二維相關紅外光譜技術解析牛肉熱加工過程中蛋白質二級結構變化

摘 要：利用傅里葉變換紅外光譜和近紅外（near-infrared，NIR）光譜技術，對60～120 ℃下加熱0～15 min的66 個牛肉樣品進行光譜分析，并通過二維相關光譜技術揭示蛋白質結構的動態演變過程。結果顯示，隨著加熱溫度的上升，酰胺A帶和酰胺I帶的吸收峰發生位移，N—H和C—N的振動增強。β-折疊相對含量增加，β-轉角相對含量降低，蛋白質二級結構的變化時序為β-轉角、β-折疊、α-螺旋、無規卷曲。此外，基于NIR光譜數據構建的牛肉蛋白二級結構（α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲）含量預測模型具有高精度的預測能力（校正相關

系數＞0.9）。本研究基于大量樣本揭示了牛肉加熱過程中蛋白質二級結構的變化規律，而且為實現快速、無需復雜預處理的肉類產品蛋白質結構分析提供了有效的技術路徑。

關鍵詞：牛肉；加熱；二級結構；二維相關光譜；近紅外光譜

Analysis of Changes in Protein Secondary Structure during Thermal Beef Processing by

Two-Dimensional Correlated Infrared Spectroscopy

XIE Anguo1， WANG Tingmin2， ZHANG Qinhua1， LI Chao1， WANG Mansheng3，*

（1. Zhang Zhongjing School of Chinese Medicine， Nanyang Institute of Technology， Nanyang 473004， China;

2. Sichuan Manwei Longchu Biotechnology Co. Ltd.， Meishan 620000， China;

3. Institute of Bast Fiber Crops， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410205， China）

Abstract： This study used Fourier transform infrared （FTIR） spectroscopy and near-infrared （NIR） spectroscopy to analyze 66 beef samples heated for 0–15 min at 60 to 120 ℃， and revealed the dynamic evolution of protein structure by two-dimensional correlation spectroscopy （2D-CoS）. The results showed that as the heating temperature increased， the absorption peaks of amide A and amide I bands shifted， and the N–H and C–N vibrations increased. Moreover， the relative content of β-sheet increased and the relative content of β-turn decreased. The sequence of changes in the secondary structure of proteins was β-turn， β-sheet， α-helix and random coil. In addition， a predictive model for protein secondary structure （α-helix， β-sheet， β-turn and random coil） contents was constructed based on NIR spectroscopy data， which was demonstrated to have high predictive ability （corrected correlation coefficient gt; 0.9）. In conclusion， this study provides an effective technical approach for fast structural analysis of proteins in meat products without the need for complex sample pretreatment.

Keywords： beef; heating; secondary structure; two-dimensional correlation spectroscopy; near infrared spectroscopy

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240527-127

中圖分類號：TS251.1" " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " "文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2024）08-0001-07

引文格式：

謝安國， 王廷敏， 張芹華， 等. 二維相關紅外光譜技術解析牛肉熱加工過程中蛋白質二級結構變化[J]. 肉類研究， 2024， 38（8）： 1-7. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240527-127." "http：//www.rlyj.net.cn

XIE Anguo， WANG Tingmin， ZHANG Qinhua， et al. Analysis of changes in protein secondary structure during thermal beef processing by two-dimensional correlated infrared spectroscopy[J]. Meat Research， 2024， 38（8）： 1-7. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240527-127." "http：//www.rlyj.net.cn

在全球肉類消費市場中，牛肉以其較高的蛋白質含量、全面的營養價值、較高的消化吸收率及較低的膽固醇和脂肪含量[1-2]，成為備受青睞的3大主要肉類之一。隨著社會經濟的持續發展和居民生活水平的逐步提高，消費者的飲食習慣和健康意識不斷升級，對肉制品的質量安全和營養價值提出了更為精細化的要求[3]。在此背景下，牛肉加工業面臨新的技術挑戰，尤其是在熱加工工藝中，不恰當的處理方法可能導致牛肉中的營養成分不可逆流失，同時伴隨脂質和蛋白質的氧化[4]，這些生物化學變化對牛肉產品的最終品質特性造成了實質性的影響。

