基于花粉形態學篩選獼猴桃突變體的研究

摘要：花粉形態特征可作為獼猴桃屬植物的分類依據。現有的研究方法需要使用掃描電鏡測量花粉形態的多項特征，不能滿足獼猴桃遺傳育種工作的需求。為了探究一種基于獼猴桃花粉形態篩選突變體的新方法，以39份不同獼猴桃花粉為試驗材料（包含雌株花粉15份、雄株花粉23份、突變體兩性花花粉1份），運用掃描電鏡在較低倍數（1 000×）下觀察，選取5項特征指標進行測量，對供試樣本進行主成分分析和正態分布分析。結果表明，39份樣本均為N3C4P5型，赤道面觀均為三裂圓形，具3條萌發溝；主成分分析中PC1、PC2貢獻的總方差為96.27%；載荷圖表明，在較低倍數下5個花粉形態指標具有一定的差異性；得分圖表明，樣本中的雌株花粉和雄株花粉存在明顯分離，它們的形態學相似度不大，極軸長度與赤道軸長度的比值（P/E）與赤道軸長度（E）二者夾角最大，具有區分意義；P/E的正態分布曲線軸須圖將數據結果可視化，根據樣本的區間差異篩選離群的突變體，篩選出突變體材料4份。

關鍵詞：獼猴桃；花粉形態；掃描電鏡；突變體

中圖分類號：S663.401 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）15-0178-09

收稿日期：2023-09-14

基金項目：四川省科技計劃（編號：2021YFYZ0023、2020ZYD042）；四川省省級科研院所基本科研業務項目（編號：2021JDKY0023）。

作者簡介：何利欽（1988—），女，四川鹽亭人，碩士，助理研究員，主要從事獼猴桃病蟲害及遺傳育種相關研究。E-mail：heliqin777@163.com。

通信作者：王麗華，碩士，研究員，主要從事獼猴桃遺傳育種相關研究。E-mail：514935456@qq.com。

獼猴桃屬植物的原生中心和分布中心均在我國，野生種質資源極為豐富［1］。獼猴桃屬（Actinidia Lindl.）共有54個種和21個變種，約75個分類群，其中有52個種原產于我國［2］。不同來源的材料種間和種內差異較大，在新品種選育和種質創新方面的資源開發利用潛力很大。現有的育種方法有很多，有傳統的實生選育，還有雜交育種、芽變選擇、輻射誘變、生物技術育種等［3-7］。新品種的選育主要以從野生資源和它們的實生子代中篩選材料培育為主［8］，在其生殖與發育過程中，花粉產生雄性配子，花粉形態特征的遺傳保守性很強，不會因外界條件而受到影響，同時花粉攜帶了大量信息，在研究獼猴桃屬植物的親緣關系和突變體上有重要的參考價值和理論依據［1］。

獼猴桃植株在個體遺傳表現上有雌雄株的區別，花朵是形態上的二性花，功能上的單性花，在發育過程中，雌蕊或雄蕊發生選擇性敗育，即表現為雄株花粉可育雌株花粉敗育［9］。有關獼猴桃屬植物孢粉學的研究表明，獼猴桃花粉攜帶的遺傳信息具有穩定性和多樣性。姜正旺等觀察了獼猴桃屬植物 21 個種、6 個變種和4個不同種間雜交F1代植株的花粉形態，提出獼猴桃屬的花粉形狀主要以長球形至近球形為主，變異較小，而花粉粒大小及外壁紋飾的種間差異較大［10］。寧允葉等觀察研究了紅陽獼猴桃及其變種的花粉形態，發現其中存在顯著差異［11］。王柏青觀察了東北3種獼猴桃的花粉形態，發現3種花粉的形態特征對比可以作為分種的依據［12］。鐘敏等對23個野生毛花獼猴桃雄株花粉粒進行觀察分析，發現不同單株間存在差異，分別呈現毛花獼猴桃的遺傳保守性和多樣性［13］。齊秀娟等對獼猴桃3個種30個品系的花粉粒進行形態觀察，發現獼猴桃花粉外觀形態和大小在相同種內和相同來源環境背景下存在一定的保守性，花粉大小、萌發溝長度、萌發溝脊寬度、極軸長度、 赤道軸長度可作為劃分中華獼猴桃和美味獼猴桃的孢粉學特征依據［14］。這些學者先后利用掃描電鏡對獼猴桃種間、種內及變種的不同花粉進行形態學觀察研究，探討不同獼猴桃間的親緣關系，結果表明花粉形態上的顯著差異可以作為篩選獼猴桃突變體的方式之一，為獼猴桃種質資源開發利用提供了科學依據。

