橡膠樹不同發(fā)育時期花藥愈傷生長發(fā)育對低溫的響應(yīng)

關(guān)鍵詞：橡膠樹；遺傳轉(zhuǎn)化；花藥愈傷；低溫保存；體細胞胚發(fā)生

中圖分類號：S794.1 文獻標志碼：A

天然橡膠是重要的工業(yè)原料，更是不可或缺的戰(zhàn)略物資，其主要來源于巴西橡膠樹（Heveabrasiliensis）。現(xiàn)代遺傳工程的發(fā)展、基因組編輯手段的精準改良加速了培育轉(zhuǎn)基因橡膠樹新品種的腳步，隨之而來的對于轉(zhuǎn)基因優(yōu)質(zhì)受體初代花藥愈傷和初代子葉胚的持續(xù)供應(yīng)成為不可忽視的問題。

橡膠樹公開報道的遺傳轉(zhuǎn)化體系根據(jù)受體分為5 種，原生質(zhì)體[1]、易碎胚性愈傷組織[2]、花藥愈傷組織[3-5]、次生胚[6]，其中原生質(zhì)體再生效率低[7]，易碎胚性愈傷組織再生植株生長勢弱[8]，只有花藥愈傷組織和次生胚具有商業(yè)應(yīng)用價值。隨著技術(shù)的不斷進步，橡膠樹花藥愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化效率在不斷提高。然而花藥愈傷組織為脫分化愈傷，胚性愈傷與非胚性愈傷混合，不能通過繼代增殖，需要不斷采集外植體，但花蕾來源嚴重受季節(jié)限制，全年可供采花時期短，不能為相應(yīng)研究提供長期穩(wěn)定的受體來源。本文研究了不同發(fā)育時期花藥愈傷在15 ℃和20 ℃低溫保存15 d 后，對其愈傷誘導(dǎo)、體細胞胚發(fā)生和子葉胚形成的影響，為今后利用低溫保存橡膠樹初代花藥愈傷組織，延長優(yōu)質(zhì)胚性愈傷組織、初代子葉胚供應(yīng)時間，妥善保存橡膠樹種質(zhì)資源提供理論依據(jù)，為以初代花藥愈傷或初代體細胞胚為受體的轉(zhuǎn)基因研究供體保障提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為大規(guī)模推廣級品種橡膠樹熱研73397 春季幼嫩雄花，采自位于海南省儋州市中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所試驗基地。

1.2 方法

1.2.1 外植體的選擇與接種 從健康的橡膠樹上采集雄性幼花，將有花序的枝條用濕毛巾敷蓋，塑料袋包裹儲存，立即帶回實驗室。用鑷子從花序中挑選黃綠色的胸花在75%的乙醇浸泡1 min，期間搖晃數(shù)次，無菌水沖洗1 遍，隨后用0.1%升汞浸泡10 min，期間晃動數(shù)次，無菌水沖洗3～5遍。無菌的超凈工作臺中，在顯微鏡下用解剖針剝開花蕾表皮取出完整雄花接種于培養(yǎng)皿中，每皿接種7 個外植體。

1.2.2 橡膠樹低溫保存花藥愈傷及保存后室溫誘導(dǎo)愈傷組織/恢復(fù) 共設(shè)置花藥愈傷發(fā)育時期、保存溫度2 個影響因素。CK 組為一直放置在室溫（25±2） ℃暗培養(yǎng)的花藥愈傷組織。將經(jīng)過無菌消毒的橡膠樹雄花接種于M1[9]培養(yǎng)基中置于室溫培養(yǎng)得到不同發(fā)育時期的花藥愈傷組織（0、7、14、21、28、35、42 d），然后分別放置于15 ℃及20 ℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)15 d，觀察低溫處理前后花藥愈傷的表型，隨后放置室溫暗培養(yǎng)。跟蹤不同處理橡膠樹花藥愈傷組織發(fā)生及恢復(fù)情況，每10 d 觀察各發(fā)育時期的花藥愈傷組織發(fā)生及恢復(fù)情況，30 d 統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率。CK 組室溫暗培養(yǎng)35 d 后統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率。愈傷組織誘導(dǎo)率=（花藥愈傷組織數(shù)/低溫培養(yǎng)的花藥數(shù)）×100%。愈傷組織延長保存時間（d）=實驗組花藥從外植體接種至可轉(zhuǎn)入至出胚培養(yǎng)基所需總天數(shù)-對照組花藥從外植體接種至可轉(zhuǎn)入出胚培養(yǎng)基所需總天數(shù)。每個處理5 皿，每皿7 個外植體，重復(fù)3 次。