牛肉中的蛋白質不僅是肌肉組織的主要構成成分，而且其二級結構的穩定性對產品的品質至關重要。在熱處理過程中，牛肉蛋白質往往會經歷不同程度的變性或降解[5]。當蛋白質的空間結構遭受破壞時，其二級結構的含量也會隨之發生變化。研究表明，部分蛋白質變性會影響蛋白質的溶解性和膠體性質[6]。這種結構變化不僅影響肉品的保水性能[7]，還會影響肉品的色澤，如肌紅蛋白的α-螺旋含量減少、β-折疊結構變化和無規卷曲含量的增加[8]。類似的研究也揭示了蛋白質二級結構與肉品營養品質之間的密切聯系[9]。例如，大豆蛋白中α-螺旋和無規卷曲含量的增加與蛋白質體外消化率的提升呈正相關，而β-折疊含量的增加則與之呈負相關。因此，快速且準確地監測熱加工過程中蛋白質二級結構的變化，對于實時掌握肉品品質的變化具有重要意義。

目前用于肉品蛋白質結構分析檢測的方法有X射線衍射法、熒光法、紫外法、圓二色譜法[10-11]、核磁共振法、傅里葉變換紅外（Fourier transform infrared，FTIR）光譜及近紅外（near infrared，NIR）光譜技術等，但這些方法均存在一定的局限性。相較而言，FTIR光譜法具有操作簡單、靈敏度高、分辨率好、掃描速率快、信噪比高、能檢測蛋白質結構微小變化、可得到幾乎所有生物蛋白質的紅外光譜圖及樣品用量較少等優點，被廣泛應用于肉制品檢測中[12]。然而，峰的嚴重重疊限制了中紅外和NIR光譜對蛋白結構識別及其氫鍵形成機理研究。二維光譜相關分析是將一維的光譜在二維上展開，可將很多重疊峰簡單視覺化，從而提高光譜的分辨率及重疊峰的分離度[13]，此外，由于可以得到二級結構和氫鍵變化的先后順序，有利于研究蛋白二級結構及氫鍵的形成，也可直觀反映蛋白質反應的動力學性質。

盡管二維相關紅外光譜技術在眾多領域已展現出其獨特的分析潛力，但在肉品科學領域，特別是在牛肉蛋白質熱加工過程中的應用仍較少。本研究選取經不同熱處理的牛肉樣品作為實驗對象，通過大量樣本系統性探索牛肉加熱過程中的光譜與蛋白質結構的動態變化，并構建NIR光譜與蛋白質二級結構含量的回歸模型。為進一步提升光譜數據的分析精度，本研究采用多種預處理算法，包括移動窗口平滑（moving average，MA）、savitzky-golay（SG）卷積平滑、多元散射校正（multiplicative scatter correction，MSC）及標準正態變量變換（standard normal variate，SNV），對原始光譜數據進行精細化預處理。基于經預處理的光譜數據，構建偏最小二乘（partial least squares，PLS）回歸模型，用于預測牛肉蛋白質二級結構的含量，并通過比較不同預處理方法的效果，篩選出最優的光譜預處理策略。旨在為實現快速、無損的牛肉蛋白質二級結構分析提供創新的方法論基礎，為肉品加工行業的質量控制和產品研發提供科學依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牛里脊肉購自當地生鮮超市。

KBr（分析純） 上海捷世凱生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Vector 33型FTIR光譜儀 德國Brucker公司；MINI20-015V-I型低場核磁共振成像分析儀 上海紐邁電子科技有限公司；JA5003B型電子分析天平 上海精科儀器有限公司；DHG9425A型鼓風干燥箱 上海一

恒科學儀器有限公司；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 河南省予華儀器有限公司；Pilot3-6M型真空冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛肉加熱處理

將新鮮牛里脊肉剝去表面的筋膜和脂肪，肉樣切割為4 cm×4 cm×2 cm的塊狀，分裝于食品級錫箔袋中，并將樣品置于不同加熱溫度（60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120 ℃）的油浴鍋中分別加熱3、6、9、12、15 min，共產生65 項加熱實驗組合，1 組未加熱的鮮肉作為對照樣品。熱加工處理后的牛肉樣品室溫冷卻后置于4 ℃冰箱待測。