但是這些研究存在2個方面的不足之處。一方面，這些研究需要測量花粉形態的多項指標，至少包括花粉極軸長度、赤道軸長度、萌發溝長度、萌發溝寬度、外壁紋飾等多項特征，根據多項指標的統計數據進行平均值與標準差比較，從而研究親緣關系和變異系數。該類方法的不足之處在于：其一，在實際育種工作和科學研究中，基于獼猴桃屬植物種間和種內資源的多樣性、花粉種類和數量較多的情況下，需要進行大量繁瑣的工作；其二，花粉外壁紋飾的觀察對上機樣品和拍攝條件要求高，現有技術條件下，一般須在掃描電鏡放大10 000倍以上進行觀察，如果樣品含水量或者導電性不佳，需要預先處理樣品，費時費力，同時由于外壁紋飾的結構復雜多樣，相關研究依賴于觀察者的主觀判斷，沒有定量指標，在大量篩選工作中不利于標準化的執行和工作效率的提高。另外一方面，現有研究幾乎都是針對雄株的雄花花粉進行相關研究，但是雌株也會產生花粉，以往多認為雌株花粉沒有可育性，研究意義不大，而王明忠等從龍門山南段的野生美味獼猴桃變種的彩色獼猴桃中，篩選出具有生產利用價值的兩性花（雌雄同花）品種龍山紅［15］。筆者的相關研究也發現，雌株的花粉形態具有穩定性和多樣性。因此，對雌株花粉的研究也有一定的價值。

本研究通過掃描電鏡觀察測量中華獼猴桃、美味獼猴桃、軟棗獼猴桃、毛花獼猴桃、葛棗獼猴桃、四萼獼猴桃、京梨獼猴桃共7種獼猴桃的39份花粉，其中雌株花粉15份，雄株花粉23份，美味獼猴桃突變體兩性花龍山紅花粉1份，供試材料在掃描電鏡的低倍數下觀察測量，運用主成分分析法探究影響花粉形狀的主要因素，繪制正態分布曲線軸須圖，探究一種篩選獼猴桃突變體的新方法，以期為獼猴桃的種質資源選育和遺傳育種提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

兩性花龍山紅獼猴桃花粉來自四川省自然資源科學研究院峨眉山生物試驗站，其余供試花粉全部來源于四川省自然資源科學研究院什邡市獼猴桃研究基地。于2021—2023年的春季獼猴桃花期，選取不同獼猴桃的雄株和雌株進行取樣，在四川省自然資源科學研究院實驗室中開展相關試驗。不同獼猴桃花粉信息詳見表1。

1.2 獼猴桃花粉收集

在獼猴桃初花期，采摘即將開放的鈴鐺花，用小鑷子剝落花藥于硫酸紙袋內，置于帶蓋的潔凈培養皿中，在25 ℃的恒溫培養箱中放置24 h，待花粉粒散出后，密封保存于棕色玻璃瓶中，放置于 -20 ℃ 冰箱中備用。

1.3 掃描電鏡觀察拍照

用潔凈棉簽將供試花粉輕柔地粘黏在導電膠上，噴金鍍膜后，放置在日立SU3500掃描電子顯微鏡中，在較低倍數下拍攝觀察。分別在500×、1 000×、3 000×左右倍數下，選取花粉粒的群體、極面觀、赤面觀等具有代表性的視野拍照。