1.2.3 橡膠樹低溫保存花藥愈傷組織體細胞胚誘導(dǎo)與成熟 將上述各組花藥愈傷組織轉(zhuǎn)至體細胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基M2[9]中，室溫（25±2） ℃暗培養(yǎng)60 d時統(tǒng)計再分化出體細胞胚的花藥愈傷組織數(shù)（塊），繼續(xù)培養(yǎng)至120 d 時觀察并統(tǒng)計胚狀體及子葉胚數(shù)量（個）。以一直置于室溫暗培養(yǎng)的花藥愈傷為CK 組。胚性愈傷誘導(dǎo)率=（誘導(dǎo)出體細胞胚的愈傷數(shù)/接種愈傷數(shù)）×100%；體細胞胚誘導(dǎo)率=（體細胞胚總數(shù)/胚性愈傷數(shù)）×100%；子葉胚獲得率=（子葉胚總數(shù)/體細胞胚總數(shù)）×100%。體細胞胚延長保存時間（d）=實驗組從外植體接種至誘導(dǎo)出子葉胚所需總天數(shù)-對照組從外植體接種至誘導(dǎo)出子葉胚所需總天數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)主要采用Excel 2023和IBM SPSSStatistics 20軟件進行整理、統(tǒng)計和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫保存對不同發(fā)育時期橡膠樹花藥愈傷組織生長的影響

結(jié)果表明：（1）不同發(fā)育階段的花藥愈傷組織在15 ℃低溫下保存15 d，低溫保存期間，發(fā)育時期為0、7、14、21 d 的花藥愈傷無生長跡象，發(fā)育時期為28、35、42 d 的花藥愈傷有一定生長，但較CK 組均有不同程度延緩（表1）。愈傷外觀與CK 組相似，未出現(xiàn)明顯冷害（圖1B1、B2）；（2）不同發(fā)育階段的花藥愈傷組織在20 ℃低溫下保存15 d，低溫保存期間，發(fā)育時期為0、7 d的花藥愈傷無生長跡象，發(fā)育時期為14、21、28、35 d 的花藥愈傷生長情況較CK 組均有不同程度延緩，發(fā)育時期為42 d 的花藥愈傷生長情況與CK 組相當(dāng)。愈傷外觀與CK 組相似，未出現(xiàn)明顯冷害（圖1B3、B4）。

2.2 低溫保存后不同發(fā)育時期橡膠樹花藥愈傷組織誘導(dǎo)或恢復(fù)情況

室溫條件下，花藥愈傷誘導(dǎo)數(shù)為34.33 個，誘導(dǎo)率為98.10%（表1）。

不同發(fā)育階段的花藥愈傷組織在15 ℃低溫下保存15 d，結(jié)果表明，在愈傷誘導(dǎo)階段，發(fā)育時期為28、35、42 d 的花藥愈傷誘導(dǎo)情況與CK組的差異不顯著。發(fā)育時期為7、14 d 的花藥愈傷數(shù)及誘導(dǎo)率均顯著下降（P<0.05），分別較CK組降低5～6 個，15.24%和19.05%。發(fā)育時期為0、21 d 的花藥愈傷數(shù)及誘導(dǎo)率均大幅度下降，分別較CK 組減少16～18 個，45.72%和53.34%（表1）。

不同發(fā)育階段的花藥愈傷組織在20 ℃低溫下保存15 d，結(jié)果表明，在愈傷誘導(dǎo)階段，發(fā)育時期為21、28、35、42 d 的花藥愈傷與CK 組無顯著差異。發(fā)育時期為0、7、14 d 的花藥愈傷數(shù)及誘導(dǎo)率均顯著下降（P<0.05），降幅分別為4～9個和11.43%～25.72%（表1）。

