利用酵母雙雜交篩選菠蘿AcSWEET11的互作蛋白

關(guān)鍵詞：菠蘿；AcSWEET11；酵母雙雜交；互作蛋白

中圖分類號：S668.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

菠蘿[Ananas comosus（L.）Merr]是世界重要的熱帶果樹之一，也是我國重要的熱帶經(jīng)濟(jì)作物。菠蘿是聚花果植物，花芽分化一旦開始，花序和果實(shí)的發(fā)育就會持續(xù)下去，直到果實(shí)成熟[1]，成花與否決定了菠蘿產(chǎn)量與品質(zhì)的形成。目前，生產(chǎn)中菠蘿的開花途徑有2 個，一是經(jīng)過冬季低溫后自然成花[2]，二是栽培12～16個月后經(jīng)人工誘導(dǎo)成花。自然開花會導(dǎo)致果實(shí)成熟期不一致，收獲期延長，甚至出現(xiàn)部分植株3～4a才能自然開花的現(xiàn)象，限制了菠蘿產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[3]。為了解決這一問題，生產(chǎn)上主要利用乙烯利、電石等乙烯衍生物對菠蘿進(jìn)行人工誘導(dǎo)成花（催花）達(dá)到產(chǎn)期調(diào)節(jié)的效果[4] ，但催花效果受到品種、環(huán)境條件和菠蘿的生長發(fā)育時期的影響。如果催花不當(dāng)，會造成減產(chǎn)、果實(shí)品質(zhì)下降，甚至是絕收的情況，嚴(yán)重影響了經(jīng)濟(jì)效益，阻礙了產(chǎn)業(yè)的升級[5] 。因此，解析菠蘿的成花機(jī)制，對促進(jìn)菠蘿產(chǎn)期的調(diào)節(jié)具有重要意義。

SWEET 廣泛存在于植物體，在植物的許多生理過程中發(fā)揮著重要的作用。自2010年CHEN等[6]從擬南芥中第一次鑒定出糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因SWEET 以來，通過對已經(jīng)發(fā)表的基因組序列進(jìn)行全基因組檢索分析，在多種植物中鑒定到了大量的SWEETs[7-9]。SWEET 屬于MtN3/saliva 家族，膜內(nèi)區(qū)域高度保守，具有雙向轉(zhuǎn)運(yùn)糖的功能，包含7 個跨膜a-螺旋結(jié)構(gòu)，形成三螺旋束，促進(jìn)糖的跨膜運(yùn)輸[10]。不同植物的SWEET 系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，在植物中SWEET 基因家族可以分為4 個亞類，且每個亞類的主要轉(zhuǎn)運(yùn)底物不同：Ⅰ 亞類主要轉(zhuǎn)運(yùn)脫氧葡萄糖， 擬南芥的AtSWEET1 是第一個以糖轉(zhuǎn)運(yùn)為特點(diǎn)的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，具有葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)活性，參與花粉對單糖的吸收[11]；Ⅱ亞類主要轉(zhuǎn)運(yùn)單糖，葡萄VvSWEET4主要負(fù)責(zé)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，水稻OsSWEET5 參與半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)[11-12]；Ⅲ亞類主要轉(zhuǎn)運(yùn)蔗糖，擬南芥AtSWEET11 和AtSWEET12 負(fù)責(zé)將細(xì)胞內(nèi)的蔗糖流出到細(xì)胞壁間隙進(jìn)而裝載到韌皮部用于蔗糖的長距離運(yùn)輸[13]；而Ⅳ亞類主要介導(dǎo)了果糖的單向運(yùn)輸，AtSWEET17 定位到液泡膜上，外部供應(yīng)果糖時，其在根延伸區(qū)高度表達(dá)，促進(jìn)根從外部吸收果糖，介導(dǎo)液泡對果糖的攝取并儲存[14-15]。SWEETs 調(diào)控植物花器官的發(fā)育，在植物開花過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。在水稻中OsSWEET11在圓錐花序和花藥中高表達(dá)，遺傳轉(zhuǎn)化研究結(jié)果表明OsSWEET11 調(diào)控小孢子在花粉母細(xì)胞階段和未成熟花粉的發(fā)育。OsSWEET11 通過降低花粉發(fā)育過程中淀粉的含量導(dǎo)致育性下降[7]。OsSWEET14 基因敲除后，突變植株的種子變小，生長延緩，植株的生殖發(fā)育延遲[16]。一些研究結(jié)果表明SWEETs 不僅能夠影響植物的育性，在植物的花器官形成過程中也起著重要的作用。通過分析牡丹花花器官形成過程中葡萄糖含量變化和PsSWEET 表達(dá)量變化發(fā)現(xiàn)，PsSWEET8 極可能通過調(diào)控牡丹花瓣葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)從而調(diào)控開花過程[17]。最新的研究表明，在長日照條件下超表達(dá)AtSWEET10 后擬南芥提前開花，進(jìn)一步的研究結(jié)果表明AtSWEET10 位于FT 信號途徑的下游[18]，這是首次有直接證據(jù)證明SWEET參與了植物成花轉(zhuǎn)變的過程。但是AtSWEET10 是如何調(diào)控開花的機(jī)制尚不清楚。因此，推測AtSWEET10 可能在FT 的誘導(dǎo)下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄然后運(yùn)輸糖或者FT 蛋白來促進(jìn)開花[18]。