1.4 數據分析

用ImageJ軟件測量較低倍數（1 000×）下花粉粒的5個指標：極軸長度（P）、赤道軸長度（E）、極軸長度與赤道軸長度比值（P/E）、萌發溝長度、花粉粒大小（P×E）。每種花粉粒隨機挑選30粒進行測量。試驗數據使用Excel軟件進行相關處理，運用IBM SPSS Statistics 20.0軟件進行統計分析，運用軟件Grapad Prism 9.5進行主成分分析。

在低倍數500×下拍照，利用ImageJ軟件測量花粉粒的極軸長度（P）、單粒花粉對應的赤道軸長度（E），計算極軸長度與赤道軸長度比值（P/E）。每份樣本測量花粉粒100粒以上。運用軟件Origin 2021制作極軸長度與赤道長度比值（P/E）的正態分布曲線軸須圖，花粉形狀學相關分類、指標的學術用語參考《孢粉學手冊》［16］、《孢粉學概論》［17］。

2 結果與分析

2.1 花粉形態學和大小

由圖1可見，全部供試花粉形態均為單粒、等極、輻射對稱。供試花粉的赤道面觀均為三裂圓形，具3條萌發溝，等間距離分布，根據Erdtman提出的NPC系統分類［16］，41份花粉均為N3P4C5型。極面觀為超長球形、長球形、近球形或扁球形，其中11份中華獼猴桃中6份雄株花粉為超長球形或長球形，5份雌株花粉為近球形、長球形或扁球形；美味獼猴桃中9份雄株花粉為超長球形或長球形，4份雌株花粉為近球形，1份兩性花花粉為近球形；軟棗獼猴桃中3份雄株花粉為超長球形，2份雌株花粉為長球形、近球形；毛花獼猴桃中1份雄株花粉為長球形，1份雌株花粉為扁球形；葛棗獼猴桃中1份雄株花粉為超長球形，1份雌株花粉為近球形；四萼獼猴桃中1份雄株花粉為超長球形，1份雌株花粉為近球形； 京梨獼猴桃中2份雄株花粉分別為長球形和超長球形，1份雌株花粉為近球形。

表1列出了分析統計的各項形態指標。雄株花粉極軸長度為21.15～33.31 μm，最小值為美味獼猴桃，最大值為四萼獼猴桃；雌株花極軸長度為14.10～21.70 μm，最小值為中華獼猴桃，最大值為四萼獼猴桃。雄株花粉赤道軸長度為9.96～16.90 μm，最小值為京梨獼猴桃，最大值為美味獼猴桃；雌株花粉赤道軸長度為14.68～24.05 μm，最小值為中華獼猴桃，最大值為毛花獼猴桃。雄株花粉極軸長度與赤道軸長度比值為1.27～2.26，供試樣品中最小值為美味獼猴桃，最大值為京梨獼猴桃；雌株花粉極軸長度與赤道軸長度比值為0.83～1.36，供試花粉中最小值和最大值均為中華獼猴桃。雄株花粉粒大小（極軸×赤道軸）為223.32～552.42 μm2，最小值為京梨獼猴桃，最大值為四萼獼猴桃；雌株花粉粒大小（極軸×赤道軸）為221.91～559.91 μm2，最小值為中華獼猴桃，最大值為毛花獼猴桃。雄株花粉萌發溝長度為17.55～29.04 μm，最小值為美味獼猴桃，最大值為四萼獼猴桃；雌株花粉萌發溝長度為9.65～15.68 μm，最小值為京梨獼猴桃，最大值為軟棗獼猴桃。

