非洲豬瘟病毒p10蛋白和p49蛋白的生物信息學分析及表位預測

摘要：運用多種生物信息技術對非洲豬瘟病毒（ASFV）Georgia 2007/1株p10蛋白和p49蛋白的理化性質、二級及三級空間結構、抗原性、抗原決定簇進行初步分析，并預測其B、T淋巴細胞優勢表位。結果表明，p10是親水性蛋白，含有2個抗原決定簇，該蛋白α-螺旋、β-轉角、無規則卷曲和延伸鏈的比例為32.05%、11.54%、52.56%和3.85%；p49同樣是親水性蛋白，含有17個抗原決定簇，其α-螺旋、β-轉角、無規則卷曲和延伸鏈的比例依次為29.91%、7.53%、55.94%和6.62%。基于以上分析，p10不適合用于ASF疫苗制備的候選蛋白；而p49作為親水性衣殼蛋白，具有一定免疫原性，有望成為疫苗研制的備選蛋白，為ASFV蛋白研究和疫苗研發提供一定參考。

關鍵詞：非洲豬瘟；生物信息學；表位預測

中圖分類號：S855.3 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）15-0195-08

收稿日期：2023-09-05

基金項目：國家自然科學基金（編號：32002292），河南省重大科技專項（編號：221100110600）。

作者簡介：孫卓雅（1999—），女，碩士研究生，研究方向為分子免疫和亞單位疫苗等，E-mail：792474123@qq.com；共同第一作者：王夢翔（1998—），男，碩士研究生，研究方向為亞單位疫苗和蛋白質譜分析等，E-mail：1834768483@qq.com。

通信作者：吳亞楠，博士，副教授，研究方向為動物免疫分子的蛋白質結構及功能解析，E-mail：wlyananjiayou@yeah.net；張改平，中國工程院院士，博士，教授，研究方向為動物病毒分子致病機制和食品安全檢測，E-mail：zhanggaip@126.com。

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染豬而引起的一種急性接觸性、廣泛出血性、烈性傳染病，各年齡段的豬均易感。ASF的臨診癥狀很難和豬瘟區別，根據毒力和感染途徑不同ASF可表現為最急性型（強毒株）、急性型（中等毒力毒株）、亞急性型和慢性型（弱毒株）；死亡率分別為100%、90%～100%、30%～70%和<30%。有研究測算，2018年8月至2019年7月中國非洲豬瘟疫情總經濟損失約占2019年中國GDP的0.78%，ASF疫情不僅直接沖擊養豬業，且通過產業關聯，幾乎波及到所有經濟部門［1］，對我國經濟危害極大。

ASFV基因組大小為170～190 kb，編碼超過200種蛋白質，其中，超過50種為結構蛋白，其中，p10蛋白是由K78R基因編碼的一個親核結構蛋白，位于ASFV最內側的擬核內，具有核定位信號。已有研究表明，p10能與單鏈或雙鏈DNA結合，推測其可能在含DNA類核的組裝中發揮作用。同時，有體外試驗證明當ASFV感染細胞時，p10在宿主細胞核中聚集，即p10具有穿過核孔的能力［2］。p49蛋白是由B438L編碼的衣殼蛋白，在感染后晚期表達，是病毒粒子感染必需結構蛋白，當缺乏p49時病毒所形成的病毒顆粒雖具有管狀結構，但二十面體對稱性喪失，通過免疫電鏡對完整的病毒體或病毒顆粒進行觀察，發現p49位于衣殼頂點附近，表明該蛋白在構建或穩定病毒顆粒二十面體頂點過程中起重要作用［3］。鑒于上述重要性，有必要對此2種蛋白的結構和功能進行解析，但目前國內外對ASFV蛋白和抗原表位的研究主要集中在p30［4］、p72［5］、p54［6］、CD2v［7］、K205R［8］等，對p10蛋白和p49蛋白的相關研究較少。本研究選擇了2種研究相對較少但功能很重要的結構蛋白p10和p49作為分析對象，通過氨基酸序列比對發現，由圖1、圖2可知，p10和p49在不同毒株中均十分保守，按照我國流行病學中心的相關監測，目前國內流行的非洲豬瘟病毒屬基因Ⅱ型，所以選擇了同源性約為99.95% Georgia 2007/1株（GenBank No.MK128995）［9］。傳統抗原表位篩選工作量大、成本費用高，生物信息學技術可很好地避免這些問題，并已被廣泛使用。本研究利用生物信息學技術對p10和p49蛋白進行了相關分析并預測了優勢表位，以期為此2種蛋白結構與功能的深入研究、ASFV相關診斷及疫苗產品的研制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

從NCBI蛋白質數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中檢索Georgia/2007株p10和p49蛋白的氨基酸序列。

1.2 方法

1.2.1 理化性質分析

ProtParam tool（https：//web.expasy.org/protparam/）用于蛋白質的物理化學性質分析，包括：氨基酸數量、氨基酸組成、原子組成、分子式、分子量、理論等電點、消光系數、估計半衰期、不穩定性指數、脂肪族指數和親水性均值等。蛋白質的不穩定性指數間接表明了蛋白質的穩定性，如果計算得到的蛋白質不穩定指數<40，則認為是穩定蛋白，>40則認為是不穩定蛋白。

