吲哚乙酰化高直鏈玉米淀粉改善潰瘍性結腸炎的作用機制研究

摘要：為了研究吲哚乙酰化高直鏈玉米淀粉改善潰瘍性結腸炎的作用機制，利用葡聚糖硫酸鈉誘導急性潰瘍性結腸炎小鼠模型，采用吲哚乙酰化高直鏈玉米淀粉靶向結腸釋放吲哚乙酸，結合芳香烴受體抑制劑，分析小鼠結腸長度、疾病活動指數，利用酶聯免疫吸附法測定結腸白介素-6、白介素-10、轉化生長因子β1、髓過氧化物酶和白介素-22等細胞因子的表達水平，采用定量聚合酶鏈反應分析結腸緊密連接蛋白occludin、ZO-1及CYP1A1的相對表達水平，并通過流式細胞術分析腸系膜淋巴結中調節性T細胞和輔助性T細胞17的比例。結果發現，吲哚乙酰化高直鏈玉米淀粉明顯減輕結腸長度的縮短，顯著降低疾病活動指數及白介素-6和髓過氧化物酶的表達，顯著促進白介素-10、轉化生長因子β1、白介素-22、CYP1A1、occludin和ZO-1的表達，明顯提高調節性T細胞的比例，并顯著降低輔助性T細胞17的比例，而給予芳香烴受體抑制劑會削弱吲哚乙酰化高直鏈玉米淀粉的作用。以上結果提示，吲哚乙酰化高直鏈玉米淀粉可通過激活芳香烴受體發揮改善潰瘍性結腸炎的作用。

關鍵詞：腸道菌群代謝產物；吲哚乙酸；潰瘍性結腸炎；芳香烴受體；炎癥反應；免疫平衡；色氨酸

中圖分類號：R967文獻標志碼：A文章編號：1002-4026（2024）05-0017-08

開放科學（資源服務）標志碼（OSID）：

Mechanism of action indole acetylated high-amylose

maize starch in improving ulcerative colitis

QU Xinyan1， LI Qingjun2， DING Xingchun1， SONG Yingying1*

（1. Shandong Analysis and Test Center， Qilu University of Technology （Shandong Academy of Sciences）， Jinan 250014， China;

2. Experimental Center， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250355， China）

Abstract∶The aim of this study is to investigate the mechanism action of indole acetylated high-amylose maize starch in improving ulcerative colitis. Dextran sulfate sodium salt was used to induce acute ulcerative colitis in mice. Indole acetylated high-amylose maize starch was then used to target the colon with the delivery of indole-3-acetic acid. This was combined with the administration of an aryl hydrocarbon receptor inhibitor to analyze the mice in terms of colon length; disease activity index; and levels of interleukin-6， interleukin-10， transforming growth factor β1， myeloperoxidase， and interleukin-22 in the colon， which were detected by enzyme-linked immunosorbent assay. Quantitative polymerase chain reaction was used to analyze the relative expression levels of the colonic tight junction proteins occludin， ZO-1， and CYP1A1. Flow cytometry was used to test the ratio of regulatory T cells and T helper 17 cells in the mesenteric lymph nodes. The results showed that administration of indole acetylated high-amylose maize starch significantly alleviated the shortening of the colon length; significantly reduced the disease activity index and the levels of interleukin-6 and myeloperoxidase; significantly promoted the expression of interleukin-10， transforming growth factor β1， interleukin-22， CYP1A1， occludin， and ZO-1; significantly increased the proportion of regulatory T cells; and significantly reduced the proportion of T helper 17 cells. Administration of the aryl hydrocarbon receptor inhibitor weakened the effect of indole acetylated high-amylose maize starch. These results together suggest that acetylated high-amylose maize starch can improve ulcerative colitis by activating aryl hydrocarbon receptors.

Key words∶microbiota metabolites; indole-3-acetic acid; ulcerative colitis; aryl hydrocarbon receptors; inflammatory response; immune balance; tryptophan

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種以腹痛、腹瀉、黏液膿血便為主要臨床表現，累積結腸和直腸的非特異性炎癥性腸病，被世界衛生組織定位為現代難治病之一，近年來我國UC發病率顯著上升［1］。UC患者的腸道黏膜屏障損傷反復發作，腸壁的破壞與修復過程交替進行，病情嚴重者可出現腸穿孔、大出血、中毒性巨結腸甚至癌變等并發癥，對患者、家庭及社會造成沉重的經濟和精神負擔［2-3］。目前，UC的治療藥物主要有氨基水楊酸類、糖皮質激素類和免疫抑制劑等。這些藥物具有耐藥性和費用昂貴等局限性，并且療效和預后并不十分理想［4］。其中氨基水楊酸類藥物只能緩解輕中度活動期UC患者的癥狀，其緩解率僅為50%；糖皮質激素類藥物會給患者帶來高血壓、青光眼、骨質疏松等嚴重副作用；硫嘌呤類藥物和鈣調神經磷酸酶抑制劑等免疫抑制劑會引起肝腎損傷［5］。現已發現，腸道菌群代謝產物可以調節宿主的炎癥反應，為UC治療新策略的研究提供了新的思路和方法。

