堆肥對煙草黑脛病的防效及作用機理研究

摘要：為明確堆肥對煙草黑脛病的生防效果，進而揭示其抑菌防病機理，以蘑菇渣、滸苔粉、玉米秸稈、凹凸棒和生物炭按照不同組合制備的4種堆肥為研究對象，采用菌絲生長速率法分析堆肥浸提液對煙草黑脛病菌的抑制效果，并進一步通過掃描電鏡觀察菌體超微結構；采用盆栽試驗，考察4種堆肥對煙草黑脛病的防治效果，并從煙草植物防御酶活性、土壤理化性質和土壤酶活性的角度揭示防治機理。結果表明，4種堆肥浸提液原液對病原菌菌絲生長均有明顯的抑制作用，最高抑制率達85.54%，且電鏡結果顯示菌絲體受到嚴重破壞，而高溫滅菌液幾乎無抑制效果。盆栽試驗結果表明，堆肥處理顯著促進了煙株的生長發育，最大葉長、最大葉寬和最大葉面積顯著增加；降低了煙草黑脛病的發生率和病情指數，其中堆肥A（蘑菇渣+滸苔粉+秸稈+凹凸棒）和AB（蘑菇渣+滸苔粉+秸稈+凹凸棒+生物炭）防效可達100%；改善了土壤理化性質和土壤酶活性，有效提高土壤pH值、速效磷含量、速效鉀含量，提升土壤脲酶和酸性磷酸酶活性。綜上所述，堆肥處理可通過抑制病原菌生長、改善土壤理化性質和調節土壤酶活性，有效控制煙草黑脛病的發生。

關鍵詞：堆肥；煙草黑脛病；盆栽試驗；生物防治；作用機理

中圖分類號：S435.72 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）15-0153-07

收稿日期：2023-09-01

基金項目：中國煙草總公司云南省公司重大項目（編號：2023530000241017）。

作者簡介：陳淑童（2001—），女，山東濰坊人，碩士研究生，研究方向為植物病害檢疫與防治研究。E-mail：stchen0531@163.com。

通信作者：沈廣材，男，碩士，助理農藝師，主要從事煙葉生產研究。E-mail：sgczdy910@163.com。

煙草黑脛病是由土傳卵菌寄生疫霉煙草致病變種（Phytophthora parasitica var. nicotianae）引起的維管束病害［1］。該病在眾多煙區均有發生，不僅造成了嚴重的損失且防治難度較大。過去多年中，選育抗病品種、輪作和施用化學殺菌劑等已被廣泛證明其防治的有效性，然而，隨著現代化農業要求升級，這些措施的局限性逐漸顯現，亟待尋求一種更加環保、高效的防治策略［2］。

土壤有機改良可以在目前集約化的耕作制度下，通過有效影響土壤微生物群落結構來提高土壤肥力，進而實現防治病害和改良土壤的雙重功能［3］。作為土壤改良的主要策略之一，堆肥處理不僅可以綠色無害化處理有機廢棄物，還可以防控土傳病害，對于經濟可持續健康發展具有重要意義［4-5］。已有大量研究表明，堆肥及其浸提液可以抑制多種病原真菌和細菌，尤其對土傳病害具有顯著的防治效果［6-9］。未來農業發展需要綜合的策略來幫助防御植物病害，因而堆肥及其浸提液的抗菌防病研究已發展為廢棄物資源化利用以及綠色生態植保等領域的研究熱點。