2.3 低溫保存后不同發(fā)育時期橡膠樹花藥胚性愈傷誘導(dǎo)情況

室溫條件下，胚性愈傷數(shù)為25.33 個，誘導(dǎo)率為73.84%（表1，圖1D）。

不同發(fā)育階段的花藥愈傷組織在15 ℃低溫下保存15 d，結(jié)果表明，在胚性愈傷誘導(dǎo)階段，發(fā)育時期為28、42 d 的花藥愈傷其胚性愈傷數(shù)、胚性愈傷誘導(dǎo)率與CK 組無顯著差異；其余5 個發(fā)育時期與CK 組相比，其胚性愈傷數(shù)與胚性愈傷誘導(dǎo)率均顯著下降（P<0.05），降幅分別為6～15個和8.09%～33.26%（表1，圖1D1、D2）。

不同發(fā)育階段的花藥愈傷組織在20 ℃低溫下保存15 d，結(jié)果表明，在胚性愈傷誘導(dǎo)階段，發(fā)育時期為21、42 d 花藥愈傷的胚性愈傷數(shù)及胚性愈傷誘導(dǎo)率與CK 組無顯著差異；發(fā)育時期為28 d 花藥愈傷的胚性愈傷數(shù)與CK 組無顯著差異，胚性愈傷誘導(dǎo)率顯著高于CK 組（P<0.05）；發(fā)育時期為0、7、14、35 d 的花藥愈傷其胚性愈傷數(shù)及胚性愈傷誘導(dǎo)率均顯著低于CK 組（P<0.05），降幅分別為8～14 個和9.68%～41.90%（表1）。

2.4 低溫保存后不同發(fā)育時期的花藥愈傷組織體細胞胚發(fā)生情況

室溫條件下，體細胞胚數(shù)為87.33個，體細胞胚誘導(dǎo)率為345.15%（表1，圖1D）。

不同發(fā)育階段的花藥愈傷組織在15 ℃低溫下保存15 d，結(jié)果表明，在體細胞胚發(fā)生階段，發(fā)育時期為14、42 d 的花藥愈傷產(chǎn)生的體細胞胚數(shù)與CK 組無顯著差異，而其他5 個發(fā)育時期花藥愈傷產(chǎn)生的體細胞胚數(shù)較CK 組顯著下降，降幅為13～62 個；發(fā)育時期為14、21 d 的花藥愈傷體細胞胚誘導(dǎo)率較CK 組有顯著提高（P<0.05），分別提高了111%和178.49%；發(fā)育時期為35 d的花藥愈傷的體細胞誘導(dǎo)率顯著降低（P<0.05），較CK 組下降159.17%，而其余4 個時期的花藥愈傷體細胞胚誘導(dǎo)率與CK 組無顯著差異（表1，圖1D1、D2）。

不同發(fā)育階段的花藥愈傷組織在20 ℃低溫下保存15 d，結(jié)果表明，在體細胞胚發(fā)生階段，發(fā)育時期為21、28、42 d 的花藥愈傷體細胞胚數(shù)顯著高于CK 組（P<0.05），增幅為10～38 個；發(fā)育時期為0、7、14、35 d 的花藥愈傷體細胞胚數(shù)較CK 組顯著下降（P<0.05），降幅為20～70 個；發(fā)育時期為0、14、42 d 的花藥愈傷體細胞胚誘導(dǎo)率比CK 組顯著提高（P<0.05），增幅為95.60%～155.53%；發(fā)育時期為7、21、28 d 的花藥愈傷體細胞胚誘導(dǎo)率與CK 組無顯著差異；發(fā)育時期為35 d 的花藥愈傷的體細胞胚誘導(dǎo)率對比CK 組下降180.76%，差異最為顯著（P<0.05）（表1，圖1D3、D4）。