使用Expasy（https：//web.expasy.org/protscale/）中的protscale工具預測p10和p49的親水性［10］。

1.2.2 二級結構預測

使用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa%20_sopma.html）［11］和DNASTAR軟件預測p10和p49蛋白的二級結構［12］。

1.2.3 三級結構預測

使用Phyre 2服務器（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）［13］預測p10和p49蛋白的三級結構，該服務器通過使用多模板建模和簡化的從頭折疊模擬生成蛋白質序列的全長3D模型。

1.2.4 抗原性分析

為分析p10和p49蛋白的潛在抗原性，本試驗使用在線預測服務器VaxiJen v2.0（http：//www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html）來預測蛋白的抗原性［14］。根據服務器應用參數的標識，對抗原保護性預測結果≥0.4為可能潛在的保護性抗原（病毒模式的閾值為0.4）。

1.2.5 抗原決定簇預測

使用Predicting antigenic peptides（http：//imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl）預測p10和p49蛋白潛在的抗原決定簇［13］。

1.2.6 優勢B細胞線性表位的預測

利用ABCpred（https：//webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html）服務器來預測p10和p49蛋白的B細胞線性表位。ABCpred服務器基于人工神經網絡（ANN）［15］進行預測，本研究將2種蛋白的氨基酸序列提交到服務器，從得分>0.5的多肽序列中，挑選出具有免疫原性的候選表位。

1.2.7 細胞毒性T淋巴細胞（CTL）表位的預測 CTL表位需要經抗原呈遞細胞處理，與MHC Ⅰ類

分子結合后才能遞呈給T細胞進行識別［16］。使用NetMHCpan4.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetMHCpan-4.1/）服務器預測多肽與MHCⅠ類分子之間的結合能力。根據綜合評分和蛋白質二級結構，篩選出p10和p49蛋白中可能結合特定MHC-Ⅰ類分子的多肽序列［17］。

1.2.8 輔助性T淋巴細胞（HTL）表位的預測

使用NetMHCpan 4.1服務器預測能與MHC-Ⅱ類分子結合的多肽表位，根據抗原表位的%Rank_EL分數及干擾素-γ（IFN-γ）的釋放來選擇多肽序列，其中%Rank_EL預測結合評分的等級［18］。

2 結果與分析

2.1 理化性質分析

由ProtParam軟件分析結果（表1）可知，p10共有78個氨基酸，分子量為8.43 ku，理論等電點為10.98，共有3個帶負電的殘基，18個帶正電的殘基。蛋白由1 195個原子組成，化學成分為 C354H608N116O113S4。計算的不穩定系數為53.66，表明該蛋白為不穩定蛋白。體外半衰期預測為30 h，在體內、酵母和大腸桿菌的半衰期預測分別大于 20 h 和 10 h。蛋白的脂肪指數為43.85，蛋白結構的親水性平均系數為-1.086。由Expasy中protscale工具預測結果（圖3）可知，該蛋白具有親水性。

由表2可知，p49蛋白共有438個氨基酸，分子量為49.4 ku，理論等電點為9.22，共有39個帶負電殘基，51個帶正電殘基。蛋白由6 889個原子組成，化學成分為C2 193H3 402N620O663S11。計算的不穩定系數為54.25，表明該蛋白為不穩定蛋白。體外半衰期預測為30 h，在體內、酵母和大腸桿菌的半衰期預測分別大于20 h和10 h。蛋白的脂肪指數為69.47，蛋白結構的親水性平均系數為-0.749。由Expasy中protscale工具預測結果（圖4）可知，該結構具有親水性。

2.2 p10和p49蛋白質二級結構預測

由圖5可知，SOPMA分析蛋白質二級結構，p10蛋白中25個氨基酸組成α-螺旋，占總氨基酸的32.05%，3個氨基酸構成延長鏈，占總氨基酸的3.85%，9個氨基酸構成β-轉角，占總氨基酸的

11.54%，41個氨基酸構成無規則卷曲，占總氨基酸的52.56%。由圖6可知，p49蛋白中131個氨基酸組成α-螺旋，占總氨基酸的29.91%，29個氨基酸構成延長鏈，占總氨基酸的6.62%，33個氨基酸構成β-轉角，占總氨基酸的7.53%，245個氨基酸構成無規則卷曲，占總氨基酸的55.94%。

DNASTAR分析使用了Gramier-Robson、Chou-Fasman、Kyte-Doolittle、Eisenberg、Karplus-Schulz、Jameson-wolf和Emini方法預測結果。由圖7可知，p10蛋白的β-折疊分布在第3～9、16～19、20～26、27～32、33～37、49～52、55～58、60～62、68～74位氨基酸片段，無規則卷曲在第5～37、52～55、60～76位氨基酸片段。由圖8可知，p49蛋白的β-折疊分布在第6～18、32～42、72～78、163～172、179～194、235～250、342～352、390～405、418～427位氨基酸片段，無規則卷曲在第15～30、51～63、87～100、128～133、138～173、179～203、240～260、267～280、320～326、356～367、373～382、387～410和415～427位氨基酸片段。