已有研究表明，菠蘿（無刺卡因）成花過程中可溶性糖和蔗糖含量顯著提高[19]，且本課題組前期研究結(jié)果證實(shí)，AcSWEET11 能夠促進(jìn)果實(shí)糖積累[20]，并能促進(jìn)擬南芥提早開花（待發(fā)表），但其在成花中的作用機(jī)制尚不清楚。本研究利用酵母雙雜交技術(shù)， 篩選菠蘿花芽分化過程的cDNA 文庫中與AcSWEET11 互作的候選蛋白，為進(jìn)一步研究AcSWEET11 參與成花調(diào)控的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

酵母粉（yeast extract）和胰蛋白胨（tryptone）購自O(shè)XOID 公司；缺陷培養(yǎng)基（minimal syntheticaldefined medium， SD）DDO（SD/-Leu/-Trp）、TDO（ SD/-Leu/-Trp/-His ）、TDO/X（ SD/-Leu/-Trp/-His/X-a-gal）、QDO（SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade）和YPDA 培養(yǎng)基購自北京索萊寶科技有限公司；X-a-gal 購自YEASEN 公司；酵母菌株感受態(tài)NMY51 和pBT3、pNubG-Fe65、pTSU2-APP、pPR3等載體購自武漢金凱瑞生物工程有限公司；菠蘿花芽的cDNA 文庫由本研究中心保存。

1.2 方法

1.2.1 誘餌載體的毒性和自激活檢測 毒性和自激活檢測方法參照王會勤[21]的方法。以pNubGFe65和pTSU2-APP 共轉(zhuǎn)化NMY51 酵母菌為陽性對照，pPR3-N 和pTSU2-APP 共轉(zhuǎn)化酵母菌為陰性對照。將pBT3-STE-AcSWEET11 和獵物空載pPR3-N 通過LiAc 的方法共轉(zhuǎn)化至酵母NMY51中，在DDO、TDO、TDO/AT 和QDO 培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)3～4 d，觀察菌落的生長情況，檢測pBT3-STE-AcSWEET11 誘餌蛋白的毒性和自激活活性。通過對pBT3-STE-AcSWEET11 和Post-Nubal 共轉(zhuǎn)化NMY51 酵母菌，在DDO、TDO/3?AT和QDO 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察菌落的生長情況，檢測pBT3-STE-AcSWEET11 在酵母NMY51 中的表達(dá)功能。

1.2.2 互作蛋白的篩選 從SD/-Leu 平板挑取生長狀態(tài)良好、含有pBT3-STE-AcSWEET11 的單克隆接種至50 mL 的SD/-Leu 液體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)至OD600 為0.2 后，轉(zhuǎn)接至YPDA 液體培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)，使OD600 為0.6～0.8（12～16 h）；室溫離心，收集菌體，用無菌水重懸，離心后棄上清；加入LiAc 重懸菌體，混勻，置冰上，制備含有誘餌載體的NMY51 感受態(tài)。將菠蘿cDNA文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化含有誘餌載體的NMY51 感受態(tài)后，均勻涂布于TDO/X/3?AT 5 mmol/L 平板上，30 ℃培養(yǎng)3～4 d。挑選TDO/X/3?AT 板上變藍(lán)的單菌落，轉(zhuǎn)接于新的QDO/X 平板上，30 ℃培養(yǎng)3 d，統(tǒng)計(jì)2 種培養(yǎng)基上變藍(lán)的單菌落，即為候選陽性克隆。