2.5 低溫保存后不同發(fā)育時期花藥愈傷組織子葉胚獲得情況

對照組的子葉胚數(shù)為23.33個，子葉胚獲得率為26.58%（表1，圖1E）。

不同發(fā)育階段的花藥愈傷組織在15 ℃低溫下保存15d，結(jié)果表明，在子葉胚獲得方面，發(fā)育時期為21 d 的花藥愈傷子葉胚數(shù)比CK 組顯著提高（P<0.05），較CK 組多約6 個，發(fā)育時期為14、28、42 d 的花藥愈傷子葉胚數(shù)與CK 組無顯著差異，發(fā)育時期為0、7、35 d 的花藥愈傷子葉胚數(shù)較CK 組顯著下降（P<0.05），降幅為11～19個；發(fā)育時期為0、21 d 的花藥愈傷子葉胚獲得率對比CK 組顯著提高（P<0.05），分別較CK 組提高了11.41%和25.29%，而其余5 個發(fā)育時期的花藥愈傷子葉胚獲得率較CK 組無顯著差異（表1，圖1E1、E2）。

不同發(fā)育階段的花藥愈傷組織在20 ℃低溫下保存15 d，結(jié)果表明，在子葉胚獲得方面，發(fā)育時期為21、42d的花藥愈傷子葉胚數(shù)比CK 組顯著提高（P<0.05），分別較CK 組增加約7 個和18 個，發(fā)育時期為0、7、28d的花藥愈傷子葉胚數(shù)與CK 組無顯著差異，發(fā)育時期為14、35d的花藥愈傷子葉胚獲得數(shù)較CK 組顯著下降（P<0.05），分別較CK 組減少約13 和20 個；發(fā)育時期為21 d 的花藥愈傷子葉胚獲得率對比CK 組顯著性提高（P<0.05），較CK 組提高了15.58%，而其余6個發(fā)育時期的花藥愈傷子葉胚獲得率與CK 組無顯著差異（表1，圖1E3、E4）。

2.6 低溫保存溫度與花藥愈傷發(fā)育時期對低溫保存后花藥愈傷誘導(dǎo)、分化、發(fā)育影響

圖2表明，不同低溫保存的花藥愈傷在各發(fā)育階段生長狀況，15 ℃低溫保存后的花藥愈傷組織在胚性愈傷誘導(dǎo)階段的胚性愈傷數(shù)較CK 組顯著下降（P<0.05），其余生長階段與CK 組無顯著差異；20 ℃低溫保存后的花藥愈傷組織在各生長階段與CK 組均無顯著差異。

圖3表明，不同發(fā)育時期的花藥愈傷低溫保存后在各發(fā)育階段生長狀況，在愈傷誘導(dǎo)階段（愈傷誘導(dǎo)數(shù)和愈傷誘導(dǎo)率），發(fā)育時期為28、35、42 d 的花藥愈傷組織與CK 組無顯著差異，而其余4 個發(fā)育時期的花藥愈傷組織較CK 組顯著下降；在胚性愈傷誘導(dǎo)階段（胚性愈傷數(shù)和胚性愈傷誘導(dǎo)率），發(fā)育時期為28、42 d 的花藥愈傷組織與CK 組無顯著差異，而其余5 個發(fā)育時期的花藥愈傷組織較CK 組顯著下降（P<0.05），但其中發(fā)育時期為21 d 的花藥愈傷組織的胚性愈傷數(shù)顯著下降（P<0.05），胚性愈傷誘導(dǎo)率與CK 組確無顯著差異；在體細胞胚誘導(dǎo)階段，發(fā)育時期為14、21、28、42 d 的花藥愈傷組織的體細胞胚數(shù)與CK 組無顯著差異，而其余3 個發(fā)育時期的體細胞胚數(shù)較CK 組顯著下降（P<0.05）、發(fā)育時期為14、21 d 的花藥愈傷組織的體細胞胚誘導(dǎo)率較CK 組顯著提高（P<0.05），發(fā)育時期為0、7、28、42 d 的花藥愈傷組織的體細胞胚誘導(dǎo)率與CK 組無顯著差異，發(fā)育時期為35 d 的花藥愈傷組織的體細胞胚誘導(dǎo)率較CK 組顯著下降（P<0.05）；在子葉胚形成階段，發(fā)育時期為21 d 花藥愈傷組織的子葉胚數(shù)較CK 組顯著提高（P<0.05），發(fā)育時期為0、28、42 d 的花藥愈傷組織的子葉胚數(shù)與CK 組無顯著差異，其余3 個發(fā)育時期的花藥愈傷組織的子葉胚數(shù)較CK 組顯著下降（P<0.05）、發(fā)育時期為0、21 d 花藥愈傷組織的子葉胚獲得率較CK 組顯著提高（P<0.05），發(fā)育時期為7、14、28、42 d 的花藥愈傷組織的子葉胚獲得率與CK組無顯著差異，發(fā)育時期為35 d 的花藥愈傷組織的子葉胚獲得率較CK 組顯著下降（P<0.05）。