鑒于此，本研究以蘑菇渣、滸苔粉、玉米秸稈、凹凸棒和生物炭按照不同組合制備的4種堆肥為研究對象，通過體內和體外2種試驗方法揭示其對煙草黑脛病的生防效果，以期為堆肥在植物土傳病害防治方面的研究和應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試堆肥經好氧堆制而成，由中國農業科學院煙草研究所提供。堆肥各處理及成分包括：CK0：蘑菇渣+滸苔粉+玉米秸稈，A：蘑菇渣+滸苔粉+玉米秸稈+凹凸棒，B：蘑菇渣+滸苔粉+玉米秸稈+生物炭，AB：蘑菇渣+滸苔粉+玉米秸稈+凹凸棒+生物炭。4種堆肥的主要理化性質見表1。以不添加堆肥處理為對照（CK）。供試土壤為取自中國農業科學院煙草研究所即墨試驗基地的大田土與育苗基質（質量比為7 ∶3）混合后的土壤，基本理化性質為［10］：pH值 5.26，速效磷含量1.95 mg/kg，速效鉀含量308.44 mg/kg，銨態氮含量239.63 mg/kg，硝態氮含量114.03 mg/kg，有機質含量107.79 g/kg。供試煙草品種為小黃金1025，供試菌株為煙草疫霉（P. nicotianae），均由中國農業科學院煙草研究所提供。供試培養基為燕麥瓊脂（OA）培養基，1 000 mL 反滲透（RO）水加30 g燕麥煮沸20～30 min，雙層紗布過濾得濾液，定容至 1 000 mL，加入18 g瓊脂粉，攪拌均勻后121 ℃高溫滅菌 20 min，轉移至65 ℃烘箱備用。

1.2 試驗設計

1.2.1 堆肥浸提液體外抑菌試驗

取4 g堆肥按 1 ∶5（質量體積比）加入20 mL RO 水置于搖床于 28 ℃ 150 r/min 振蕩12 h后用200目篩絹過濾，得到的濾液即為原液，放置于4 ℃冰箱備用。為同時考慮堆肥中微生物的作用，試驗設計了滅菌處理液：將上述得到的原液取部分置于50 mL錐形瓶中，121 ℃ 滅菌20 min制得滅菌處理液。

抑菌試驗采用菌絲生長速率法［11］。取預先制備好并在65 ℃烘箱中保存的OA培養基10 mL，精確吸取0.1 mL堆肥浸提液加到培養基中，輕輕搖晃混勻后倒入培養皿中。對照采用等量滅菌水代替堆肥浸提液。待培養基凝固后，將煙草黑脛病菌菌餅樣品接入OA板中心，放入28 ℃培養箱中培養，待對照組菌絲長至4/5平板時，用十字交叉法測量菌落直徑，根據以下公式計算抑制率。每個處理設置3個重復。

菌落直徑=測量菌落直徑-0.5 cm；

菌絲生長相對抑制率=對照菌落直徑-處理菌落直徑對照菌落直徑×100%。

1.2.2 盆栽試驗

將堆肥按照2%比例（質量比）與盆栽土混合后，再與菌谷混勻（3 g菌谷，160 g土壤）作為病土。選取生長一致的煙苗傷根處理后移栽至花盆中，每盆1株，置于人工氣候箱中培養。每個處理12株煙苗，重復3次。

1.3 調查內容與方法

1.3.1 掃描電鏡觀察菌絲形態

為了直觀地了解體外抑菌試驗中煙草黑脛病菌的受抑制方式，通過掃描電鏡做進一步觀察。分別在對照組和原液組的菌落邊緣切取若干個體積為0.5 cm3的樣品，置于2.5%戊二醛溶液固定后，將樣品送至青島大學醫學部，對樣品進行鍍膜處理，用于掃描電鏡觀察并獲取照片。

1.3.2 發病情況調查

移栽后，每隔1 d統計發病率和病情指數，并計算防效。煙草黑脛病分級標準見表2。

發病率、病情指數和相對防效計算公式如下：

發病率=發病株數調查總株數×100%；

病情指數=∑（各級病株數×該病級值）調查總株數×最高級值×100；

防效=對照組病情指數-處理組病情指數對照組病情指數×100%。

1.3.3 農藝性狀調查

每個處理選取3株代表性煙株，根據YC/T 142—2010《煙草農藝性狀調查測量方法》標準測定株高、葉片數、最大葉長、最大葉寬及最大葉面積。

1.3.4 植物防御酶活性及丙二醛含量測定

取相同部位的葉片，每個處理取3張，液氮快速冷凍后采用全自動樣品快速研磨儀將葉片磨成粉末，稱取0.1 g左右樣品置于2 mL離心管中，保存在-80 ℃冰箱中待測。超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）活性及丙二醛（MDA）含量均按照試劑盒上的方法測量，試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3.5 土壤理化性質和酶活性的測定