2.3 p10和p49蛋白三級結構預測

通過Phyre 2預測，由圖9、圖10可知p10和p49的三級結構。

2.4 p10和p49蛋白的抗原性分析

VaxiJenV預測p10蛋白的抗原指數為0.323 9，閾值為0.4，說明p10蛋白抗原性不強；p49的抗原指數為0.452 4，指示p49蛋白有一定的抗原性。

2.5 p10和p49抗原決定簇預測

Predicting antigenic peptides預測結果顯示，p10蛋白的平均抗原傾向是0.972 6，具有較好的抗原性，具有2個抗原決定簇，所在區域分別位于第 44～50、52～61位氨基酸；p49蛋白的平均抗原傾向是1.019 7，具有良好的抗原性，具有17個抗原決定簇，分別位于第4～12、45～51、62～68、90～96、121～127、132～139、143～156、174～183、205～230、238～246、249～255、258～271、287～331、338～348、350～359、407～414、426～434位氨基酸。

2.6 p10和p49蛋白優勢B淋巴細胞表位預測

線性B細胞表位的預測是基于ABCpred服務器，此服務器鑒定的B細胞表位預測值范圍為 0.51～1.00 多肽序列的分值越高 其是B細胞抗

原決定簇的可能性越大，預測結果顯示，p10蛋白B細胞抗原表位共有6個，分別為第2～19、52～67、38～53、46～61、29～44、20～35、61～76、11～26位氨基酸；p49蛋白有26個，分別為第41～56、273～288、19～34、415～430、397～412、355～350、231～246、252～267、206～221位氨基酸等。根據抗原決定簇位點的預測結果和二級結構β-轉角和無規卷曲為參考，由表3可知優勢B淋巴細胞表位。

2.7 p10和p49蛋白優勢細胞毒性T淋巴細胞（CTL）表位的預測

T細胞表位是由NetMHCpan 4.1服務器進行預測，結果綜合評分及抗原決定簇位點預測結果和蛋白二級結構的β-螺旋和無規卷曲，篩選出優勢CTL細胞表位。由表4可知，共得到p10有3條優勢表位，p49有5條優勢表位。

2.8 p10和p49蛋白的輔助性T淋巴細胞（HTL）表位的預測

HTL（13位氨基酸）表位則是先由NetMHCpan 4.1服務器預測，初步得到序列，然后將這些序列輸入至IFNepitope服務器中，最終選出IFN-γ陽性誘導的序列。由表5可知，共得到3條p10優勢表位，6條p49優勢表位。

3 討論與結論

自2018年8月我國首次出現ASF以來，疫情快速蔓延至內陸各省份。鑒于我國野豬和軟蜱的分布廣泛，更易形成ASF的自然疫源地［19］；加之目前我國的生豬養殖方式多樣化、養殖密度高、從業人員生物安全意識淡薄，導致我國ASF防控形勢十分嚴峻［20］。由于ASFV的復雜性，且目前對于ASFV與宿主相互作用的研究還存在一定局限性，所以疫苗的研發仍處于初始階段。當前，防控和根除ASF的方法僅限于早期診斷、檢疫和消滅疫點疫區內易感動物，因此對高效、安全且可廣泛使用的疫苗需求非常急迫。所以深入了解ASFV的生命周期，預測各個蛋白的結構，將會增加疫苗開發的成功率，有助于有效預防ASFV的感染。本研究通過在線工具預測蛋白質結構且篩選出優勢B細胞抗原表位和優勢T細胞抗原表位，可用作靶向藥物、表位疫苗研制的篩選對象［21］。有學者運用生物信息學方法，設計出了一種可治療牛結節疹的亞單位疫苗［22］；俱雄等通過生物信息學軟件對大腸桿菌外膜蛋白OmpC進行結構和表位分析，重組拼接獲得OmpC蛋白表位多肽［23］，這些研究均表明生物信息學目前已廣泛運用于各種表位疫苗的設計。

本研究運用多種生物信息學方法，對Georgia 2007/1株p10蛋白和p49蛋白的理化性質、二級結構、三級結構、抗原性、抗原表位進行預測。預測發現，p10蛋白為親水不穩定蛋白，含有2個抗原決定簇，預測出的抗原指數為0.323 9，閾值為0.4，說明p10的抗原性不強，氨基酸中占比重較多的是無規卷曲和α-螺旋；p49蛋白的預測結果為親水不穩定蛋白，含有17個抗原決定簇，預測出的抗原指數為0.452 4，說明p49蛋白具有一定的抗原性，二級結構中占總氨基酸比重較多的是β-轉角和無規則卷曲。β-轉角和無規則卷曲能夠突出于蛋白的表面，表面可及性較強，容易形成抗原表位［11］，以上說明p49蛋白具有免疫原性，且極有可能存在潛在優勢抗原表位，可以作為ASFV疫苗研發的候選蛋白。

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