玉米根圍土壤中木霉菌的分離、鑒定及生防評價(jià)

摘要：木霉是目前研究較多的生防真菌之一，從玉米根圍土壤中分離木霉菌并進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，可為玉米病害的生物防治和生防菌劑的制備奠定基礎(chǔ)。采用孟加拉紅培養(yǎng)基，利用梯度稀釋平板法從玉米根圍土壤中分離木霉菌，觀察其在不同培養(yǎng)基（PDA、MEA、CMD、SNA）中的菌落形態(tài)和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，并計(jì)算木霉菌在不同培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢量，以及在優(yōu)化的液體培養(yǎng)基中觀察厚垣孢子的產(chǎn)生情況，在形態(tài)學(xué)特征基礎(chǔ)上，構(gòu)建TEF1-α基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹對木霉菌株進(jìn)行鑒定，采用對峙培養(yǎng)和埋片法觀測木霉對3種植物病原菌的拮抗能力。結(jié)果顯示，從玉米根圍土壤中分離得到1株木霉菌Tr20190808-c，其菌落初期為白色，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，顏色逐漸變成綠色，背面無色，菌落中間有明顯的產(chǎn)孢區(qū)。分生孢子梗叢束疏松，次生分枝相對排列，瓶梗中間膨大，基部和端部稍細(xì)，大小為（8.66±0.44） μm×（2.87±0.32） μm。分生孢子卵圓形或球形，直徑為（3.22±0.36） μm，表面光滑。菌絲體毛狀不規(guī)則排列，厚垣孢子球形，直徑約為（9.02±0.52） μm。此木霉在PDA培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量最高，為（4.97±0.98）×108個(gè)/mL。分子鑒定顯示該木霉菌株Tr20190808-c與棘孢木霉同源性最高，結(jié)合形態(tài)特征和分子鑒定結(jié)果，最終鑒定該菌為棘孢木霉（Trichoderma asperellum）。皿內(nèi)對峙試驗(yàn)表明，該木霉對3種病原菌的生防能力不同。培養(yǎng)12 d后均可覆蓋3種病原菌菌落，且木霉菌絲可纏繞在灰霉菌和彎孢菌的菌絲上，綜合評價(jià)該菌具有強(qiáng)的拮抗能力，可作為今后生防菌劑的來源菌株用于玉米病害的生物防治。

關(guān)鍵詞：玉米；根圍土壤；鑒定；棘孢木霉；生物防治

中圖分類號：S435.13 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）15-0160-05

收稿日期：2023-08-15

基金項(xiàng)目：河南省重點(diǎn)研發(fā)與推廣專項(xiàng)（科技攻關(guān)）（編號：212102110144、232102111027、222102110055）。

作者簡介：郎劍鋒（1979—），男，山西高平人，博士，高級實(shí)驗(yàn)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事植物病害生物防治研究。E-mail：langjianfeng@126.com。

通信作者：吳艷兵，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事農(nóng)業(yè)微生物資源利用與土壤修復(fù)研究。E-mail：wybhist@126.com。

木霉是土壤微生物的重要群落，其在環(huán)境中廣泛存在，對營養(yǎng)要求簡單，能夠利用大多數(shù)的碳源與氮源，對多種植物病原菌具有生防活性［1］；不僅可產(chǎn)生許多具有生物活性的代謝產(chǎn)物作用于植物根部，而且能與其他微生物相互作用，從而可以控制病害及改善土壤環(huán)境［2］。木霉對植株的生長具有促進(jìn)作用［3］，其能夠增加植物吸收其自身的或真菌產(chǎn)生的生長激素，刺激植物的呼吸作用及增強(qiáng)植物的光合作用或光合作用效率［4］；還能提高寄主植物對病原菌的抗性［5］，并且對人畜及環(huán)境無害［6］。

玉米是我國三大作物之一，其產(chǎn)量僅次于水稻和小麥。玉米莖基腐病的發(fā)生，對我國玉米生產(chǎn)具有重大威脅。甘肅省的河西走廊地區(qū)，是我國玉米種子生產(chǎn)的重要基地，近些年來，玉米莖基腐病在當(dāng)?shù)仄毡榘l(fā)生，2017年，病株率為31.5%左右［7］，從而造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。生產(chǎn)中對莖基腐病的防治主要依靠化學(xué)農(nóng)藥，但是化學(xué)農(nóng)藥的大量噴施，易造成“3R”（指抗藥性、再增猖獗、殘留）問題。目前，通過逐步降低農(nóng)藥的使用量，利用生防藥劑部分代替化學(xué)藥劑的使用逐漸受到重視。木霉作為一種植物病原菌的生防菌［8］，廣泛分布于根圍土壤中，并且對玉米莖基腐病具有良好的防治效果［9］。受生態(tài)環(huán)境的影響，不同作物土壤中的木霉種群不同［10］，因此，從當(dāng)?shù)匕l(fā)生玉米莖基腐病的玉米根圍土壤中分離篩選木霉菌株，對該病害的生物防治具有重要意義。

