番茄花葉病毒種傳機制研究及干熱處理效果評價

摘 要：番茄花葉病毒（tomato mosaic virus，ToMV）是世界性分布的病毒，寄主范圍廣泛，番茄是其主要寄主，嚴重影響番茄生產。本研究以帶毒的番茄種子為材料，通過逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測病毒在番茄種子內的定位，采用干熱方法處理種子后檢測番茄種子的萌發率及ToMV的鈍化率，旨在篩選出一個既可以有效鈍化病毒，又不影響番茄種子萌發的處理條件，從源頭上控制該病害的發生和流行。結果發現，ToMV定位于番茄種子的種皮，胚乳及胚中沒有檢測到該病毒的存在。對番茄種子進行干熱處理，與未處理的番茄種子相比，75 ℃處理48 h和70 ℃處理96 h均會顯著影響番茄種子的萌發，80 ℃處理24 h和65 ℃處理120 h對番茄種子的發芽率均沒有顯著影響。4個溫度的恒溫處理均可以有效降低種子攜帶ToMV的數量，但通過熒光定量PCR仍均能檢測到ToMV。80 ℃處理24 h對ToMV的清除效果最好，且不影響番茄種子的發芽率。

關鍵詞：番茄花葉病毒；種傳；干熱處理；發芽率

中圖分類號：S339.3+1 文獻標志碼：A 文章編號：1008-1038（2024）05-0068-05

DOI：10.19590/j.cnki.1008-1038.2024.05.011

Study on the Seed Transmission Mechanism of Tomato Mosaic Virus and Evaluation of the Dry Heat Treatment Effect

QIU Fahui1， SONG Limin1， LIU Leiqing2， LIN Guozuo2， LI Yanhui2， WANG Zhongquan2*， XIA Shilong2*

（1. College of Plant Health amp; Medicine of Qingdao Agricultural University， Qingdao 266109， China;

2. Qingdao Youbaili Agricultural Technology Co.， Ltd， Qingdao 266611， China）

Abstract： Tomato mosaic virus （ToMV） is a globally distributed virus that affects a wide range of hosts， with tomato being its primary host， significantly impacting tomato production. This study aimed to detect the localization of the virus in tomato seeds using RT-PCR. Additionally， it sought to assess the germination rate and ToMV inactivation rate following dry heat treatment， with the goal of identifying treatment conditions that effectively inactivate the virus while preserving the germination capacity of tomato seeds. ToMV was located in the seed coat of tomato seeds， with no detection in the endosperm or embryo. Compared with untreated tomato seeds， dry heat treatment at 75 ℃ for 48 h and 70 ℃ for 96 h significantly affected the germination of tomato seeds， while treatment at 80 ℃ for 24 h and treatment at 65 ℃ for 120 h did not significantly affect the germination rate. Constant temperature treatment at four different temperature effectively reduced the ToMV load in seeds， although the virus remained detectable by fluorescence quantitative PCR. Treatment at 80 ℃ for 24 h exhibited the most effective removal of ToMV without compromising the germination rate of tomato seeds.

Keywords： Tomato mosaic virus; seed transmission; dry heat treatment; germination rate

番茄花葉病毒（tomato mosaic virus，ToMV）為正單鏈RNA病毒，屬帚狀病毒科（Vigaviridae）煙草花葉病毒屬（Tobamovirus）[1]，主要通過汁液摩擦傳播，帶毒的種子及果實是遠距離傳播的主要媒介。該病毒于1909年首次在美國報道，現已成為世界性分布的病毒。ToMV寄主范圍廣泛，番茄是其主要寄主，此外還侵染茄科、禾本科、十字花科、豆科、藜科等許多植物，多種花卉和林木也能受其危害[2-3]。番茄花葉病毒侵染番茄后病株的癥狀受番茄品種、氣候、生育期及栽培管理等因素的影響而不同。常見的癥狀是花葉，苗期侵染會造成植株矮化。另外，在高溫、干旱的條件下，部分番茄莖稈會出現長條狀深褐色壞死斑，果實產生凹陷的深褐色斑塊。危害嚴重的會導致植株枯死，嚴重影響番茄生產[4]。因此，采取有效的處理措施，生產和使用無毒種子，是從源頭上控制該病害發生和蔓延的有效方法。