1.3.2 NIR光譜采集

通過FTIR光譜儀采集牛肉熱加工后的NIR光譜[14]。采集光譜范圍：10 000～4 000 cm－1（780～2 500 nm）；掃描次數：64 次；分辨率：8 cm－1。采用漫反射的方式采集光譜，每個樣品采集光譜3 次，取平均值為樣本光譜。共掃描66 份樣本，其中校正集和預測集樣本分別為44、22 個。

1.3.3 中遠紅外光譜采集

將經不同加熱處理的牛肉樣品放置于真空冷凍干燥機中干燥48 h，取出后磨成牛肉粉備用。準確稱取1 mg牛肉粉，加入100 mg KBr，混勻研磨成細小粉末，然后用壓片機將其壓制成透明薄片。在4 000～400 cm－1的波數范圍內，用FTIR光譜儀掃描牛肉樣品，掃描信號累積64 次。通過使用Peakfit 4.1軟件對酰胺I帶進行去卷積并結合曲線擬合估算牛肉蛋白的二級結構相對含量[15]。計算α-螺旋相對含量的波數范圍為1 650～1 660 cm－1，β-折疊為1 600～1 640 cm－1，β-轉角為1 660～1 695 cm－1，無規卷曲為1 640～1 650 cm－1。

1.3.4 光譜預處理

采集全波段的光譜數據，使用MA、SG、MSC和SNV方法在采集區間780～2 500 nm對所采集原始光譜數據進行預處理，考察不同預處理方法所得的訓練集建模決定系數（Rc2）及校正均方根誤差（root mean square error of calibration，RMSEC）。最后，使用PLS分別對牛肉的品質特性進行建模研究。

1.3.5 預測模型構建

采用Unscramb分析軟件對NIR原始光譜數據進行預處理，在建立模型的過程中，根據預測集建模決定系數（Rp2）及預測均方根誤差（root mean square error of prediction，RMSEP）等指標對模型進行評價[16]及優化完善，選取最佳模型。

1.4 數據處理

采用SPSS軟件分析數據的差異顯著性，2D-shige軟件進行光譜的二維相關分析。

2 結果與分析

2.1 牛肉加熱過程中的中遠紅外光譜分析

在熱加工過程中，牛肉的紅外光譜圖見圖1（4 000～400 cm－1），各譜帶的歸屬[17]見表1。

由圖1d可知，經不同溫度加熱處理后，與鮮樣相比，熱處理12 min牛肉蛋白的酰胺A帶從3 290 cm－1紅移至3 281 cm－1附近，這可能是因為酰胺A帶的N—H伸縮振動與氫鍵形成締合體，從而向低波數位移，表示氫鍵發生變化，此結果與化學法測定氫鍵含量的結果相吻合[18]。與鮮樣相比，熱處理9 min后1 656 cm－1處α-螺旋的特征吸收峰紅移至1 652 cm－1（圖1c），且隨溫度的增加，吸收峰繼續紅移。加熱15 min后1 543 cm－1的酰胺II帶特征吸收峰隨著加熱溫度的升高而逐漸變寬，表明在酰胺II帶中發生N—H彎曲和C—N伸縮振動。而在1 245 cm－1的酰胺III帶，隨著加熱時間的延長，譜帶均發生紅移，接近1 233 cm－1處（圖1e）。這與鄧麗等[19]研究鮑魚腹肌蛋白熱加工過程中的紅外光譜變化結果一致，表明酰胺III帶也在熱加工中發生了結構變化。

2.2 加熱溫度與時間對牛肉蛋白二級結構相對含量的影響

通過使用Peakfit 4.1軟件對酰胺I帶進行去卷積并結合曲線擬合計算牛肉蛋白α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲等二級結構相對含量[20]。對照組α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲的相對含量分別為14%、28%、45%和13%，這表明β-轉角是牛肉主要的二級結構。由

圖2可知，在加熱處理下，牛肉蛋白中的β-折疊和β-轉角相對含量變化明顯，α-螺旋和無規卷曲的相對含量變化不明顯。觀察加熱溫度對牛肉蛋白二級結構相對含量的影響，由圖2a可知，隨熱處理溫度升高，α-螺旋和無規卷曲相對含量緩慢增加，β-折疊相對含量明顯升高，當加熱溫度達到120 ℃時，與對照組相比，其相對含量從28%升至41%，而β-轉角相對含量下降至30%，下降約1/3。二級結構相對含量的變化說明熱處理使牛肉蛋白的β-轉角

