基于細胞膜色譜技術的鹿角膠肽段篩選及鑒定

摘要：利用細胞膜色譜/超高相液相色譜-質譜（CMC/UPLC-MS）方法對中藥飲片鹿角膠中的有效成分進行篩選，結合Maxquant軟件、Perseus軟件以及Uniprot數據庫對所得譜圖進行數據分析，使用Protein Data Bank對分析結果進行結構鑒定，同時采用生物信息學平臺對這些肽段的生物活性、不良反應、相對分子質量、等電點、不穩定指數等基本分子特性進行預測。鑒定肽段活性概率為0.09，無毒，無溶血性，有致敏性，相對分子質量為1 541.68，肽鏈長度為14，親水性為良好，等電點值為3.92，不穩定性指數為34.39。該方法為快速篩選鑒定具有藥理作用的多肽和蛋白質等活性成分提供了一條可行的研究思路。

關鍵詞：鹿角膠；細胞膜色譜；骨髓間充質干細胞；白細胞介素-1β

中圖分類號：R284文獻標志碼：A文章編號：1002-4026（2024）05-0001-09

開放科學（資源服務）標志碼（OSID）：

To explore the pharmacodynamic substance basis of Cervi Cornus Colla

based on cell membrane chromatography

SUN Tiefeng1， ZHAO Yu2，WANG Ping1*，DING Xianglong3，DING Lijun4，WANG Jinguo

4

（1.Shandong Academic of Chinese Medicine， Jinan 250014，China； 2.Shandong University of Traditional Chinese Medicine，

Jinan 250355，China； 3.Huangdao District Second Hospital of Traditional Chinese Medicine，Qingdao 266400，China；

4.Rizhao Traditional Chinese Medicine Hospital，Rizhao 276800，China）

Abstract∶Cell membrane chromatography/ultrahigh-phase liquid chromatography-mass spectrometry （CMC/UPLC-MS） was used to screen the active ingredients， i.e.， peptides， in the traditional Chinese medicine tablet Cervi cornus Colla， and the obtained spectra were analyzed using Maxquant software， Perseus software， and Uniprot database. Structures of these peptides were identified using Protein Data Bank， and their molecular properties such as their biological activity， adverse reactions， relative molecular mass， isoelectric point， and stability index were predicted using a bioinformatics platform. With an activity probability of 0.09， the peptides were identified as nontoxic， nonhemolytic， sensitizing， and highly hydrophilic， with a relative molecular mass of 1 541.68， a peptide chain length of 14， an isoelectric point of 3.92， and an instability index of 34.39.This method provides a feasible research approach for rapidly screening and identifying active ingredients（e.g.， peptides and proteins） that exhibit pharmacological effects.

Key words∶Cervi Cornus Colla；cell membrane chromatography；bone marrow mesenchymal stem cells；interleukin-1β

骨質疏松（ostcoporosis，OP）是一種全身性骨病，其病理學主要特征為骨代謝失衡導致的骨過度吸收。根據國家衛生健康委員會在2018年發布的中國骨質疏松癥流行病學調查結果發現，我國40～49歲人群低骨量率達到32.9%［1］。因此找到一種有效促進軟骨重建、修復受損軟骨和恢復關節功能的治療方案已經成為治療OP亟待解決的問題。近年來，隨著對骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）的深入研究，許多學者發現BMSCs在軟骨重建、修復受損軟骨和恢復關節功能上發揮了重要作用［2］。

在中醫的藏象理論中，腎主骨生髓，腎藏精，精生髓，髓充骨，故目前多認為骨質疏松的中醫核心病機為“腎精虧虛”。鹿角膠始載于《神農本草經》，其味甘、咸，性溫，主歸肝、腎經，具有補氣血、益精髓、強筋骨等作用，可以用于治療跌打損傷、腎氣不足、虛勞羸瘦、腰痛等疾病。目前，針對鹿角膠有效成分分離純化方法的研究主要集中在像離子交換色譜、凝膠色譜等分離純化速度較慢的多維色譜上，而對能夠直接篩選純化中藥活性成分的細胞膜色譜技術［3］的研究尚有欠缺，仍需研究人員深入探索。