本研究從甘肅省白銀市平川區(qū)的玉米根圍土壤中分離木霉菌，根據(jù)其形態(tài)學(xué)特性和TEF1-α基因序列分析，明確木霉菌的種類，利用對峙培養(yǎng)和埋片法評價(jià)木霉對3種植物病原菌的拮抗能力，旨在為今后玉米莖基腐病的生物防治和木霉生防菌劑的制備奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 玉米根圍土樣采集

于2021年8月在甘肅省白銀市平川區(qū)隨機(jī)挑選玉米栽培地塊作為樣地，土質(zhì)為黃土，用5點(diǎn)取樣法采集玉米根圍土樣，取土深度為0～20 cm，5點(diǎn)取樣后將其混勻裝入無菌塑料袋里，標(biāo)明地點(diǎn)、時(shí)間，帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2 供試菌株和培養(yǎng)基

供試植物病原菌分別為玉米莖基腐病菌（Fusarium graminearum）Fg-1，玉米彎孢病菌（Curvularia lunata）Cu-1，葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea）Bc-1。

木霉的分離選用孟加拉紅培養(yǎng)基（RBA）［11］。木霉菌形態(tài)特征觀察選用PDA（馬鈴薯葡萄糖瓊脂）培養(yǎng)基、MEA（麥芽提取物瓊脂）培養(yǎng)基、CMD培養(yǎng)基、SNA（合成低營養(yǎng)瓊脂）培養(yǎng)基［12］。厚垣孢子觀察選用優(yōu)化的液體培養(yǎng)基。

培養(yǎng)基：孟加拉紅培養(yǎng)基（含蛋白胨3 g/L、葡萄糖10 g/L、磷酸二氫鉀1 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、瓊脂20 g/L、孟加拉紅0.002 g/L、氯霉素0.1 g/L）、PDA培養(yǎng)基（含馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂15 g/L，pH值自然）、MEA培養(yǎng)基（含麥芽提取物20 g/L，瓊脂15 g/L）、SNA培養(yǎng)基（含磷酸二氫鉀1.0 g/L、硝酸鉀1.0 g/L、七水硫酸鎂0.5 g/L、氯化鉀0.5 g/L、葡萄糖0.2 g/L、蔗糖0.2 g/L、瓊脂 15 g/L）、CMD培養(yǎng)基（含玉米粉40 g/L，葡萄糖 20 g/L，瓊脂15 g/L）、優(yōu)化液體培養(yǎng)基（含硫酸銨 3 g/L、磷酸氫二鉀1 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、氯化鉀0.5 g/L、硫酸亞鐵0.01 g/L、乳糖20 g/L，pH值為5）。

以上培養(yǎng)基均用蒸餾水配制，定容至1 000 mL 后經(jīng)121 ℃高壓滅菌20 min后備用。

1.3 土壤樣品中木霉的分離

土樣自然陰干，碾碎，依次過60、100、300目篩。將過篩的土樣制成土壤懸液，放置在25 ℃、120 r/min 的振蕩培養(yǎng)箱中振蕩24 h，使土樣充分分散。采用梯度稀釋平板法［13］在孟加拉紅培養(yǎng)基上對木霉進(jìn)行分離、純化。

1.4 木霉培養(yǎng)形狀及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)形態(tài)觀察

在4種固體培養(yǎng)基（PDA、MEA、CMD和SNA）中觀察木霉培養(yǎng)形狀，在菌落產(chǎn)生孢子梗叢束而沒有變?yōu)樯罹G之前，挑取菌絲制成臨時(shí)玻片在顯微鏡下進(jìn)行觀察拍照，待培養(yǎng)7 d后，采用血球計(jì)數(shù)板檢測不同培養(yǎng)基中木霉的產(chǎn)孢量。在優(yōu)化的液體培養(yǎng)基中觀察其產(chǎn)厚垣孢子情況。