3 討論

3.1 低溫保存將全年花藥愈傷供應(yīng)時間從60d延長至240d

花藥愈傷組織是良好的遺傳轉(zhuǎn)化受體，馬來西亞[10-12]、印度[4]、我國[13]均通過轉(zhuǎn)化花藥愈傷組織獲得了轉(zhuǎn)基因植株。然而花藥愈傷組織為脫分化愈傷組織，不能通過繼代增殖，需不斷采集外植體。橡膠樹花期集中，不同地區(qū)橡膠樹一年開花2～3 次，每次雄花花期20 d 左右。室外采集外植體的另一個問題是污染率與氣候密切相關(guān)，白粉病高發(fā)季節(jié)外植體污染率高達50%以上，而晴天外植體污染率低于10%。因此在晴天采集外植體誘導(dǎo)愈傷組織，并通過物理化學(xué)方式限制其生長，延長愈傷組織供應(yīng)時間對遺傳轉(zhuǎn)化研究具有重要意義。

限制生長保存的方式有降低培養(yǎng)環(huán)境的氧氣含量、添加滲透調(diào)節(jié)劑或生長抑制劑、膠囊化或脫水、降低培養(yǎng)溫度[14]，其中降低培養(yǎng)溫度減慢細胞代謝活動的同時，存活率高、操作簡單、方便，使用較多。橡膠樹不同愈傷發(fā)育時期（0、7、14、21、28 d）、低溫保存溫度（15、20 ℃）可以延長花藥初代愈傷供應(yīng)時間15～60 d，子葉胚供應(yīng)時間27～95 d。最優(yōu)方案為發(fā)育時期為21 d 的花藥愈傷在15 ℃低溫下保存15 d，可延長花藥愈傷和初代子葉胚供應(yīng)60 d 和60～95 d，該處理雖然降低了46.61%愈傷數(shù)，但促進了子葉胚形成，子葉胚數(shù)提高了27.18%，達顯著水平。說明以該處理低溫保存的花藥愈傷為侵染受體，在侵染量減少46.61%的情況下，其子葉胚數(shù)可提高27.18%，大大提高遺傳轉(zhuǎn)化工作效率。近年來，低溫保存結(jié)合抗氧化劑、低含氧量等方法實現(xiàn)在胚性愈傷組織[15-16]、莖尖培養(yǎng)物[17]、花粉[18]、種子[19-20]、體細胞胚[21]、微型塊莖[22]、帶芽莖段[23]等組織、器官，植株[24]的中短期保存，保存溫度在1～20 ℃，保存時間21 d 至18 個月。通過18 ℃+90 g/L 蔗糖+2 mg/L ABA+10 μmol/（m2·s）低光照可保存棗椰體細胞胚10 個月，存活率接近100%，體細胞胚增殖率高于室溫[21]。通過4～5 ℃+抗氧化劑可保存橡膠樹易碎胚性愈傷25 d，存活率與室溫相近，且恢復(fù)后愈傷細胞活力更強，植株誘導(dǎo)率高于對照組50%，達顯著水平[25]。但橡膠樹易碎胚性愈傷組織誘導(dǎo)時間較長，再生植株生勢弱，沒有商業(yè)價值[8]。