現代研究發現，利用鹿角膠及其酶解產物可有效誘導BMSCs向成骨細胞分化［4-5］。因此本實驗選取鹿角膠和BMSCs應用細胞膜色譜法，以期對鹿角膠促成骨化的藥效物質進行快速篩選分離純化鑒定。

1材料和方法

1.1材料

（1）細胞：骨髓間充質干細胞（賽業生物科技）。

（2）藥材及主要試劑見表1。

（3）主要儀器見表2。

（4）研究涉及的數據庫和軟件見表3。

2方法

2.1樣品制備

鹿角膠是將鹿角片加水煎煮、濃縮制成的固體狀可食用膠。本研究鹿角片購于國藥樂仁堂河北藥業有限公司，經山東省中醫藥研究院中藥資源研究室林慧彬研究員鑒定為正品，制備方法和鑒別方法按照2020年版《中華人民共和國藥典》［6］“鹿角膠”項下進行。把鹿角片放在圓底燒瓶中，加入水煎煮兩次，合并膠汁，用50 ℃真空減壓濃縮，冷卻到室溫即為鹿角膠，采用輻射滅菌，4 ℃保存。取前期實驗制備好的鹿角膠置高速萬能粉碎機粉碎，過120目篩。精密稱定鹿角膠粉末50 mg，放置25 mL容量瓶中，加蒸餾水定容后，用超聲提取15 min，蒸餾水補足失重［7］，即得鹿角膠水溶液（2 mg/mL）。

精密量取鹿角膠水溶液5 mL，用0.22 μm微孔濾膜濾過，緩慢上樣，依次用10 mL水和10 mL乙腈洗脫［8］，收集洗脫液置于錐形瓶中。將洗脫液減壓濃縮，分別用水和乙腈定容于5 mL容量瓶中，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得樣品。

2.2BMSCs細胞膜色譜固定相的制備

用PBS把BMSCs（細胞濃度為4×107/mL）洗滌3次，而后在-20 ℃反復凍融3次，加10 mL PBS，用1 000 r/min離心10 min，得到細胞懸浮液，棄去沉淀。上清液在4 ℃下使用10 000 r/min離心20 min。把沉淀與5 mL PBS混合（1 mg/mL）后，渦旋5 min，成為細胞膜懸液。將5 mL細胞膜混懸液緩慢加入6 mL的C18固相萃取柱中，于4 ℃下孵育12 h后，混合物用5 mL PBS洗滌3次，即為CMC固定相［9］。對照組固定相為以5 mL PBS溶液緩緩加入C18色譜柱中，于4 ℃孵育12 h后，用5 mL PBS洗滌3次得到的混合物。

2.3UPLC-Q-ExactiveOrbitrapMS實驗條件

2.3.1色譜條件

Water ACQUITY UPLC HSS C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流動相乙腈（A）-0.1%乙酸水溶液（B），梯度洗脫（0 min，95%B；3 min，95%B；9 min，50%B；28 min，5%B；28.1 min，95%B；31 min，0%B），流速0.3 mL/min，進樣量40 μL，柱溫35 ℃。

2.3.2質譜條件

離子源為加熱電噴霧離子源（HESI），掃描模式為一級質譜全掃描結合自動觸發二級質譜掃描模式（FullMS/dd-MS2），掃描范圍m/z 80～1 500，一級質譜分辨率70 000，二級質譜分辨率17 500，正離子模式毛細管電壓3.8 kV，負離子模式毛細管電壓3 kV，毛細管溫度和氣化溫度均為350 ℃，鞘氣和輔助氣均為N2，鞘氣流速和輔助氣流速分別為45 arb和15 arb，高壓環形離子導入裝置電壓（S-LensRFLevel）為55。階梯碰撞能量20、40、60 eV。