向β-折疊轉化。對比加熱時間對二級結構相對含量的影響，整體趨勢為加熱時間的延長使β-折疊的相對含量先增加后減小；β-轉角先減小后增加，以100 ℃組為例，加熱15 min后β-轉角相對含量又增至34%（圖2e）。可看出加熱溫度對二級結構相對含量的影響大于加熱時間。

隨著加熱溫度的升高和時間的延長，由于氫鍵的變化，α-螺旋的一部分被打開[21]。加熱處理初期形成的未折疊和變性蛋白質可能會發生某種重新結合或聚集，這是由于蛋白質分子之間的氫鍵逐漸減少，分子之間的相互作用逐漸減弱。在60、80 ℃低溫加熱初期由于體積減小，疏水結合和離子結合被切斷，導致蛋白分子的展開和非極性基團的暴露，最終使得β-折疊相對含量逐步增加，

β-轉角相對含量略微降低。在加熱后期β-折疊相對含量迅速升高，β-轉角相對含量直線下降，這尤其體現在80 ℃加熱樣品中。而牛肉在高溫（100、120 ℃）加熱初期二級結構相對含量就發生較大變化。結合牛肉的結構可推知，60～80 ℃時對熱敏感的分子受到影響，如水溶性蛋白質開始變性失活，半結合水發生遷移；但依然有大量基團保持穩定。蛋白質空間結構直到100～120 ℃的高溫才被進一步破壞，大量氫鍵斷裂及疏水基團暴露[22]。

在相同溫度下，隨加熱處理時間的延長，無規卷曲相對含量由13%緩慢增大至14%～15%。這可能是由于超高壓處理下溶劑分子和氨基酸殘基的各種分子電離，以及基團間溶劑化作用的增加。此外，離子鍵的斷裂也會引起電致伸縮，并減小蛋白質分子的體積，導致牛肉蛋白結構的改變。

2.3 牛肉加熱過程中的二維中遠紅外相關光譜分析

為研究加熱過程不同官能團及其對應有機物的變化規律，以加熱溫度為外界擾動，利用2D-shige軟件分析不同加熱條件下牛肉樣品的紅外光譜，得到圖3所示的二維相關光譜。

在同步圖中，以加熱溫度為變量，正峰代表紅外光譜中與官能團的變化方向一致的行為，而負峰代表紅外光譜中與官能團的方向變化相反的行為[23]。根據Noda法則[24]，在異步譜圖中，坐標（x，y）處的正峰意味著波數x處的光強變化早于y處。如果在（x，y）處有1 個負峰，意味著波數x處的光強變化慢于y處。圖3a為牛肉熱加工過程中紅外光譜經二維相關分析所得的同步圖，主要在1 610/1 610、1 645/1 645、1 655/1 655、1 680/1 680 cm－1附近出現4 個自相關峰，其峰強度依次為1 610/1 610＞1 645/1 645＞1 680/1 680＞1 655/1 655 cm－1。其中1 610/1 610 cm－1處歸屬于β-折疊，且是正峰，說明官能團與牛肉加熱過程的變化方向相同[25]。1 645/1 645、1 655/1 655、1 680/1 680 cm－1處均為負峰，它們分別歸屬于無規卷曲、α-螺旋和β-轉角，且變化方向與牛肉加熱過程相反。在異步圖中，1 690～1 700/1 600～1 620、1 690～1 700/1 600～1 650、1 690～1 700/1 640～1 645、1 600～1 620/1 650～1 660、1650～1660/1640～1645 cm－1處均為正交叉峰，顯示1 690～1 700、1 600～1 620、1 650～1 660 cm－1處的吸收峰隨加熱溫度的變化早于1 600～1 620、1 600～1 650、1 640～1 645 cm－1處的吸收峰（圖3b）。根據Noda法則[26]，可以推斷出肌肉蛋白在受熱過程中特征峰的變化時序為1 680 cm－1＞1 610 cm－1＞1 655 cm－1＞1 645 cm－1，即二級結構的變化時序為β-轉角、β-折疊、α-螺旋、無規卷曲。