2.2 花粉指標的主成分分析（PCA）

將供試的獼猴桃花粉38份材料（不包括25號樣本兩性花獼猴桃）的5個花粉形態指標［包括極軸長度（P）、赤道軸長度（E）、萌發溝長度、極軸長度與赤道軸長度比值（P/E）、花粉粒大小（P×E）］的相關數據標準化后進行PCA（圖2）。由圖 2-A、圖2-B可知，前2個主成分的貢獻度幾乎可以涵蓋原始變量的信息，前2個主成分貢獻的總方差為96.27%。從圖2-D載荷圖上可以看出，5個花粉形態指標具有一定的差異性，其中極軸長度與赤道軸長度的比值（P/E）、極軸長度（P）、萌發溝長度三者分布比較集中，夾角較小，相關信息相似，區分意義不大；而P/E與赤道軸長度（E）夾角最大，冗余信息很少，可以得出二者具有區分意義。由圖 2-C 可知，樣本間有一定的程度的聚類，雌株花粉和雄株花粉存在明顯分離，二者之間相似度不大，花粉形態特征上發生了一定程度的變化。

2.3 花粉的P/E分布范圍分析

使用軟件Origin 2021制作正態分布曲線軸須圖。由圖3可知，中華獼猴桃的雌株花粉中的7、8、9、11號材料的P/E值分布在0.60～1.25之間，分布范圍較窄且集中，重合度較高；雄株花粉中的1、2、3、5、6號材料的P/E值分布在1.60～2.60之間，分布范圍同樣較窄且集中，重合度較高。但是，雌株花粉中的10號材料、雄株花粉中的4號材料分布趨勢差異較大。10號材料的P/E值分布范圍為0.60～1.80，分布范圍很寬，與大部分雌株花粉重合度不高，有部分值卻和雄株花粉重合在一起，比值分布集中在1.25左右，該區域幾乎不含其他雌株和雄株花粉。雄株花粉中的4號材料P/E值分布范圍為1.50～2.50，其中有部分與其他雄株花粉不重合，較接近于雌株花粉的分布范圍，與雌株花粉中的10號材料有部分重合，但是其離群程度又小于10號材料。從分布軸須圖中可見，4號、10號材料不同于其他材料。可以看出，圖4-A、圖4-B圖和圖4-D、圖4-E圖雌株花粉或雄株花粉的形態一致，幾乎沒有變化，而圖4-C、圖4-F圖中的4號、10號材料花粉形態不一，發生了突變。

圖5為美味獼猴桃的花粉P/E值分布范圍。總的來說，雌株花粉21、22、23、24號材料分布在0.50～1.50之間，雄株花粉12、13、14、15、16、18、19、20號材料分布在1.50～2.75之間，雌株和雄株花粉幾乎不重合，較為集中地分布在2個區域。而雄株花粉中的17號材料分布范圍為0.60～2.00，分布范圍廣，包含雌株和雄株花粉，且與雌株花粉重合區域更多。25號材料為兩性花龍山紅樣本，比值分布在0.50～1.75，分布范圍也較廣，包含雌株和雄株花粉，很大一部分區域與17號材料重合在一起。由圖6可知，17、25號材料在形態上區別較大，花粉形態上發生了突變。

由圖7可知，軟棗獼猴桃的雌株花粉P/E值分布范圍在0.60～1.50之間，雄株花粉P/E值分布范圍在1.60～2.60之間。由圖8可知，毛花獼猴桃、葛棗獼猴桃、四萼獼猴桃、京梨獼猴桃的雌株花粉P/E值分布范圍在0.50～1.50之間，雄株花粉P/E值分布范圍在1.50～2.75之間。可見，P/E值分布均表現為分布范圍較為集中且重合區域較大，雌株和雄株花粉分布在不同區域 且區域之間幾乎不重合。由圖9、圖10也可看出，雄株或雌株花粉在形態上表現一致，幾乎沒有差異，未發生突變。

3 討論與結論

被子植物花粉在生殖與發育過程中產生雄性配子，攜帶大量穩定的遺傳信息，花粉形態學的研究為獼猴桃屬植物的親緣關系和種質資源選育提供重要參考價值。在相關研究中，康寧等先后運用掃描電鏡對不同獼猴桃種間和種內資源材料的花粉形態進行了觀察，獼猴桃花粉均為N3P4C5型，且都以分散的單粒、等極和輻射對稱形式存在，萌發孔為三孔溝，極面觀為三裂圓形，赤道面觀察到1～2條萌發溝，但是各研究均以雄株花粉為主，幾乎很少見有關雌株花粉的研究報道［10，13-14，18-19］。本研究中39份供試材料包括7種獼猴桃花粉，不論雌雄株還是突變體兩性花龍山紅獼猴桃的花粉，均與這些學者的觀察結果一致，同時既補充了雌株花粉形態學研究的理論基礎，也進一步證實獼猴桃花粉在形狀上穩定遺傳變異較少的結論［20］。