取盆栽土自然風干后過40目篩，測定土壤理化性質，包括pH值（雷磁PHS-3C pH 計）、有機質含量（重鉻酸鉀容量法）、速效鉀含量（NH4OAc浸提-火焰光度計法）以及銨態氮、速效磷含量（SKALAR SAN++連續流動注射分析儀）；測定土壤酶活性，包括土壤酸性磷酸酶（S-ACP）和土壤脲酶（S-UE）。2種酶活性測定均采用試劑盒法，試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.4 數據處理

采用SPSS 25.0 軟件進行差異顯著性檢驗（Duncans 新復極差法，α=0.05），并用Excel 2019進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同堆肥浸提液對煙草黑脛病病原菌的抑制作用

煙草黑脛病病原菌在含有不同處理液的培養基中生長狀況如圖1所示，堆肥浸提液對菌絲生長的抑制作用總結在表3中。不同堆肥浸提液均表現出了相同的抑制規律，即菌絲在原液中生長受到的抑制顯著強于高溫滅菌液；且不同堆肥原液的抑制效果存在差異，其中堆肥AB浸提液的抑制效果最好，抑制率達85.54%。結果表明，堆肥浸提液原液明顯抑制煙草黑脛病菌生長，浸提液經過高溫滅菌處理后，其中含有的微生物被破壞殺死，導致浸提液失去抑制功能，而原液中的微生物可能通過競爭、寄生以及拮抗等作用對煙草黑脛病菌起到抑制效果。

2.2 掃描電鏡分析堆肥浸提液對煙草黑脛病病原菌的抑制方式

結果表明，對照組的菌絲體形態正常、健康飽滿、勻質光滑，菌絲表面沒有明顯的破損、凹陷和干癟等現象（圖2-A）；在堆肥浸提液原液處理下菌絲體發生斷裂，菌絲萎縮、粗細不均，菌絲表面被細菌附著并發生明顯破損（圖2-B），且部分菌絲體扭曲變形、干癟凹陷成片狀，內容物已經基本泄漏（圖2-C）。

2.3 不同堆肥處理對盆栽煙草的防病促生效果

2.3.1 對煙草黑脛病的防控效果

由表4可以看出，與CK相比，施用堆肥降低了煙草黑脛病的發病率及病情指數，對煙草黑脛病具有一定程度的防控效果。堆肥A和AB這2個處理發病率均為0%，防效達100.00%；其他處理出現不同程度的發病，CK0處理發病率較低，為8.33%，較CK降低了85.72%，防效可達84.21%；B處理發病率較CK降低了28.56%，防效為19.30%。可見添加堆肥能有效減輕黑脛病的發生程度，但不同配方的堆肥對煙草黑脛病的控制效果存在一定程度的差異。

2.3.2 對盆栽煙草生長狀況的影響

由表5可知，不同堆肥處理與CK相比，株高和葉片數差異不顯著，但對葉片數的促進作用要強于株高，效果較好的處理為CK0、A和AB，較CK分別提高了28.42%、53.58%和28.42%。堆肥處理后最大葉長、最大葉寬和最大葉面積較CK顯著增加，增幅分別為34.65%～57.35%、25.28%～51.66%和70.15%～138.91%。添加堆肥對煙株的農藝性狀有明顯的改善作用；在各堆肥處理中，以CK0處理的煙株長勢最好，促生效果最為明顯。

2.4 不同堆肥處理對煙株葉片內防御酶活性及丙二醛含量的影響

2.4.1 對SOD活性的影響

SOD被認為是一種重要的自由基清除劑，它能夠維持機體的代謝平衡，并可在植物和病原體之間的識別過程中提供初始抗性信號［12-13］。圖3結果顯示，與CK相比，添加堆肥處理的煙株葉片內SOD活性顯著降低，其中A處理降幅最大，為63.28%；其次為CK0處理和AB處理，分別下降60.57%和38.82%；在各堆肥處理中，B處理SOD活性最高，仍比CK下降24.33%。結合表3中發病率和病情指數數據，推測在CK和B處理中，煙草黑脛病病原菌侵染煙株后導致自由基積累，促使SOD表達用于清除自由基；而CK0、A和AB處理中SOD活性較低，可能由于堆肥很好地抵御了病原菌的入侵，減輕了病菌對煙株的傷害。