1.5 分子鑒定

1.5.1 PCR模板DNA的快速制備

PCR模板DNA的快速制備參考羅中欽等的方法［14］，具體為：取1.5 mL離心管，加入50 mmol/L NaOH溶液 50 μL，用無菌牙簽挑取少量菌絲于離心管中，渦旋打散菌絲，沸水浴10 min。離心管中再加入5 μL 1 mol/L（pH值為8.0）的緩沖液，12 000 r/min離心 10 min。取上清至新離心管中，即為制備的模板DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 PCR擴(kuò)增、測序及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

利用TEF1-α基因的引物（EF1-725F：5′-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3′；EF1-986R：5′-AACTTGCAGGCAATGTGG-3′）［15］進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)在美國Bio-Rad公司生產(chǎn)的PCR儀上進(jìn)行。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；4 ℃保溫。取 5 μL PCR 產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物被送到生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。菌株測序結(jié)果通過BLAST在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比較，通過MEGA 6.0對同源序列以及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)菌株的序列進(jìn)行多重序列比對，運(yùn)用NJ （neighbor-joining）法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹狀圖，確定菌株的分類地位。

1.6 木霉和3種病原菌的對峙培養(yǎng)和重寄生現(xiàn)象的觀察

采用對峙培養(yǎng)法［16］檢測木霉的生防能力。活化好的各供試病原菌和供試哈茨木霉菌置于28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)3 d，用打孔器（D=5 mm）沿菌落邊緣打菌餅，用接種針將木霉菌與病原菌菌餅分別接種于PDA平板培養(yǎng)基距離中心1 cm 處同一直線的2點(diǎn)上，每皿1個(gè)病原菌菌餅和1個(gè)木霉菌菌餅。同時(shí)設(shè)只接病原菌和哈茨木霉菌的平板作為對照，每個(gè)處理重復(fù)3次。28 ℃恒溫培養(yǎng)，逐日觀察菌落的生長和哈茨木霉菌抑制作用效果，測量處理病原菌和對照病原菌菌落半徑，計(jì)算抑制率。抑制率的計(jì)算公式為

抑制率=［（對照直徑-處理直徑）/對照直徑］×100%。

重寄生現(xiàn)象的觀察采用埋片法［17］，具體做法為：在PDA培養(yǎng)基中間放置1塊20 mm×20 mm的滅菌蓋玻片，在左側(cè)距蓋玻片40 mm處接種木霉菌，右側(cè)距蓋玻片20 mm處接種病原真菌，重復(fù)3次，于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待木霉菌菌絲和病原菌菌絲開始接觸后挑取蓋玻片，置于載玻片上，于普通光學(xué)顯微鏡下觀察其菌絲間的作用方式，并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤中木霉的分離

從玉米根圍土壤中分離得到1株木霉，命名為Tr20190808-c。

2.2 木霉菌株Tr20190808-c形態(tài)特征觀察

28 ℃培養(yǎng)72 h后，木霉Tr20190808-c在PDA培養(yǎng)基內(nèi)生長迅速，初期為白色，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長顏色逐漸變綠，中間有明顯的產(chǎn)孢區(qū)，菌落環(huán)狀排列，背面無色（圖1-A）；在MEA培養(yǎng)基中菌落呈環(huán)狀，初期為白色，后期變?yōu)榫G色（圖1-B）；在SNA培養(yǎng)基內(nèi)菌絲稀疏，初期為不明顯，后在菌落邊緣顏色逐漸轉(zhuǎn)綠，形成產(chǎn)孢區(qū)，在菌落中央產(chǎn)生較少產(chǎn)孢區(qū)（圖1-C）；在CMD培養(yǎng)基中生長量最少，初期為白色，后逐漸變綠，在菌落邊緣形成零星綠色產(chǎn)孢區(qū)，菌落中央未見明顯產(chǎn)孢區(qū)（圖1-D）。

分生孢子梗叢狀疏松，次生分枝對生排列，頂端有2個(gè)或2個(gè)以上瓶梗。瓶梗中間膨大，基部和端部稍細(xì)，瓶梗大小為（8.66±0.44） μm×（2.87±0.32） μm，分生孢子卵圓形或球形，表面光滑，直徑為（3.22 ±0.36） μm（圖2-A）。液體培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)木霉菌絲體在三角瓶中呈現(xiàn)菌絲球狀，顯微觀察發(fā)現(xiàn)，在菌絲的頂端和中間著生厚垣孢子，球形，厚垣孢子直徑為（9.02±0.52） μm（圖2-B）。