1.2.3 候選互作蛋白的測序鑒定 提取陽性克隆質(zhì)粒，利用通用引物（Up： CTTTCCTTATACATTAGGACC，Dn： GGGACCTAGACTTCAGGTTG）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。選取條帶單一，大于500 bp 的有效克隆片段，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序驗(yàn)證。測序結(jié)果在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行BLAST 比對分析。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 利用在線網(wǎng)站UniProt（https：//www.uniprot.org）注釋候選蛋白的功能。將獲得的候選蛋白進(jìn)行Gene Ontology（GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路分析。

1.2.5 候選蛋白基因的表達(dá)分析 對乙烯利誘導(dǎo)菠蘿成花過程（0、8、16、32 d）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，獲得花芽分化過程中基因表達(dá)量的數(shù)據(jù)，利用HemI 軟件計(jì)算各時期基因表達(dá)量的FPKM（fragments per kilobase of exon model per millionmapped fragments）值，并繪制候選蛋白基因在乙烯利誘導(dǎo)菠蘿成花過程中的表達(dá)熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘餌載體的毒性和自激活檢測

以pNubG-Fe65 和pTSU2-APP 共轉(zhuǎn)化NMY51 酵母菌為陽性對照，pPR3-N 和pTSU2-APP 共轉(zhuǎn)化酵母菌為陰性對照。將pBT3-STEAcSWEET11誘餌重組質(zhì)粒和獵物空載pPR3-N 共轉(zhuǎn)化NMY51 酵母感受態(tài)。結(jié)果表明，pBT3-STEAcSWEET11+pPR3-N 在DDO 培養(yǎng)基上的酵母菌生長狀態(tài)良好，說明pBT3-STE-AcSWEET11 和pPR3-N 已成功轉(zhuǎn)入NMY51 酵母菌中，且對NMY51 酵母細(xì)胞無毒性。pNubG-Fe65+pTSU2-APP 在DDO、TDO/3?AT、QDO 培養(yǎng)基上生長良好，pPR3-N+pTSU2-APP 在DDO 培養(yǎng)基上正常生長，在TDO/3?AT、QDO 無菌落生長，誘餌重組質(zhì)粒pBT3-STE-AcSWEET11+pPR3-N的酵母菌在TDO 培養(yǎng)基能夠生長， 表明pBT3-STE- Ac-SWEET11+pPR3-N 有自激活現(xiàn)象，激活HIS3 的表達(dá)（圖1A～圖1H）。為了抑制酵母菌中HIS3的表達(dá)，在TDO 培養(yǎng)基中添加不同濃度的3?AT。結(jié)果顯示，在添加3?AT 后酵母菌沒有生長，HIS3的表達(dá)受到抑制（圖1I～圖1K）。進(jìn)一步分析其在QDO 培養(yǎng)基上的生長情況，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化pBT3-STE-AcSWEET11+pPR3-N 的酵母菌不能生長（圖1L）。以上結(jié)果表明，pBT3-STE-AcSWEET11+pPR3-N 在TDO/3?AT 培養(yǎng)基和QDO培養(yǎng)基上自激活受到抑制，后續(xù)可在TDO/3?AT 和QDO 培養(yǎng)基上進(jìn)行互作蛋白的篩選。

將Post-Nubal 和pBT3-STE-AcSWEET11 共轉(zhuǎn)化NMY51 酵母菌，分別在DDO、TDO/3?AT 和QDO 培養(yǎng)基上培養(yǎng)。結(jié)果表明，在DDO 培養(yǎng)基上有菌落生長，說明共轉(zhuǎn)化成功；在TDO/3?AT和QDO 培養(yǎng)基上菌落生長良好，表明pBT3-STEAcSWEET11在NMY51 系統(tǒng)能正確表達(dá)，可進(jìn)行下一步文庫篩選（圖2）。

