3 種植物精油對調理牛排優勢腐敗菌的抑菌性

摘 要：為明確調理牛排的優勢腐敗菌并篩選出抑菌性、專一性強的植物精油，通過傳統培養基法結合聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳技術篩選出調理牛排的優勢腐敗菌，并通過抑菌圈、最小抑菌濃度、最小殺菌濃度及細菌生長曲線，從丁香精油、豆蔻精油、黑胡椒精油中選出抑菌性最強的植物精油。結果表明：優勢腐敗菌為深藍紫色桿菌（Janthinobacterium lividum）、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）和熱殺索絲菌（Brochothrix thermosphacta）；丁香精油的抑菌圈直徑均大于10 mm，2～4 μL/mL的精油添加量就能明顯抑制優勢腐敗菌的生長繁殖；豆蔻精油抑菌性稍弱；黑胡椒精油對3 株優勢腐敗菌均無明顯抑菌效果。

關鍵詞：調理牛排；優勢腐敗菌；聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳；植物精油；抑菌性能

Inhibitory Effect of Three Plant Essential Oils against Dominant Spoilage Bacteria in Processed Beef Steak

RAN Cenchen1， CUI Haotian1， LIU Yazhi1， YANG Yi2， MU Junchen2， WANG Qingling1，*

（1. College of Food Science， Shihezi University， Shihezi 832003， China;

2. Tumushuk Silk Road Camel Bell Trading Co. Ltd.， Tumushuk 843806， China）

Abstract： The dominant spoilage organisms in processed beef steak were identified by the combined use of the traditional culture method and polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis （PCR-DGGE）. The plant essential oil with the strongest antibacterial activity was selected from clove， cardamom， and black pepper essential oils based on inhibition zone diameter， minimum inhibitory concentrate （MIC）， minimum bactericidal concentration （MBC） and bacterial growth curve. The results showed that the dominant spoilage bacteria in processed beef steak were Janthinobacterium lividum， Pseudomonas putida and Brochothrix thermosphacta; the inhibition zone diameter of clove essential oil against each of these bacteria was greater than 10 mm， and the growth and reproduction of the dominant spoilage bacteria were significantly inhibited by the addition of the essential oil at 2–4 μL/mL; the inhibitory effect of cardamom essential oil was slightly weaker; and the essential oil of black pepper did not have a significant inhibitory effect on any of the three dominant spoilage bacteria.

Keywords： processed beef steak; dominant spoilage bacteria; polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis; plant essential oils; antibacterial properties

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240527-126

中圖分類號：TS251.52 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2024）09-0029-07

引文格式：

冉涔晨， 崔皓天， 劉雅芝， 等. 3 種植物精油對調理牛排優勢腐敗菌的抑菌性[J]. 肉類研究， 2024， 38（9）： 29-35. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240527-126. http：//www.rlyj.net.cnRAN Cenchen， CUI Haotian， LIU Yazhi， et al. Inhibitory effect of three plant essential oils against dominant spoilage bacteria in processed beef steak[J]. Meat Research， 2024， 38（9）： 29-35. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240527-126. http：//www.rlyj.net.cn調理牛排烹飪簡單、方便快捷、營養美味，備受消費者青睞，然而，在其加工及銷售過程中，由于自溶酶和微生物的作用，會不斷積累醛、酮、胺等有害物質，導致牛肉顏色、質地、氣味發生劣變，不適宜消費者食用[1-3]。在肉類微生物菌群中，優勢腐敗菌能夠在低溫和長時間貯藏條件下大量增殖，占據主導地位，最終導致食品腐敗[4-5]。

目前，傳統培養基分離仍是篩選優勢腐敗菌最常見的方法，但其分離出的菌株往往不能代表微生物菌群的真實分布情況。聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術可以通過監測微生物菌群組成變化判斷樣本中的優勢菌，常用于研究白酒釀造[6]、陳醋醋醅[7]、土壤中的微生物菌群結構及種群分析，但該技術無法檢測出DNA含量＜1.5%的物種，在全面揭示菌群多樣性上具有一定局限性[6]。已經有學者通過MRS平板分離結合PCR-DGGE技術監測真空包裝豬肉的貯藏期，得到了優勢菌群（清酒乳桿菌）[8]。因此，傳統培養基結合PCR-DGGE技術確定調理牛排中的優勢腐敗菌，進行特異性防腐是解決其貨架期較短的有效措施。