2.4鹿角膠中肽段的鑒定

2.4.1軟件分析

利用Xcalibur4.3（Thermo Fisher Scientific，USA）軟件進行譜圖分析。

2.4.2Maxquant參數設置

將Xcalibur產生的RAW原始數據使用Maxquant軟件（版本2.4.0.0）搜庫。以Uniprot數據庫收錄至馬鹿和梅花鹿蛋白庫Red deer（reviewed，32條序列，2023-05-05下載，全表見OSID科學數據與內容附表1）和Sika deer（reviewed，14條序列，2023-05-05下載，全表見OSID科學數據與內容附表2）為檢索數據庫，實驗參數設置為No Fraction和Label free quantification，其他參數均為默認值［10］。

2.4.3Perseus參數設置

將Maxquant產生的proteinGroups.txt和peptides.txt數據使用Perseus軟件（版本2.0.10.0）處理。過濾污染蛋白（potential contamiant）和unique peptide>1的蛋白，以期得到獨立肽段［11］。

2.5鹿角膠肽段生物信息學分析

2.5.1鹿角膠肽段生物活性與不良反應預測

對具有潛在藥理作用的多肽類和蛋白類藥物進行生物活性與毒性預測，可以為研究節省時間和實驗成本。通過在線網站PeptideRanker（http：//distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/）可以預測肽段的生物活性概率［12］。通過在線網站ToxIBTL（https：//server.wei-group.net/ToxIBTL/ProcessServlet）可以預測肽段毒性［13］。利用在線網站Hemopred（http：//codes.bio/hemopred/）可以對肽段進行溶血性預測［14］，利用在線網站Algpred2.0（https：//webs.iiitd.edu.in/raghava/algpred/submission.html）可以對肽段進行致敏性預測［15］。

2.5.2鹿角膠肽段基本分子特性預測

對具有潛在藥理作用的肽段進行基本分子特性預測，可以為樣品的提取分離純化等實驗研究提供可靠的參考意見。通過在線預測網站（https：//pepcalc.com-Peptide calculator）可以預測鑒定得到的肽段的水溶性。利用Expasy ProtParam tool（https：//web.expasy.org/protparam）可以預測肽段的不穩定性指數及PI值［16］，還可以得到肽段的化學分子式。不穩定指數可以初步判斷肽段在實驗中穩定與否，結果小于40為穩定，結果大于40則可能不穩定。

3結果與分析

3.1鹿角膠中促成骨化活性成分的篩選和鑒定

3.1.1鹿角膠水溶液和乙腈溶液中肽段的鑒定

在正負離子模式下，鹿角膠水溶液和乙腈溶液的總離子流圖見圖1、圖2，利用Maxquant鑒定譜圖中的肽段，Maxquant鑒定所得肽段具體見表4。

使用Perseus去除常見Potential contaminant以及unique peptide>1的肽段后［17］，得到肽段GDTPTLQLEEVDPK，FDR在1%以下，鑒定可信度良好。經Uniprot數據庫中已經過人工核驗的馬鹿和梅花鹿蛋白序列庫鑒定該肽段屬于蛋白P51745序列的一部分。除此之外，在未經過人工驗證的馬鹿和梅花鹿蛋白序列庫中還發現了另一擁有該肽段的蛋白，其Protein ID為D5KXX5。肽段GDTPTLQLEEVDPK在蛋白P51745和D5KXX5上的序列信息見表5～6。經PDB蛋白質結構數據庫鑒定P51745為白細胞介素-1β，而D5KXX5未得到鑒定結果。Perseus得到的肽段質譜圖見圖3。