2.4.2 對POD活性的影響

POD在植物體內廣泛存在，它能夠促進木質素、植物生長激素和酚類化合物的生成，使細胞壁增厚來抵御病原菌的入侵，是植物抗病有關的防御酶［13-14］。由圖3可知，CK受病原菌脅迫嚴重，POD活性顯著升高，達 2 994.37 U/g；添加堆肥處理的POD活性顯著降低，降幅為62.37%～78.22%，其中A處理POD活性最低，為652.28 U/g，其次為AB處理，POD活性為807.94 U/g，CK0、B處理POD活性分別為 1 126.64、1 045.93 U/g。結合表3，推測出現這類情況的原因與SOD相似，即堆肥通過對病原菌的抑制作用，抵御了病菌入侵煙株。

2.4.3 對MDA含量的影響

MDA是膜脂過氧化的關鍵產物之一，其生成會加重膜的破壞，因此可利用MDA來反映膜脂過氧化的程度，并間接測定膜系統受損程度以及植物的抗逆性［15］。MDA含量越高，說明植物細胞膜質過氧化程度高，從而表明細胞膜受到的傷害越嚴重。圖3結果顯示，未添加堆肥處理的煙株葉片中MDA含量最高，達 5.81 nmol/g，說明CK葉片細胞膜受到的損傷最嚴重；添加堆肥處理的葉片中MDA含量均顯著低于CK，且A處理下MDA含量最低，為3.69 nmol/g，較CK下降了36.49%；CK0、B和AB處理MDA含量較CK分別下降了28.03%、21.94%和17.81%。說明添加堆肥顯著抑制了煙株體內細胞膜脂過氧化過程，減少了細胞受到的傷害。綜合上述指標，可知堆肥A的抗病效果最明顯。

2.5 不同堆肥處理對土壤理化性質及酶活性的影響

2.5.1 對理化性質的影響

從表6可以看出，堆肥處理對土壤理化性質影響顯著。相比CK，堆肥處理土壤pH值和速效鉀含量分別增加6.25%～9.63%和33.93%～62.23%，且2個指標均在AB處理下增幅最大。堆肥處理提升速效磷含量效果明顯，在CK0處理下可提高147.21%。各堆肥處理的有機質含量與CK相比差異不顯著。這也表明堆肥處理下煙株農藝性狀改善與土壤中磷、鉀等營養元素含量升高有關。

2.5.2 對酶活性的影響

土壤磷酸酶是催化土壤有機磷轉化為無機磷的酶類，是評價土壤磷素生物轉化方向和強度的重要指標［16］。由圖4可知，各堆肥處理S-ACP活性均高于CK，分別提高12.45%、2.06%、20.90%、1.11%，主要是由于施用堆肥后積累的大量磷反應底物刺激土壤微生物分泌了較多的酸性磷酸酶［17］。土壤脲酶活性增強能有效促進土壤中的有機氮向無機氮轉化［18］。與CK相比，S-UE 活性在CK0和A處理下分別提高20.78%和19.55%；B處理提高了13.00%。AB處理較CK沒有提高，可能是由于AB堆肥中本身含有大量的銨態氮，含量為829.98 mg/kg。

3 討論與結論

有研究表明，堆肥浸提液中的拮抗微生物通過競爭、寄生、分泌抗生素等方式對病原菌起抑制作用［7］。此外，浸提液中含有的酚類物質、揮發性脂肪酸以及氨等化合物也具有直接毒性，能夠對病原菌產生不利影響［19］。本試驗設置堆肥原液和高溫滅菌液2種處理，可以有效地區分是生物因素還是非生物因素起作用，以便更好地了解堆肥抑菌機理。Koné等的研究也表明，由多種商業堆肥制成的提取液能顯著抑制致病疫霉等多種病原菌的生長，經高溫滅菌后則喪失了抑制效果，本研究結果與之一致，由此推斷堆肥浸提液中含有的微生物是抑制病原菌的先決條件［20］。結合掃描電鏡結果可知，堆肥浸提液中的微生物對煙草黑脛病病原菌的抑制作用具體表現為造成病原菌菌絲變形、斷裂，菌絲壁穿洞引起內含物質泄漏。