植物精油是從種子、花、莖、葉、果實中提取的具有特征香氣的揮發性液體，具有很強的生物活性[9]，可以抑制由腸沙門氏菌和大腸桿菌侵害及蛋白質和脂質氧化引起的食品腐敗、變質，是天然的抗菌劑和抗氧化劑，常被用來替代合成防腐劑[10]。Manjankattil等[11]發現，在火雞肉中添加辣椒精油能夠有效抑制其生產和加工過程中的耐藥沙門氏菌生長。Buckiuniene等[12]用羅勒精油腌制牛肉糜，發現處理后的牛肉蒸煮損失和霉菌/酵母數量比值顯著降低，牛肉品質得到顯著提升。此外，Kasi等[13]發現在花生油中添加具有強抗氧化活性（2，2’-聯氮-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）陽離子自由基清除能力）的生姜精油，能降低其受黃曲霉毒素污染的風險，并有效延長保質期。然而，植物精油對調理牛排優勢腐敗菌的抑菌性研究卻鮮有報道。

基于此，本研究擬通過傳統培養基法結合PCR-DGGE技術驗證調理牛排貯藏期間的優勢腐敗菌，并引入丁香精油（clove essential oil，CEO）、豆蔻精油（cardamom seeds essential oil，CSEO）及黑胡椒精油（blank pepper essential oil，BPEO），以期通過抑菌實驗篩選出一種高效、精準抑菌的植物精油，為調理牛排的特異性防腐提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷鮮調理牛排（牧童村菲力牛排）購于石河子市友好超市。

PDA馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基、LB肉湯培養基、MRS、STAA、CFC固體培養基、PCA技術瓊脂培養基、VRBA結晶紫中性紅膽鹽培養基 青島高科技工業園海博生物技術有限公司；瓊脂（分析級） 國藥集團化學試劑有限公司；細菌DNA提取試劑盒（50 preps）、2×Taq Master Mix 北京天根生化科技（化工）有限公司；CEO、CSEO、BPEO 多特瑞商貿有限公司；Gel-Green DNA染色劑、TE緩沖液 上海麥克林生化科技股份有限公司；1×TAE電泳緩沖液 美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 儀器與設備

LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療機械廠；S100 Themal Cycler PCR擴增儀、UniversalHood11凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司；ZHWY-118落地普通型大容量恒溫培養振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；DCodeTM System DGGE儀孚約生物科技（上海）有限公司；ChemiScope 6100化學發光儀 上海勤翔科學儀器有限公司；CX23LEDRFS1C生物顯微鏡 奧林巴斯（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 腐敗微生物的分離純化

無菌條件下稱取調理牛排20 g，放入裝有180 mL生理鹽水的均質袋中。密封后于拍擊式均質器中破碎，每20 min停歇10 min，避免過熱，重復2 次。取1 mL原液進行梯度稀釋，選取3 個合適稀釋度的樣品分別涂布于各選擇性培養基上培養。挑取培養基上大小、形狀、顏色不同的菌落，通過平板劃線法對其進行純化，得到單一菌落。各選擇性培養基的目標腐敗菌和培養條件如表1所示。

1.3.2 細菌16S rDNA鑒定

采用DNA提取試劑盒提取腐敗菌的DNA，以通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-TACCTTGTTACGACTT-3’）[14]對目標細菌的V3區進行PCR擴增。50 μL PCR擴增體系：2×Taq Master Mix 25 μL，DNA模板1 μL，引物（10 μmol/L）各1.5 μL，ddH2O 21 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環；最后72 ℃再延伸10 min[15]。PCR擴增產物通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將條帶清晰的擴增產物送往生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，通過www.NCBI.nlm.gov./blast網站進行序列同源性比對。