獼猴桃屬植物花粉還呈現出遺傳多樣性。鐘敏等先后對23個野生毛花獼猴桃雄株花粉和3個種的30個品系獼猴桃花粉進行觀察研究，花粉粒在極軸長度（P）、赤道軸長度（E）、萌發溝長度、極軸長度與赤道軸長度比值（P/E）、花粉粒大小（P×E）上都存在差異［13-14］，本研究結果也與其一致。為了研究供試材料的親緣關系，這些學者還在高倍數掃描電鏡下觀察測量了花粉的外壁紋飾形狀和萌發溝寬度，再取極軸長度（P）、萌發溝長度、赤道軸長度（E）、萌發溝寬度、極軸長度與赤道軸長度比值（P/E）、花粉粒大小（P×E）等指標的均值進行變異系數分析或者聚類分析。然而，在獼猴桃新品種選育中，有大量的獼猴桃野生資源和實生子代樣本需要篩選和評價；這些方法或是因為對樣品前處理和人員操作經驗有高要求，或是因為觀察測量各項指標較多導致工作量太大，往往不能滿足實際工作的需要。為此，筆者所在課題組提出一種篩選獼猴桃花粉突變體的方法。

在極軸長度（P）、赤道軸長度（E）、萌發溝長度、極軸長度與赤道軸長度比值（P/E）、花粉粒大小（P×E）、萌發溝寬度、外壁紋飾7項花粉特征指標中，為了提高工作效率，選擇在較低倍數下（1 000×）拍照觀察，舍去在高倍數下觀察的萌發溝寬度和外壁紋飾2項特征 增加觀察群體數量的同時減少測量指標數量。然后為了探究較低倍數下的極軸長度（P）、赤道軸長度（E）、萌發溝長度、極軸長度與赤道軸長度比值（P/E）、花粉粒大小（P×E） 5項指標是否可行以及相關指標的降維，運用軟件Grapad Prism 9.5進行主成分分析（PCA）。陡坡圖、方差比例圖顯示前2個主成分的貢獻度為96.27%，幾乎可以涵蓋原始變量的信息；得分圖中樣本間有一定的程度的聚類，雌株和雄株花粉存在明顯分離，二者之間相似度不大；載荷圖表明5項指標中 極軸長度與赤道軸長度比值（P/E）與赤道軸長度（E）夾角最大，冗余信息很少，二者具有區分意義。筆者結合實際工作經驗，認為極軸長度與赤道軸長度比值（P/E）這項指標在花粉形態學上起著關鍵作用，特別是在突變體的花粉形態上具有重要參考價值，發生改變的花粉形態會與群體有一定程度上的差異。為此，利用ImageJ軟件快速測量低倍數下的掃描電鏡圖片，因為在低倍數下電鏡圖片中花粉粒顆粒較多，可快速地得到多組極軸長度與赤道軸長度比值（P/E）數據。采用軟件Origin 2021繪制極軸長度與赤道軸長度比值（P/E）的正態曲線分布軸須圖，將所有數據可視化呈現出來。從不同獼猴桃花粉的P/E值的正態分布區間區域分析得出，4、10、17、25號材料差異較大，4號材料為中華獼猴桃雄株花粉；10號材料為中華獼猴桃雌株花粉，17號為美味獼猴桃雄株花粉，25號材料為美味獼猴桃的突變體兩性花龍山紅獼猴桃花粉；再對照相應的掃描電鏡圖片，均可在群體中找到形狀差異較大的突變花粉粒，驗證該種方法的可行性。