目前，沒有一種處理能夠完全消除種子中的病毒，能有效減少病毒濃度的種子處理主要有藥劑消毒[5]、鹽酸浸種[6]、臭氧處理[7]、溫湯浸種[8]和干熱處理[9]。干熱處理不僅可以殺死種子表面及內部攜帶的病原真菌和細菌，還可以鈍化種子表面及內部的病毒。Broadbent等[10]發現70 ℃干熱處理種子3 d，可以有效鈍化番茄種子內部的ToMV。孟姍姍等[11]的試驗證明將黃瓜種子于75 ℃處理72 h可有效鈍化黃瓜綠斑駁花葉病毒，同時種子的發芽率不受影響。Rast等[12]研究發現辣椒種子在收獲3個月后于76 ℃干熱處理72 h，雖然可以完全清除其攜帶的辣椒花葉病毒，但是會影響其萌發率。周玉忠等[7]研究發現干熱處理可以有效鈍化番茄種子中的ToMV，發芽率并不受影響。

本研究以帶毒的番茄種子作為材料，通過ELISA和RT-qPCR方法檢測病毒在番茄種子內的定位，采用干熱方法處理種子后檢測番茄的種子的萌發率及ToMV的鈍化率，旨在篩選出一個既可以有效鈍化病毒，又不影響番茄種子萌發的處理條件，從而為帶毒番茄種子的干熱處理提供一定的參考依據，為從源頭控制該病害的發生和流行奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 種子來源和病毒檢測

番茄種子品種為‘Ailsa Craig’，由青島優百粒種子處理設備有限公司提供。健康種子和感染ToMV的種子均通過酶聯免疫吸附（ELISA）和熒光定量PCR（RT-qPCR）進行雙重驗證。

1.2 試劑與儀器

磷酸三鈉分析純，國藥集團化學試劑有限公司；TRI reagent試劑，Sigma-aldrich公司；5× All-in-one RT Mastermix反轉錄試劑盒，abm公司；2× M5 HiPer SYBR Premix EsTaq試劑盒，北京聚合美生物科技有限公司。

解剖鏡，SZ2-ILST，OLYMPUS CORPORATION；PCR儀，T100TM Thermal Cycler，BIO-RAD公司；熒光定量PCR儀，LightCycler？誖96，Roche公司；溫濕雙控干熱處理箱，R-PTH-8580 MF，青島優百粒種子處理設備有限公司。

1.3 ToMV在番茄種子中的定位

番茄種子放在培養皿兩層濕濾紙上保濕1 d，隨后在解剖鏡下用手術刀和鑷子將種子分解為種皮+胚乳和胚。另外取保濕3 d左右的種子，解剖鏡下獲得完整的種皮。將三個部分分別用10%磷酸三鈉溶液漂洗1 min，清除表面可能沾染的病毒，然后用無菌水洗凈。最后通過RT-qPCR檢測ToMV在種子中的定位。

番茄種子各部分組織的RNA的提取用TRI reagent試劑。反轉錄用All in one 5× RT Mastermix試劑盒，具體方法參照試劑盒說明。熒光定量采用2× M5 HiPer SYBR Premix EsTaq試劑盒。反應體系：10 μL M5 HiPer SYBR Premix EsTaq（2X），0.4 μL PCR ToMV-qPCR-F（ACCAGTTTCAAACACAGCAAGCA），0.4 μL PCR ToMV

-qPCR-R（AAATCTGACGGTGCTCTGAGGG）， 2 μL cDNA和7.2 μL RNA-free H2O。擴增程序：95 ℃、30 s；95 ℃、5 s，57 ℃、15 s，72 ℃、20 s，45個循環。結果用2-ΔΔCt法進行分析。Ct值表示擴增產物熒光信號達到設定的熒光閾值時所對應的擴增循環數，通常認為Ct值大于35，結果無意義。

1.4 種子的干熱處理

將番茄種子置于干熱處理設備內將種子分別進行如下四種處理。處理1：80 ℃、24 h；處理2：75 ℃、48 h；處理3：70 ℃、96 h；處理4：65 ℃、120 h，關閉電源，自然降至室溫后取出。每個處理200粒，重復3次。

1.5 種子發芽試驗

取干熱處理前后的種子各100粒置于培養皿中保濕的兩層濾紙上，放入溫室中，25 ℃光照16 h，16 ℃黑暗8 h光暗交替，進行培養。7 d后統計發芽率，并重復3次。發芽率按照公式（1）計算得出。