2.4 牛肉加熱過程中NIR光譜與中遠紅外的異質二維相關光譜分析

二維異質相關光譜常被用于檢測2 種不同光譜的共變特征，正相關說明2 種不同光譜強度變化一致或存在相似來源[27-28]。NIR和FTIR光譜之間的異質二維相關光譜圖能夠進一步體現牛肉加熱過程中有機質官能團與有機碳結構的關聯。圖4a中橫坐標NIR光譜1 430、1 685 nm波長附近可觀察到6 個較明顯的正相關峰，說明這2 處光譜與C—H面外彎曲振動（900 cm－1）、酰胺I帶C＝O的伸縮振動（1 650 cm－1）、炔烴伸縮振動（2 150 cm－1）及酰胺A帶N—H的伸縮振動（3 280 cm－1）存在相似來源。在圖4b中，NIR光譜的945 nm附近的正相關峰表明4 倍頻O—H（945 nm）變化早于C—H面外彎曲振動（900 cm－1）和酰胺I帶C＝O的伸縮振動（1 650 cm－1）。需特別注意的是，NIR光譜技術用于檢測含水狀態下的牛肉樣本，而FTIR光譜則應用于冷凍干燥后的牛肉樣品。通過二維異質相關光譜分析，可以確認O—H（945 nm）的變化發生在蛋白質結構變化之前，這一發現有力地支持了本團隊前期研究成果[29]，即在受熱條件下，肉類產品中的半結合水會迅速發生變化。

2.5 牛肉蛋白二級結構含量的預測模型構建

在780～2 526 nm波長范圍內觀察到很多噪音，這些噪音不僅包含無用的信息，而且還影響預測模型的準確性和精度。因此，需要對收集到的原始NIR光譜進行預處理，以改善光譜特性，消除光譜中包含的無用信息，從而提高模型的性能。為確定最佳預處理方法，將不同預處理后的NIR光譜數據作為輸入變量，牛肉蛋白二級結構（α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲）含量作為響應變量建立PLS模型。建模決定系數越接近1，說明該模型的預測精度越高[30]；RMSEC和RMSEP越小，說明該模型的預測結果越準確[31]。

2.5.1 α-螺旋含量NIR光譜預測模型

由表2可知，當采用SNV對光譜進行預處理時，可建立Rc2為0.983、Rp2為0.944的最優預測模型。

2.5.2 β-折疊含量NIR光譜預測模型

由表3可知，當采用MSC對光譜進行預處理時，可建立Rc2為0.989、Rp2為0.980的最優預測模型。

2.5.3 β-轉角含量NIR光譜預測模型

由表4可知，當采用MSC對光譜進行預處理時，可建立Rc2為0.993、Rp2為0.983的最優預測模型。

2.5.4 無規卷曲含量NIR光譜預測模型

由表5可知，當采用MSC＋SNV對光譜進行預處理時，可建立Rc2為0.955、Rp2為0.910的最優預測模型。

通過對蛋白質4 種二級結構含量的光譜檢測，可知β-折疊和β-轉角含量的模型預測準確率高，對α-螺旋和無規卷曲含量的預測準確率稍低，這與β-折疊和β-轉角含量在牛肉蛋白質中的含量較高且在熱加工過程中含量變化較大有關。

3 結 論

本研究運用FTIR和NIR光譜技術對牛肉在不同溫度下的紅外吸收光譜進行解析，以捕捉其特征波譜信息。隨后，引入二維相關光譜技術，深入探究牛肉加熱過程中官能團隨時間的變化規律。結果表明：1）在牛肉熱加工過程中，β-折疊相對含量增加，β-轉角相對含量降低，α-螺旋和無規卷曲相對含量變化不明顯，推斷蛋白質中一部分β-轉角結構受熱時轉變為β-折疊；2）二維相關光譜技術解析出水分結構（O—H）的變化發生在蛋白質結構變化之前，此后蛋白質二級結構的變化時序為β-轉角→

β-折疊→α-螺旋→無規卷曲，這一新的研究成果能夠加深對肉類產品在熱處理過程中水分和蛋白質結構變化機制的理解；3）NIR光譜技術能夠對含水的肉塊蛋白質二級結構進行快速、無需預處理的檢測。未來研究將關注蛋白質結構變化與肉制品品質的關系，旨在通過光譜技術優化肉類加工和提升消費體驗，為肉品科學與產業應用帶來新進展。

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