1.3.3 PCR-DGGE分析

1.3.3.1 微生物總基因組DNA提取樣品處理同1.3.1節，采用細菌DNA提取試劑盒提取4 ℃貯藏6 d調理牛排的總DNA。

1.3.3.2 PCR擴增

PCR-DGGE技術根據蘆文娟[16]的方法稍作修改。PCR擴增采用帶GC夾子的特異性引物U968-GC（CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGGAACGCGAAGAACCTTAC）和L1401（CGGTGTGTACAAGACCC）對細菌16S rDNA的V6～V8區進行PCR擴增。25 μL PCR擴增體系為：2×Taq Master Mix 12.5 μL，DNA模板1 μL，引物

（10 μmol/L）各1.5 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32 個循環；最后72 ℃再延伸10 min。

1.3.3.3 DGGE

使用8%聚丙烯酰胺凝膠，采用40%～60%的變性膠。將灌好膠的玻璃板放入電泳槽內升溫至60 ℃，130 V預跑膠20 min。點樣20 μL，200 V、90 mA高壓預跑膠10 min后，85 V、50 mA恒壓下電泳16 h。電泳結束后，將變性膠放入50 mL 1×TAE電泳緩沖液（含5 μL Gel-Green DNA染色劑）染色30 min。用ddH2O漂洗2～3 次后用化學發光儀系統拍照。

1.3.3.4 DGGE條帶回收與測序

DGGE產物的回收參考曾玲等[17]的方法。將變性膠置于紫外條件下，用無菌手術刀切下各泳道的主要條帶，溶于盛有20 μL TE緩沖液的PE管中，4 ℃過夜提取DNA。以回收的DNA為模板，以U968（AACGCGAAGAACCTTAC）（無GC夾子）和L1401（CGGTGTGTACAAGACCC）為引物進行擴增。PCR擴增體系和條件同1.3.3.2節。

1.3.4 CEO、CSEO、BPEO抑菌性能測定

1.3.4.1 抑菌圈直徑

抑菌圈的測量采用趙楠楠[18]的方法并稍作修改。將優勢腐敗菌接種于LB瓊脂培養基，37 ℃培養24 h。用無菌生理鹽水調節制成106 CFU/mL的菌懸液，置于4 ℃冰箱備用。用無菌棉簽蘸取菌液，在培養基上劃線涂布。將6 mm的無菌空白藥敏紙片放置于培養基上，分別滴加10 μL CEO、CSEO、BPEO，每皿4 片，以無菌生理鹽水為空白對照。在4 ℃冰箱中放置4 h，使精油在含菌平板上自紙片中心向外圍擴散，隨后放入各溫度培養箱培養16～24 h。用游標卡尺測量抑菌圈直徑。抑菌作用判斷：抑菌圈直徑＞20 mm為高度敏感；10～20 mm為中度敏感；6～10 mm為低度敏感；＜6 mm為無抑菌作用[19]。重復3 次實驗均有抑菌作用的結果判為合格。

1.3.4.2 最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentrate，MIC）和最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentrate，MBC）

采用二倍稀釋法測定精油的MIC與MBC[20]。分別吸取一定量的CEO、CSEO、BPEO，加入1%（V/V）吐溫-80無菌水溶液，使其體積濃度為64 μL/mL。吸取1 mL上述植物精油溶液，加入LB培養基，將其體積濃度依次稀釋為32.0、16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5 μL/mL，最后一管移取1 mL植物精油溶液。每個試管中加入等體積的菌懸液，在培養箱中培養16～24 h，若溶液呈現澄清狀態，對應的植物精油體積濃度則為MIC。蘸取澄清試管中的溶液劃線，24 h未長菌的植物精油體積濃度即為MBC。

1.3.4.3 細菌生長曲線

各精油的細菌生長曲線通過光密度測定，參考王若男[21]的方法并稍作修改。吸取一定量的植物精油和菌懸液置于酶標板，使精油體積濃度分別為MIC和2MIC，放入培養箱培養，每隔2 h取出測定OD600 nm。實驗重復操作3 次，每次設置3 個平行，記錄并繪制生長曲線。