本研究中的供試花粉材料在形態上具有穩定的遺傳共性特征，同時也具有多樣性和差異性。在較低倍數下（1 000×）運用掃描電鏡對群體花粉粒拍照，實現快速測量，得到多組極軸長度與赤道軸長度的比值（P/E）數據，繪制正態分布曲線軸須圖，所有數據實現可視化，分析正態分布區間，篩選出4份差異較大的材料，在相應的掃描電鏡圖片中均可找到形狀差異較大的突變花粉粒，該方法可行，且可高效直觀地篩選獼猴桃突變體，期待可為獼猴桃的資源開發利用以及新品種選育提供理論參考依據。

參考文獻：

［1］趙 洋，穆 雪，李春艷，等. 獼猴桃屬（Actinidia Lindl.）植物親緣關系研究進展［J］. 果樹學報，2019，36（9）：1214-1228.

［2］黃宏文. 獼猴桃屬：分類資源馴化栽培［M］. 北京：科學出版社，2013：10-17.

［3］韓明麗，張志友，趙 根，等. 我國紅果肉獼猴桃育種研究現狀與展望［J］. 北方園藝，2014（1）：182-187.

［4］周玲艷，楊加偉，梁 紅. 植物體細胞雜交技術及其在獼猴桃育種中的應用［J］. 仲愷農業工程學院學報，2009，22（3）：59-64.

［5］劉平平，葉開玉，龔弘娟，等. 獼猴桃60Co-γ射線輻射誘變植株變異的ISSR分子標記研究［J］. 西南農業學報，2016，29（10）：2457-2462.

［6］井趙斌，雷玉山，李永武. 生物技術與我國獼猴桃育種［J］. 生物技術通報，2015，31（7）：1-10.

［7］李升星，劉 崢，賀 笑，等. 獼猴桃多倍體育種研究進展［J］. 現代農業科技，2015（17）：112-114.

［8］廖光聯，陳 璐，鐘 敏，等. 88個獼猴桃品種（系）及近緣野生種的倍性變異分析［J］. 江西農業大學學報，2018，40（4）：689-698.

［9］何子燦爛，蔡起貴，錢迎倩，等. 美味獼猴原生質體再生植株細胞遺傳學研究［J］. 武漢植物學研究，1997，15（3）：199-207.

［10］姜正旺，王圣梅，張忠慧，等. 獼猴桃屬花粉形態及其系統學意義［J］. 植物分類學報，2004，42（3）：245-260.

［11］寧允葉，熊慶娥，曾偉光.‘紅陽’獼猴桃全紅型芽變（86-3）的果實品質及花粉形態研究［J］. 園藝學報，2005，32（3）：486-488.

［12］王柏青. 東北獼猴桃屬花粉形態的初步研究［J］. 吉林工程技術師范學院學報，2008，24（11）：92-94.

［13］鐘 敏，謝 敏，張文標，等. 野生毛花獼猴桃雄株居群花粉形態觀察［J］. 果樹學報，2016，33（10）：1251-1258.

［14］齊秀娟，王 然，蘭彥平，等. 3個獼猴桃栽培種花粉形態掃描電鏡觀察［J］. 果樹學報，2017，34（11）：1365-1373.

［15］王明忠，蒲仕華. 彩色獼猴桃兩性花新品種龍山紅的選育［J］. 中國果樹，2012（6）：1-4.

［16］Erdtman G. 孢粉學手冊［M］. 中國科學院植物所譯.北京：科學出版社，1978：6-45.

［17］王開發. 孢粉學概論［M］. 北京：北京大學出版社，1983：8-48.

［18］康 寧，王圣梅，黃仁煌，等. 獼猴桃屬9種植物的花粉形態研究［J］. 武漢植物學研究，1993，11（2）：111-116，201-205.

［19］祝晨蔯，徐國鈞，徐珞珊，等. 獼猴桃屬12種植物花粉形態研究［J］. 中國藥科大學學報，1995，26（3）：139-143.

［20］張芝玉. 獼猴桃科的花粉形態及其系統位置的探討［J］. 植物分類學報，1987，25（1）：9-23.