2.2 候選互作蛋白的篩選及鑒定

利用菠蘿花芽分化的cDNA 膜文庫篩選與AcSWEET11 互作的蛋白。以pTSU2-APP和pNubGFe65共轉(zhuǎn)化菌液為陽性對照（CK+），pTSU2-APP和pPR3-N 共轉(zhuǎn)化菌液為陰性對照（CK–），經(jīng)過2 次篩選，共獲得81 個在TDO/X/3?AT 培養(yǎng)基中生長良好的藍(lán)色菌落（圖3A、圖3B）。進(jìn)一步加壓培養(yǎng)，將58 個大小均一的單克隆點(diǎn)種在含有QDO/X 培養(yǎng)基上進(jìn)行再次篩選。結(jié)果顯示，58個藍(lán)色菌斑均能正常生長（圖3C、圖3D），初步篩選出58 個陽性克隆。將這58 個陽性克隆進(jìn)行菌落PCR 反應(yīng)（pPR3-N 為陽性對照，CK+；H2O為陰性對照，CK–），電泳檢測結(jié)果表明，插入片段條帶單一，大小約為500～2000 bp（圖4）。分別提取陽性克隆質(zhì)粒并進(jìn)行測序分析，合并重復(fù)序列，測序結(jié)果在NCBI 進(jìn)行比對，篩選到48 個可能與AcSWEET11 相互作用的蛋白（表1）。主要包括E3 泛素連接酶RING1-like、海藻糖磷酸合成酶、細(xì)胞色素P450、LUX 轉(zhuǎn)錄因子等。

2.3候選蛋白的生物信息學(xué)分析

對獲得的48個候選互作蛋白進(jìn)行GO 和KEGG 分類分析。GO分析結(jié)果表明，48個蛋白主要富集在細(xì)胞進(jìn)程（cellular process）、代謝過程（metabolic process）、刺激反應(yīng)（responsetostimulus）、細(xì)胞解剖實(shí)體（cellular anatomicalentity）、結(jié)合（binding）和催化活性（catalyticactivity）等生物過程（圖5）。KEGG 分析結(jié)果顯示，48 個蛋白主要的KEGG 途徑包括脂類代謝（lipid metabolism）、氨基酸代謝（amino acidmetabolism）、其他次生代謝物的生物合成（biosynthesisof other secondary metabolites）和碳水化合物代謝（carbohydrate metabolism）等新陳代謝途徑，翻譯（translation）和折疊、分類和降解（folding，sorting and degradation）等遺傳信息途徑，以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（signal transduction）與運(yùn)輸和分解代謝（transport and catabolism）等通路（圖6）。

2.4 候選蛋白的基因表達(dá)分析

為了確定候選互作蛋白基因的表達(dá)情況，對前期獲得的菠蘿花芽分化過程中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，共有30 個候選蛋白基因檢測到表達(dá)量，18個候選蛋白基因在乙烯利誘導(dǎo)菠蘿成花中未檢測到。進(jìn)一步分析結(jié)果表明，Trehalosephosphatesynthase 7（XP_020105459.1）、ProteinTIFY 3-like（XP_020082835.1）、40S ribosomal proteinS27（XP_020092770.1）、Heterogeneous nuclearribonucleoprotein 1-like（XP_020112516.1）等4 個基因與AcSWEET11（XP_020107765.1）表達(dá)一致，在菠蘿成花過程中下調(diào)表達(dá)；Dihydrolipoyl dehydrogenase2（XP_020113798.1）、Putative lipidtransferprotein DIR1（XP_020086640.1）、Clathrinassembly protein At4g32285（XP_020108161. 1）等3個基因在菠蘿成花過程中上調(diào)表達(dá)（圖7）。表明Trehalose-phosphate synthase 7 等7 個候選互作蛋白在菠蘿成花過程中具有重要作用。