1.4 數據處理

使用IBM SPSS Statistics 26.0對實驗數據進行單因素方差分析，結果用平均值±標準差表示，并以Duncan檢驗進行顯著性（以P＜0.05為差異顯著）標記。

2 結果與分析

2.1 調理牛排腐敗菌分離鑒定結果

對腐敗末期調理牛排的微生物進行分離純化，結果如表2所示。從6 種傳統培養基中共分離純化得到10 株菌，其中PDA、STAA培養基各1 株，VRBA、CFC、PCA、MRS培養基各2 株。但是，采用培養基分離篩選出的菌株往往不能代表微生物的真實分布情況，也無法僅憑此判斷優勢腐敗菌。因此，優勢腐敗菌的確定還需要進一步驗證。

2.2 PCR-DGGE分析調理牛排菌群變化

DGGE指紋圖譜上的1 個水平條帶代表1 個微生物類群，條帶越多表示樣品中的微生物多樣性越豐富[22]。其中，條帶越亮，則表示該種菌的數量相對越多。調理牛排作為冷鮮食品，其最佳食用期為2～3 d。從第3天開始，牛肉品質開始下降，表面略微變綠，質地松散，回彈緩慢，處于次鮮肉，已不適宜消費者食用。從4 d開始，肉制品底部滲出惡臭血水，不能食用。Sul等[23]在研究牛肉的貯藏期時也發現了相似的變化。因此，提取調理牛排6 d內的總菌落DNA，進行DGGE，分析菌落的變化及微生物演替過程。

圖1顯示，在4 ℃低溫貯藏過程中，微生物菌群具有一定的差異性和動態演替。在貯藏初期（1～3 d），樣品還在可食用范圍內，樣品中的初始菌相并不復雜，微生物數量不多，這說明冷藏起到了暫時性的保鮮效果，延緩了細菌的繁殖速率。隨著貯藏時間延長，條帶由少變多，在末期還出現了一些新的條帶。但是，條帶1、2、3貫穿整個貯藏期，且亮度并未隨著時間的延長而變暗。在后期，條帶4、5、6、7、8開始逐漸由暗變亮，這說明冷藏能夠在一定程度上抑制這些微生物生長，但并不能完全抑制。隨著貯藏時間延長，抑菌效果逐漸減弱，微生物快速繁殖，導致調理牛排加速腐敗變質。因此，確定條帶1、2、3為調理牛排的優勢腐敗菌。

2.3 DGGE分離鑒定結果

如表3所示，在DGGE譜圖中，條帶較弱的DNA未檢測出菌株類別，只檢測到菌屬水平。其中條帶1、2、3分別為深藍紫色桿菌、惡臭假單胞菌和熱殺索絲菌，即調理牛排中的優勢腐敗菌。先前的研究結果表明，假單胞菌屬是導致冷鮮肉產生不良氣味和腐敗變質的主要菌群[24]。

2.4 3 種植物精油的抑菌性能評價

2.4.1 抑菌圈直徑測定結果

通過測定3 種植物精油對優勢腐敗菌的抑菌圈直徑，初步篩選出具有優良抑菌效果的植物精油。由表4可知，CEO對3 株腐敗菌均有明顯抑菌性。其中，對熱殺索絲菌的抑制效果最為顯著（P＜0.05），抑菌圈直徑為13.900 mm。CSEO的抑菌效果稍弱，對深藍紫桿菌的抑菌性顯著高于其他菌（P＜0.05）。而BPEO對3 株菌均無抑菌效果。因此，可以初步判斷CEO的抑菌性最強。

吳天琳[25]比較60 種植物精油對立枯絲核菌、核盤菌、灰葡萄孢等6 種植物病原真菌的體外抗菌活性，發現CEO對6 株菌的抑制率最高，均達到100%；CSEO抑菌性稍弱，抑制率最高為69.54%；黑胡椒精油抑菌性最弱，抑菌性最高為55.28%。

