，對屢配不孕臨床癥狀的研究很多，但是在內分泌方面的研究相對較少。生殖激素與繁殖有很大的聯系，各生殖激素在繁殖期間不可或缺。E與孕激素（progesterone，P）具有協同作用，有研究表明給切除卵巢的奶牛先注射少量P后再注射E可以引起母牛發情^[36]。FSH激素水平的變化能夠對母牛排卵功能產生影響，長效牛重組卵泡刺激素的使用可以顯著改善卵巢超刺激反應的結果，并提高胚胎的質量和數量^[37]。PRL是一種具有多種生物學功能的腦下垂體激素，PRL是啟動和維持哺乳所必需的^[38]，不僅在哺乳期中起重要作用，而且還調節生殖過程，如PRL已被報道影響生殖性能和細胞凋亡的過程^[39]。關于T激素，已有研究表明T失調會導致綿羊發情周期缺陷和多囊卵巢綜合征發生，影響其繁殖性能^[40]。因此，母牛屢配不孕可能可通與其激素水平相關。本研究中對健康組與屢配不孕牛組的各生殖激素濃度進行兩兩比較發現，健康組與屢配不孕組激素濃度有顯著差異，健康牛E、FSH濃度顯著高于屢配不孕牛，差異極顯著，健康牛PRL、T濃度顯著高于屢配不孕牛；健康牛LH濃度與屢配不孕牛差異不顯著.由此可以推斷E、FSH、PRL、T的濃度對屢配不孕牛有影響。因此及時關注母牛激素水平的變化，可能可以提高母牛的繁殖能力。

3.5 基因多態性與激素水平相關性

馬菀笛等^[41]認為一些基因的變異會導致激素水平的變化，從而導致母牛屢配不孕。FSHR基因變異導致母牛GH、LH、FSH和P4種激素濃度的波動與母牛屢配不孕有一定相關性。PRL調節母體生殖過程，隨著PRL濃度的增加，卵泡數量逐漸減少^[40]。有學者發現PRL濃度與基因變異相關，從而影響母牛屢配不孕。在本研究將FOXP3基因的3種基因型與激素水平進行關聯分析，結果發現，FOXP3基因多態性位點不同基因型對母牛E激素水平存在顯著影響，說明FOXP3基因可能可以通過調控母牛體內E激素水平影響母牛屢配不孕。另外，數據分析結果表明FOXP3基因突變對FSH、PRL、T、LH幾乎沒有影響作用。FSHR基因的3種基因型與部分激素水平進行相關性分析，結果發現FSHR基因不同基因型對母牛E激素水平存在顯著影響，說明FSHR基因可能可以通過調控母牛體內E激素水平影響母牛屢配不孕。FMR1基因5′UTR端302bp處T堿基插入的基因型PRL激素濃度與正常基因型差異顯著。

4 結 論

研究發現FOXP3基因、FSHR基因在西門塔爾牛、褐牛及安格斯牛群體中具有多態性，這說明基因可能是影響母牛屢配不孕的潛在遺傳因素。其中，FOXP3基因G等位基因與母牛屢配不孕具有顯著正相關性，FSHR基因C等位基因與母牛屢配不孕具有顯著正相關性。FMR1基因5′UTR端發現T堿基插入，但與母牛屢配不孕不具有相關性。FOXP3基因的g.92，377，635Agt;G位點以及FSHR基因g.31，450，279Agt;C位點可能能夠作為母牛屢配不孕的標志性識別位點，可用于篩選屢配不孕母牛的潛在候選遺傳標記，這需要進一步的證明。部分激素水平也在健康組與屢配不孕組中表現出明顯的差異，進一步驗證了前人關于激素水平可作為檢測母牛繁殖能力變化的重要指標的研究結果。由相關性分析可知，FOXP3基因G等位基因與E濃度呈弱正相關，FMR1基因T堿基的插入與E濃度呈弱正相關。然而FOXP3基因、FSHR基因的變異如何調控母牛繁殖能力還需進一步研究證實。

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（編輯 白永平）