本試驗結果顯示，施用堆肥能夠顯著促進煙株的生長和發育，最大葉寬、最大葉長和最大葉面積等農藝指標均顯著增加，說明堆肥對煙株的發育具有很好的促生效果。任小利等關于堆肥對煙草、茄子、番茄等作物的促生增產效果研究也證實此結論：施用堆肥后，堆肥中本身含有的營養物質提高了作物產量形成的能力，且堆肥施用后影響了根際土壤微生物區系，減少了病原菌數量，增加了功能菌數量，從而進一步提高了肥料的利用效率［21-23］。施用堆肥可以有效地防控煙草黑脛病，但不同堆肥的抑制效果存在差異，其中A和AB處理效果最好，CK0次之，B處理最差，可能是由于堆肥B處理中加入的生物炭對土壤微生物的生長產生了不利影響，比如在某些情況下會揮發苯等有毒物質［24-25］。SOD、POD活性與植物抗病性有關，MDA含量反映細胞受損程度。本研究結果表明，施用堆肥后SOD和POD活性均顯著低于CK，說明施加堆肥顯著抑制了土壤中病原菌的生長繁殖，使病原菌無法成為優勢菌，很難遷移到煙株根系完成侵染，煙株沒有受到病原菌損害，故防御酶活性較低；而CK處理的MDA含量最高恰好印證了這一解釋。堆肥的抑病機理不僅體現在為植物生長提供充足的養分和影響微生物群落的構成，還體現在能夠有效地改善植物生長發育的環境條件和土壤的生態環境［26］。本試驗結果表明，堆肥中含有較高的氮、磷、鉀及其他營養元素，能夠明顯提高土壤養分含量，促進煙株的生長，且提高了土壤的pH值，改善土壤酸化程度。施用堆肥后，土壤中酸性磷酸酶和脲酶活性提高，兩者均由參與養分循環的細菌分泌，說明施肥后促進土壤細菌對肥料養分的轉化，張建華等的研究也證明了此觀點［8，27］。本研究有效探討了堆肥防控煙草黑脛病的機制，但添加堆肥對根際土壤微生物多樣性和結構的影響有待進一步探索。

堆肥的施用對防控煙草黑脛病具有良好效果，其機理可以總結為以下幾點：堆肥中含有的微生物嚴重抑制了煙草黑脛病病原菌的生長，使其難以侵染煙株；堆肥的施用改善了土壤理化性質，促進了煙株生長發育，提高了其抗逆境脅迫的能力；堆肥的施用提高了土壤酶活性，促進了肥料轉化，有效提高了煙株的生長速率。在實際應用中，還應考慮堆肥原料復雜性以及病原菌多樣性，從而對土傳病害的綠色防控更有針對性和預見性。

參考文獻：

［1］賈海江，馮俊喜，吳 濤，等. 生物炭菌劑對煙草黑脛病及土壤微生物的影響［J］. 中國煙草科學，2022，43（6）：68-75.

［2］曾舒泉，鈕徐融，魏聰聰，等. 煙草黑脛病拮抗菌HZ15的發酵條件優化［J］. 江西農業學報，2021，33（12）：14-20.

［3］李 淼. 植煙土壤有機改良防控煙草黑脛病的研究［D］. 昆明：云南大學，2020.

［4］林 英，王紀章，趙青松，等. 堆肥對植物土傳病害抑制作用研究進展［J］. 江蘇農業科學，2014，42（12）：168-171.

［5］王 寧，李蕙秀，李 季，等. 堆肥調控作物根際微生物組抑制植物病害的研究進展［J］. 生物技術通報，2022，38（5）：4-12.

［6］Mehta C M，Palni U，Franke-Whittle I H，et al. Compost：its role，mechanism and impact on reducing soil-borne plant diseases［J］. Waste Management，2014，34（3）：607-622.

［7］李欣欣，王秀紅，史向遠，等. 堆肥提取液誘導草莓對黃萎病抗性及抑菌機理研究［J］. 中國生物防治學報，2018，34（2）：294-302.