3 討論

酵母雙雜交是一種篩選互作蛋白的常用方法，廣泛應(yīng)用于未知互作蛋白的篩選和已知蛋白間相互作用的驗(yàn)證。但該系統(tǒng)存在假陽性率和假陰性率高等局限性[22]。自激活和毒性是導(dǎo)致假陽性率和假陰性率高的主要因素。當(dāng)誘餌蛋白和獵物蛋白單獨(dú)或結(jié)合后，出現(xiàn)毒性，抑制酵母細(xì)胞的正常生長，從而出現(xiàn)假陰性；而當(dāng)誘餌蛋白存在自激活活性，獵物蛋白與誘餌蛋白結(jié)合后可激活報(bào)告基因的表達(dá)，從而出現(xiàn)假陽性[23]。為了抑制誘餌蛋白的自激活活性，不同缺陷培養(yǎng)基以及在缺陷培養(yǎng)基中添加不同濃度3?AT 被廣泛應(yīng)用于酵母雙雜交的過程中。謝瑞瑩等[23]通過在TDO培養(yǎng)基中添加10 mmol/L 的3?AT，抑制了pGBKT7-NtMYB4a+pGADT7 的自激活活性；在葡萄中，將pGBKT7-VvJAZ9+pGADT7 在QDO/X/A 的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，其自激活活性受到抑制[24]。本研究結(jié)果顯示，pBT3-STE-AcSWEET11+pPR3-N 存在自激活現(xiàn)象，通過在TDO培養(yǎng)基中添加不同濃度的3?AT 后或在QDO培養(yǎng)基上培養(yǎng)，酵母菌不能生長，表明3?AT 和QDO培養(yǎng)基能夠抑制pBT3-STE-AcSWEET11+pPR3-N 的自激活活性。

菠蘿花芽分化是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，受到自身因素和外界環(huán)境條件的影響，涉及糖、氨基酸、植物激素等生理生化的變化[19， 25-26]。本課題組的前期研究結(jié)果表明，AcSWEET11可促進(jìn)可溶性糖的積累[20]，但其在成花中的作用機(jī)制尚不清楚。本研究利用酵母雙雜交技術(shù)，篩選了48 個與AcSWEET11互作的蛋白，這些蛋白主要富集在氨基酸、碳水化合物以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和運(yùn)輸、分解等代謝通路上，推測AcSWEET11可能通過氨基酸、碳水化合物和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑參與菠蘿的成花過程。

擬南芥AtSWEET10 能夠促進(jìn)擬南芥提早開花，且處于FT 的下游[18]。在本研究中，沒有篩選到FT 等成花相關(guān)的基因，推測AcSWEET11 可能不是通過直接與FT 等成花相關(guān)基因相互作用參與菠蘿的成花過程。Trehalose-phosphate synthase（TPS）基因在擬南芥成花啟動中具有重要作用，其主要通過調(diào)控SPL 等基因的表達(dá)參與擬南芥的成花過程，是糖作為信號物質(zhì)參與成花的關(guān)鍵途徑[27]。本研究結(jié)果表明，AcSWEET11 和AcTPS7能夠產(chǎn)生互作，且其在菠蘿成花過程中的表達(dá)模式一致，推測AcSWEET11 可能通過TPS 信號途徑參與菠蘿成花。乙烯是誘導(dǎo)菠蘿成花的關(guān)鍵激素，外源乙烯通過促進(jìn)內(nèi)源乙烯的合成誘導(dǎo)菠蘿成花[4]。已有報(bào)道表明E3 泛素連接酶（E3 ubiquitin-protein ligase RING1）能直接與ACS 合成酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase）相互作用來調(diào)節(jié)乙烯的合成[28]。本研究結(jié)果顯示，AcSWEET11 和E3 泛素連接酶存在互作，推測AcSWEET11 可能通過與E3 泛素連接酶互作來調(diào)控乙烯的合成參與菠蘿的成花過程。此外，本研究還篩選到了1個LUX 轉(zhuǎn)錄因子。在水稻中，OsLUX 通過調(diào)控OsELF3-1 和OsELF4s 蛋白抑制Hd1/Ghd7 的表達(dá)參與成花[29]。而在菠蘿中，AcSWEET11是否與水稻相似，能夠通過與LUX相互作用，調(diào)控ELF 等蛋白的表達(dá)來參與菠蘿的成花過程，需要進(jìn)一步研究。

4結(jié)論

本研究通過對pBT3-STE-AcSWEET11+pPR3-N 的毒性和自激活活性的檢測，建立AcSWEET11的酵母雙雜交系統(tǒng)。利用該系統(tǒng)篩選了48個與AcSWEET11互作的候選蛋白。對48 個蛋白進(jìn)行GO和KEGG分析，其主要分布在細(xì)胞進(jìn)程、代謝過程、刺激反應(yīng)和催化活性等生物過程，參與氨基酸代謝、碳水化合物代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和運(yùn)輸?shù)刃玛惔x途徑，推測AcSWEET11 可能通過氨基酸代謝、碳水化合物代謝或者信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑參與菠蘿的成花過程。