3.2鹿角膠肽段生物信息學分析

3.2.1鹿角膠肽段生物活性、不良反應預測

鹿角膠肽段生物學信息見圖4所示。通常情況下，在Peptide Ranker中得到的生物活性預測結果大于0.5時，表明該活性肽段具有生物活性的概率較高。鑒定得到的鹿角膠肽段的活性概率為0.09，毒性預測結果為non-toxic，溶血性預測結果為non-hemolytic，致敏性預測及結果為ALLERGEN。通過肽的生物活性預測結果可知該活性肽段的生物活性偏低，因此在研究鹿角膠肽段的藥理作用時，可以通過氨基酸突變、修飾等方式提高該活性肽段的活性。不良反應預測結果則為鹿角膠肽段實驗研究過程中的突發情況提供了參考。

3.2.2鹿角膠肽段基本分子特性預測

經Expasy ProtParam tool預測可知，肽段相對分子質量為1 541.68，肽鏈長度為14，與Maxquant分析結果基本一致。肽段親水性為Good water solubility，水溶性良好；PI值為3.92，不穩定性指數為34.39。Gao等［18］人利用HPLC-MS/MS和MALDI-TOF MS在分子量和等電點方面鑒別了提取的416種蛋白質，發現分子量主要分布在10～200 kDa，PI分布在3.84～11.57之間的蛋白質在水中穩定性強，本實驗結果符合其檢測結論。因此在研究鹿角膠時，其潛在有效成分的提取可以采用超聲輔助水溶液提取。

4討論

動物藥是中藥的重要組成部分，其預防和治療疾病的歷史長達數千年。在治療骨骼類疾病方面，現代研究發現大多數動物藥主要有效成分為蛋白質類、多肽類和氨基酸等提取物［19-21］。關于動物藥的研究思路主要是把通過分離純化后得到的較為單一的成分進行鑒定和活性驗證的傳統研究思路。這種研究思路很大程度上忽視了中藥多組分多靶點協同作用的中藥藥理學機制［22］，對研究以多肽和氨基酸等為主要藥效物質的動物藥來說，不僅耗時長而且實驗結果往往差強人意。而細胞膜色譜技術作為一種基于活性細胞膜可特異性結合中藥活性成分的技術，可以在體外動態的模擬藥物與體內靶點之間的相互作用，非常貼合中藥多成分多靶點的作用機制［23-26］。

鹿角膠是一種具有廣泛藥理作用的動物類中藥。目前，在研究鹿角膠治療與骨相關疾病的作用機制上有著顯著的研究進展。有研究發現，它不僅能夠促進BMSCs的成骨相關基因COLI、integrin-α2、integrin-α5以及integrin-β1的表達，還能夠使其鈣化結節和分化為成骨細胞的數量顯著增加［27］。本研究以鹿角膠為例采用新的實驗方法建立了BMSCs細胞膜色譜模型，聯合超高效液相-質譜從鹿角膠水溶液中篩選促成骨化的藥效物質基礎［28］，并通過Maxquant和Perseus軟件分析鑒定出其活性成分，同時采用生物學信息平臺預測實驗結果的生物活性、不良反應以及基本分子特性。證實鹿角膠中的多肽類活性成分與BMSCs細胞膜有親和靶點，并為動物藥中多肽類有效成分的篩選和進一步的開發研究提供一條可行的研究思路。最終鑒定得到的鹿角膠肽段數量相對太少，猜測原因可能與鹿角膠水溶液中的某些大分子蛋白和BMSCs細胞膜的生物親和性有限相關。

隨著動物藥的開采利用，其資源日益稀缺，而動物藥成分復雜多樣，傳統的分離純化方法需要適合蛋白質、多糖、多肽等成分的理化性質，這種分離純化方法耗費時間長、經濟成本高且不能可靠地得到具有藥理作用的生物活性成分，因此亟需找到一種可靠的分離純化方法，加速動物藥藥效物質的研究，開發合成新藥，從而緩解藥用資源的稀缺［29-34］。細胞膜色譜作為一種利用分子和受體特異性結合的性質篩選具有藥理作用的生物活性成分的技術，不僅經濟成本低廉，還能大大提高中藥有效成分篩選速度，并且對靶向性不明的動物藥提供了一種可行的實驗方案，也可促進中藥多靶點多組分治療作用機制深入闡釋。

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