3.2 低溫保存適當(dāng)發(fā)育時期花藥愈傷促進了子葉胚形成

在15 ℃和20 ℃低溫保存后，發(fā)育時期為21 d的花藥愈傷子葉胚獲得數(shù)和子葉胚獲得率與對照組相比均有顯著提高， 子葉胚數(shù)分別提高了27.18%和77.15%。子葉胚獲得率分別提高了25.29%和15.58%。而35 d 的花藥愈傷，15 ℃和20 ℃低溫保存后，在愈傷發(fā)生階段與對照組無顯著差異，但在體細胞胚發(fā)生和子葉胚形成階段與對照組差異顯著，特別是子葉胚形成階段，子葉胚獲得數(shù)分別下降了82.85%和85.73%，子葉胚獲得率分別下降了9.98%和7.97%，幾乎無法獲得子葉胚。橡膠樹花藥愈傷誘導(dǎo)和體細胞胚發(fā)生對溫度非常敏感，在愈傷誘導(dǎo)和分化為球形原胚的過程，26 ℃體細胞胚數(shù)是24 ℃的2.86 倍，而在球形原胚發(fā)育為子葉胚的過程，24 ℃的體細胞胚數(shù)是22 ℃的1.60 倍，是28 ℃的1.25 倍，且28 ℃導(dǎo)致正常胚比例下降[26]。橡膠樹花藥愈傷誘導(dǎo)子葉胚經(jīng)歷5 步：外植體脫分化形成愈傷組織（0～21 d）、體細胞分化為胚性母細胞（21～28 d）、胚性母細胞經(jīng)多次分裂為多細胞原胚（28～42 d）、多細胞原胚發(fā)育為球形胚（42～49 d）、球形胚進一步發(fā)育成子葉胚（52～72 d）[27]。因此，21 d 處于體細胞分化為胚性母細胞時期，此時進行低溫處理，有助于篩選掉胚性弱或畸形的胚性母細胞，提高正常胚性母細胞比例，這些細胞在后續(xù)發(fā)育為子葉胚過程，少了畸形胚的競爭，營養(yǎng)供應(yīng)更充分，因此，21 d 花藥愈傷經(jīng)低溫處理后子葉胚數(shù)及子葉胚獲得率大幅提高。而35 d 的花藥愈傷處于多細胞原胚階段，對溫度非常敏感，推測低溫不利于胚性母細胞發(fā)育為多細胞原胚，因此低溫處理后，35 d 的花藥愈傷體細胞胚數(shù)和子葉型體胚數(shù)及體細胞胚誘導(dǎo)率和子葉型體細胚誘導(dǎo)率大幅下降。低溫提高正常胚比例在牡丹[28]、水曲柳[29]、大豆[30]、鴨茅草[31]也有發(fā)現(xiàn)。后續(xù)將通過解剖學(xué)進一步驗證。

4結(jié)論

（1）在15 ℃和20 ℃低溫保存15 d 后愈傷誘導(dǎo)、體細胞胚發(fā)生各階段除胚性愈傷數(shù)顯著低于對照組外，其余指標與對照組無顯著差異，15 ℃低溫保存各階段指標均低于20 ℃，但差異不顯著；（2）發(fā)育時期對低溫保存后愈傷誘導(dǎo)、體細胞胚發(fā)生各階段均有顯著影響，對子葉胚形成階段影響最大，其中21 d 花藥愈傷組織經(jīng)低溫保存其子葉胚數(shù)量顯著高于對照組，35 d 花藥愈傷組織經(jīng)低溫處理后子葉胚數(shù)量顯著低于對照組（P<0.05）。（3）15 ℃和20 ℃低溫保存15 d 不同發(fā)育時期花藥愈傷組織與對照組相比，可延長花藥初代愈傷供應(yīng)時間15～60 d，初代子葉胚供應(yīng)時間27～95 d。最優(yōu)方案為發(fā)育時期為21 d 的花藥愈傷在15 ℃低溫下保存15 d，可延長花藥愈傷和初代子葉胚供應(yīng)60 d 和60～95 d，該處理雖然降低了46.61%愈傷數(shù)，但促進了子葉胚形成，子葉胚數(shù)提高了27.18%。本研究實現(xiàn)了橡膠樹花藥愈傷的短期保存，有效解決了因花期短導(dǎo)致遺傳轉(zhuǎn)化受體來源不足的困難，全年3 個花季延長受體（花藥愈傷）供應(yīng)時間180 d，加上花季60 d，全年可開展實驗時間由60 d 延長至240 d，有助于加快橡膠樹花藥愈傷遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化研究。