［8］張建華，郭玉雙，田光明，等. 三種堆肥對番茄生長及青枯病防治效果的影響［J］. 植物營養與肥料學報，2012，18（5）：1185-1192.

［9］譚兆贊，徐廣美，劉可星，等. 不同堆肥對番茄青枯病的防病效果及土壤微生物群落功能多樣性的影響［J］. 華南農業大學學報，2009，30（2）：10-14.

［10］張廣雨，胡志明，褚德朋，等. 生物炭對根際土壤微生態的調控及對煙草青枯病的防控作用［J］. 中國煙草學報，2020，26（6）：81-88.

［11］宋化穩，高德良，徐娜娜，等. 5種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑對蘆筍莖枯病菌的室內毒力及田間藥效評價［J］. 農藥，2019，58（7）：532-534.

［12］董金皋，樊慕貞，韓建民. 蕓薹鏈格孢菌毒素對白菜細胞膜透性、SOD酶和POD酶活性的影響［J］. 植物病理學報，1999，29（2）：138-141.

［13］趙 娜，蔡昆爭，汪國平，等. 家畜堆肥誘導番茄對青枯病的抗性及其生理機制［J］. 農業環境科學學報，2008，27（5）：2058-2063.

［14］余 斌，南運有，孔娜娜，等. 采后UV-C輻照對馬鈴薯干腐病的抑制效應及相關酶活性的影響［J］. 核農學報，2017，31（9）：1730-1736.

［15］喬維川，羅 楊，徐立杰，等. 不同鉀水平對延胡索幼苗的生理特征和鉻吸收影響［J］. 生態環境學報，2018，27（4）：761-768.

［16］Hou E Q，Chen C R，Wen D Z，et al. Phosphatase activity in relation to key litter and soil properties in mature subtropical forests in China［J］. Science of the Total Environment，2015，515/516：83-91.

［17］李 欣，陳小華，顧海蓉，等. 典型農田土壤酶活性分布特征及影響因素分析［J］. 生態環境學報，2021，30（8）：1634-1641.

［18］董齊琪，王海燕，杜 雪，等. 東北低山區典型林分類型土壤脲酶活性特征［J］. 應用與環境生物學報，2023，29（3）：690-695.

［19］Siddiqui Y，Meon S，Ismail M R，et al. Trichoderma-fortified compost extracts for the control of choanephora wet rot in okra production［J］. Crop Protection，2008，27（3/4/5）：385-390.

［20］Koné S B，Dionne A，Tweddell R J，et al. Suppressive effect of non-aerated compost teas on foliar fungal pathogens of tomato［J］. Biological Control，2010，52（2）：167-173.

［21］任小利，王麗萍，徐大兵，等. 菜粕堆肥與無機肥配施對烤煙產量和品質以及土壤微生物的影響［J］. 南京農業大學學報，2012，35（2）：92-98.

［22］黃 炎. 雞糞生物有機肥的研制及其促生防病效果與機制研究［D］. 南京：南京農業大學，2016.

［23］朵金玲. 蚯蚓堆肥菌渣過程中的微生物區系變化及蚓糞的促生和誘導抗病研究［D］. 昆明：云南大學，2019：45.

［24］Zimmerman A R，Gao B，Ahn M Y. Positive and negative carbon mineralization priming effects among a variety of biochar-amended soils［J］. Soil Biology and Biochemistry，2011，43（6）：1169-1179.

［25］Chen J H，Li S H，Liang C F，et al. Response of microbial community structure and function to short-term biochar amendment in an intensively managed bamboo （Phyllostachys praecox） plantation soil：effect of particle size and addition rate［J］. Science of the Total Environment，2017，574：24-33.

［26］Bonanomi G，Antignani V，Capodilupo M，et al. Identifying the characteristics of organic soil amendments that suppress soilborne plant diseases［J］. Soil Biology and Biochemistry，2010，42（2）：136-144.

［27］張曉花，王克勤，宋婭麗，等. 廚余垃圾堆肥對烤煙土壤酶活性和細菌群落結構的影響［J］. 土壤，2023，55（2）：321-330.