綜上，可以初步判斷，CEO的抑菌效果最強。這可能是由于其主要成分為丁香酚、百里香酚、肉桂醛和石竹烯[26]等芳香環和酚類物質，能夠與膜蛋白相互作用，誘導生物分子從細胞內部流失，影響電子傳遞、酶活性和蛋白質合成[27-28]，從而抑制微生物生長繁殖。有相關研究報道，酚類物質在不同體積濃度下對微生物的抑菌機制有所差異。在低體積濃度下，酚類物質的抑菌性能主要通過抑制酶活體現，而在高體積濃度下則通過誘導蛋白質變性實現高效抗菌[29]。CSEO的主要成分是黃酮類、生物堿和花青素[30]，通過攻擊細菌細胞膜，引起細菌內蛋白質、ATP和DNA的泄漏[31]。而深藍紫色桿菌和惡臭假單胞菌均屬于革蘭氏陰性菌，細胞膜外層的肽聚糖作為細胞保護結構[32]，從而減緩了CSEO的抑菌性。

2.4.2 MIC與MBC測定結果

MIC和MBC為抑制病原微生物繁殖或殺滅病原微生物的最小藥物濃度。由表5可知，總體來看，CEO的MIC和MBC最低，2 μL/mL的精油添加量就具備明顯的抑菌效果。3 種優勢腐敗菌中，CSEO對深藍紫色桿菌的抑菌效果最強，這與上述抑菌圈結果一致。在精油添加量為最大體積濃度（32 μL/mL）時，CSEO與惡臭假單胞菌、熱殺索絲菌的細菌培養液在培養16～24 h后仍然渾濁，說明在此精油添加量下，CSEO沒有發揮出抑菌效果。通過抑菌圈、MIC和MBC實驗結果可以明確，BPEO對3 株優勢腐敗菌均未表現出抑菌效果，所以通過細菌生長曲線進一步比較CSEO、CEO的抑菌性能強弱。

2.4.3 優勢腐敗菌生長曲線

OD600 nm可以直接或間接反映樣品中細菌的生長

情況[33]。由圖2可知，未被CEO處理的各優勢腐敗菌生長情況符合典型的細菌生長曲線。由圖2a可知，MIC和2MIC體積濃度的CEO在8 h內就能抑制90%的深藍紫色桿菌生長，并且在較長時間內使其維持較低的生長活性。相比之下，2MIC體積濃度的CEO具有更強的抑制效果，在12～20 h還能持續降低細菌的OD600 nm。從

圖2b可以明顯觀察到，惡臭假單胞菌的細菌生長趨勢為空白對照組＞MIC處理菌懸液＞2MIC處理菌懸液，與熱殺索絲菌一致（圖2c），都證明CEO能夠有效抑制優勢腐敗菌的生長。

由圖3a可知，2MIC體積濃度的CSEO能夠作用于深藍紫色桿菌的對數生長期，使其生長繁殖受到抑制。抑菌圈實驗表明，CSEO對熱殺索絲菌和惡臭假單胞菌具有低敏抑菌性。但在進行MIC和MBC實驗時，即使在最大精油添加量下，CSEO對2 株優勢腐敗菌均未表現出抑菌性。因此，以最大精油添加量（32 μL/mL）進行細菌生長曲線實驗，進一步研究CSEO對這2 株菌的生長抑制效果。由圖3b、c可知，添加精油的細菌生長曲線與對照組一致，無抑菌性。綜上所述，針對3 株優勢腐敗菌，CEO為抑菌性最強的植物精油。

3 結 論

通過傳統培養基分離腐敗菌株，結合PCR-DGGE技術對調理牛排腐敗貯藏過程中微生物的消長規律和菌群變化進行檢測，明確優勢腐敗菌為深藍紫色桿菌、惡臭假單胞菌和熱殺索絲菌。針對優勢腐敗菌，再通過抑菌圈、MIC、MBC和細菌生長曲線從CEO、CSEO和BPEO 3 種香辛料植物精油中篩選出抑菌性最強的植物精油為CEO，為后續調理牛排的防腐保鮮提供了參考。

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