發芽率/%=×100（1）

1.6 干熱處理效果評價

干熱處理前后的番茄種子各約30粒，提取RNA，通過RT-qPCR檢測種子中的ToMV，具體方法同1.3。本試驗重復3次。

1.7 數據處理

所有數據GraphPad Prism 6進方差分析、多重比較及制圖。

2 結果與分析

2.1 ToMV病毒在番茄種子中的定位

將帶毒的番茄種子分解為種皮、種皮加胚乳和胚，提取各部分組織的總RNA，通過RT-qPCR方法檢測其中的ToMV病毒的含量。結果如表1所示，按照林維石等[13]、張潤書等[14]報道的Ct值的陰性與陽性判斷標準，番茄種子種皮、種皮+胚乳的RT-qPCR結果Ct值均小于30，為陽性，二者差異不顯著，胚的檢測結果Ct值大于35，為陰性。因此認為胚乳中沒有ToMV的存在。

2.2 干熱處理對番茄種子發芽率的影響

對干熱處理前后的番茄種子進行發芽率檢測。如表2所示，與未處理的番茄種子相比，75 ℃處理48 h和70 ℃處理96 h均會顯著影響番茄種子的萌發，80 ℃處理24 h和65 ℃處理120 h對番茄種子的發芽率均沒有顯著影響。

2.3 干熱處理對番茄種子中ToMV的清除效果

對干熱處理前后的番茄種子提取RNA，通過RT-qPCR檢測種子中的ToMV病毒的含量。結果見圖1。

圖1與對照未處理相比，四個溫度的恒溫處理均可以有效降低種子中ToMV的含量，但通過熒光定量PCR仍均能檢測到ToMV。

3 結論

大部分煙草花葉病毒屬的病毒主要定位于種皮和胚乳，如黃瓜綠斑駁花葉病毒（CGMMV）可以侵入種皮、胚乳及外胚乳-胚乳包膜，辣椒輕斑駁病毒（PMMoV）侵染辣椒后辣椒種子的種皮及圍繞胚乳的薄壁細胞和內皮細胞均能檢測到病毒的存在，但胚乳和胚不帶毒[15]。以往研究表明，ToMV主要定位于種皮外，有極少會侵染種皮或胚乳，但胚內沒有檢測到ToMV的存在，胚乳中能否檢測到病毒可能與病毒侵染的時間有關[16-17]。本試驗RT-qPCR結果表明ToMV定位于番茄種子的種皮，胚乳及胚中沒有檢測到該病毒的存在。

Johansen等[18]研究發現18%～20%的植物病毒是通過種子傳播的。病毒在種子中的定位可以分為種皮外、種皮、胚乳和胚。大多數情況下，僅對種子表面進行漂洗不能有效防止病毒通過種子傳播[19]。目前對大部分煙草花葉病毒屬的病毒具有很好清除作用的兩種方法是化學處理和熱處理，如Davino等[20]發現對于定位于種皮和胚乳中的番茄褐色皺紋果病毒（ToBRFV），熱處理和化學處理均能較好地消除ToBRFV，但是在大部分的處理中，ToBRFV仍可通過RT-qPCR檢測到；Kim等[21]發現熱處理可以很好地將定位于種皮和外胚乳-胚乳包膜中的CGMMV清除，Lovelock等[22]發現在土壤中使用消毒劑也能夠很好地鈍化CGMMV。

干熱處理植物種子也能夠有效地鈍化病毒。采用合適的處理溫度和時間來鈍化、殺死種子上的病原菌，但在操作過程中溫度不容易控制，很容易造成出芽率降低。本試驗對番茄種子進行干熱處理，與未處理的番茄種子相比，75 ℃處理48 h和70 ℃處理96 h均會顯著影響番茄種子的萌發，80 ℃處理24 h和65 ℃處理120 h對番茄種子的發芽率均沒有顯著影響；RT-qPCR結果表明四個溫度的恒溫處理均可以有效降低種子攜帶ToMV的數量，但通過熒光定量PCR仍均能檢測到ToMV。因此，以80 ℃處理24 h效果最好。下一步可結合生物學實驗進一步明確熒光定量PCR結果和病毒鈍化效果之間的關系。

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收稿日期：2023-11-28

基金項目：山東省科技型中小企業創新能力提升工程（2021TSGC1237）；青島市科技惠民示范引導專項（22-3-7-xdny-1-nsh）

第一作者簡介：邱發慧（1999—），女，碩士，主要從事分子植物病理學研究工作

*通信作者簡介：王忠全（1979—），男，高級農藝師，主要從事蔬菜種子加工研究工作

夏世龍（1985—）， 男，中級農藝師，碩士，主要從事蔬菜種子加工研究工作