2.3 木霉菌株Tr20190808-c不同培養(yǎng)基中木霉產(chǎn)孢量

由表1可知，在相同生長條件下，木霉菌株Tr20190808-c在不同培養(yǎng)基中產(chǎn)孢量不同。該菌在PDA培養(yǎng)基內(nèi)生長最好，產(chǎn)孢量最高，為（4.97±0.98）×108個(gè)/mL，與其他3種培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量有顯著差異。在MEA、SNA和CMD培養(yǎng)基里的產(chǎn)孢量分別為（2.22±0.23）×108、（1.49±0.89）×108、（1.16±0.57）×108個(gè)/mL，它們之間沒有顯著差異。

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

從GenBank中選擇14種木霉菌株的TEF1-α基因序列，應(yīng)用MEGA 6.0 軟件進(jìn)行多重比較后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖3可知，本試驗(yàn)菌Tr20190808-c的TEF1-α基因序列與MT239396.1、JQ617309.1、MN520032.1和JQ040480.1同源性最高，聚為一類。因此，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，判定菌株Tr20190808-c為棘孢木霉（Trichoderma asperellum）。

2.5 木霉Tr20190808-c與3種植物病原菌的對峙和重寄生試驗(yàn)

木霉Tr20190808-c與玉米彎孢病菌的對峙培養(yǎng)顯示，木霉生長迅速，生長2 d后2菌開始接觸，5 d 后木霉菌落完全覆蓋玉米彎孢菌菌落（圖4-A）。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，木霉菌絲纏繞在彎孢菌菌絲上（圖4-B）。木霉Tr20190808-c與禾谷鐮刀菌的對峙培養(yǎng)顯示，木霉對禾谷鐮刀菌具有較強(qiáng)的營養(yǎng)競爭能力（圖4-C），木霉生長5 d后就覆蓋了禾谷鐮刀菌，全皿變綠。重寄生觀察發(fā)現(xiàn)，禾谷鐮刀菌和木霉的菌絲并生，各自生長，沒有發(fā)現(xiàn)重寄生現(xiàn)象（圖4-D）。木霉Tr20190808-c與灰霉病菌的對峙培養(yǎng)顯示，對峙培養(yǎng)12 d灰霉病菌菌落已經(jīng)大部分被覆蓋（圖4-E）。顯微觀察發(fā)現(xiàn)木霉可纏繞于灰霉病菌的菌絲上（圖4-F）。

3 結(jié)論與討論

木霉是土壤真菌的重要組成部分［18］，在我國各地均有資源分布［19-21］。由于木霉菌具有抗生、溶菌、重寄生、促生和競爭等多重生防作用而受到廣泛關(guān)注。以往只通過形態(tài)特征鑒定木霉［21］，但隨著木霉種越來越多，木霉菌不同種間的形態(tài)特征極易混淆。因此可以通過分子鑒定技術(shù)來鑒定木霉種，TEF1-α基因已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于木霉種間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究［22］。本試驗(yàn)從玉米根圍土壤中分離到1株木霉菌株Tr20190808-c，通過觀察其形態(tài)學(xué)特征，參考Samuels等的研究結(jié)果［23］，結(jié)合TEF1-α基因序列分析比對，將其鑒定為棘孢木霉（Trichoderma asperellum）。

木霉在不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)性狀不同，在PDA培養(yǎng)基上生長迅速，產(chǎn)孢量大，在其他3種培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量較少，但更易觀測到產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)。本試驗(yàn)所用優(yōu)化的液體培養(yǎng)基為筆者所在課題組前期研究中篩選所得，在該培養(yǎng)基上，木霉能夠產(chǎn)生較多的厚垣孢子。Zhang等在對峙培養(yǎng)條件下探討了不同木霉菌株對病原菌的拮抗能力，分為強(qiáng)、中等、弱和無拮抗能力，具有強(qiáng)拮抗能力的木霉菌株生長速度快于植病菌，產(chǎn)生大量纏繞菌絲纏繞在植病菌的菌絲上，12 d 內(nèi)可在病原菌的菌落上大量產(chǎn)孢［24］。本研究從玉米根圍土壤中篩選到的木霉菌株Tr20190808-c，生長速度快，對峙培養(yǎng)可覆蓋病原菌菌落，但對不同病原菌程度不同。對玉米彎孢菌和禾谷鐮刀菌對峙培養(yǎng)5 d即可覆蓋病原菌菌落，對灰霉病菌對峙培養(yǎng)12 d后可以覆蓋大部分菌落，該菌對玉米彎孢菌和灰霉病菌具有重寄生作用，綜合判斷木霉菌株Tr20190808-c具有強(qiáng)的拮抗能力。因此該木霉菌株可作為防治玉米病害的生防菌株，但其應(yīng)用效果還需通過進(jìn)一步的盆栽和大田試驗(yàn)驗(yàn)證。

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