吲哚乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）是腸道菌群分解色氨酸生成的代謝產物。據報道，IAA可以通過直接中和自由基、誘導血紅素氧化酶的表達發揮抗炎與抗氧化作用，IAA具有提高人源化胰腺導管腺癌小鼠模型化療療效的作用［6-7］，另外，IAA還可以促進白介素-22（IL-22）的表達，誘導抗菌肽REG3G的腸道表達，保護腸道屏障，抑制腸道細菌向肝臟轉移，防止小鼠形成乙醇誘導的脂肪性肝炎［8］。近來研究發現姜黃多糖、殼寡糖或伏磚茶茶褐素可以通過調節色氨酸代謝，恢復包括IAA在內的色氨酸代謝產物的水平，明顯改善潰瘍性結腸炎小鼠的病理表型［9-11］。而且潰瘍性結腸炎小鼠口服IAA后，病理表型也得到改善［12］。但是尚未有IAA改善潰瘍性結腸炎作用機制的報道。

芳香烴受體（aryl hydrocarbon receptor，AhR）是一種重要的配體及活性轉錄因子，廣泛表達于各種免疫或非免疫細胞中，在內源和環境信號的刺激下參與信號轉導等重要的生物學過程，與多個免疫發育、分化、功能的關鍵信號通路均有密切聯系［13-14］。腸道菌群代謝產物對機體免疫系統具有重要調節作用，包含IAA、吲哚丙酸在內的吲哚類化合物是AhR的配體，這些代謝產物對宿主腸道穩態具有重要作用［15-16］。本文主要從AhR信號通路入手，利用吲哚乙酰化高直鏈玉米淀粉（HAMSIAA）靶向結腸釋放IAA，研究小鼠潰瘍性結腸炎得以改善的機制，為UC治療新策略的研究提供數據基礎。

本文采用葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導急性潰瘍性結腸炎小鼠模型，結合AhR抑制劑CH223191，測量小鼠結腸長度，計算小鼠疾病活動指數（disease activity index，DAI），利用酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法分析結腸組織中白介素-6（interleukin-6，IL-6）、白介素-10（interleukin-10，IL-10）、轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）和白介素-22（interleukin-22，IL-22）等細胞因子的表達水平，采用定量聚合酶鏈反應（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）法檢測小鼠結腸組織中緊密連接蛋白occludin、ZO-1及AhR信號通路下游基因CYP1A1的相對表達水平，并通過流式細胞術分析小鼠腸系膜淋巴結中調節性T細胞（regulatory T cells，Treg）和輔助性T細胞17（helper T cell 17，Th17）的比例，分析IAA改善潰瘍性結腸炎的作用機制。

1實驗儀器、材料及方法

1.1實驗儀器

BD FACS Aria III流式細胞儀（美國BD公司）；Molecular Devices多功能酶標儀（美谷分子儀器（上海）有限公司）；Roche Light Cycler480 Ⅱ熒光定量PCR儀（瑞士Roche公司）；三重四極桿液相色譜串聯質譜儀（美國Waters公司）。

1.2實驗材料

實驗動物（北京維通利華實驗動物技術有限公司）；HAMSIAA（實驗室自備）；DSS（美國MP Biomedicals公司，分子量=36～50 kDa）；CH223191（德國Merck公司）；IL-6、IL-10、TGF-β1、IL-22和IL-17檢測ELISA試劑盒（美國Invitrogen公司）；MPO（美國Rockland公司）；CD3、CD8a、CD25抗體（美國BioLegend公司）；Foxp3、B220、CD4抗體（美國BD公司）。動物實驗方案經過山東省分析測試中心醫學倫理委員會審查，審查批件號為ECAESDATC-2021-013。

1.3實驗方法

1.3.1HAMSIAA的制備

采用縮合方法制備HAMSIAA，將高直鏈玉米淀粉加到二甲基亞砜（DMSO） 中，40 ℃攪拌至澄清，將反應液溫度冷卻至室溫，然后依次加入IAA、縮合劑和１-甲基咪唑，繼續攪拌24 h。反應結束后，將反應溶液緩慢地加到乙醇中，析出固體沉淀，除去溶劑，用乙醇洗滌沉淀3次，干燥沉淀得到HAMSIAA。

1.3.2分組與給藥

將雌性小鼠C57BL/6（18～20 g）分成正常組（normal control）、模型組（DSS-only）、HAMSIAA和HAMSIAA+CH223191組，每組6只，HAMSIAA干預7 d后，將DSS按照2.5%的比例溶解到飲用水中，模型組、HAMSIAA和HAMSIAA+CH223191組動物自由飲用，連續飲用７ d，期間每天觀察動物精神狀態并稱重。

1.3.3結腸長度和DAI值測定

實驗結束后，收集小鼠結腸組織，測量其長度，并根據表1中的評分標準計算小鼠DAI值：

DAI值=體重下降評分+糞便黏度評分+糞便出血評分。

1.3.4UPLC-MS/MS法檢測IAA含量

采集不同處理組小鼠的血清，取適量樣本，加入內標IAA-d5 孵育30 min后，加入適量甲醇/水/甲酸混合液，超聲提取，離心后過 Oasis HLB 柱萃取凈化，經高效液相進行洗脫，采用電噴霧離子源（ESI），在正離子MRM（multiple reaction monitoring）模式進行采集，通過內標法進行定量。

1.3.5ELISA法檢測細胞因子水平

取適量小鼠結腸組織樣本，使用磷酸鹽緩沖溶液按照1：9的比例研磨，研磨液經4℃、10 000 r/min離心15 min，收集上清液，按照ELISA試劑盒說明書的操作方法，對IL-6、IL-10、TGF-β1、MPO、IL-17和IL-22等細胞因子表達水平進行測定。

1.3.6qPCR法檢測基因相對表達水平

使用TRIzol法提取小鼠結腸中的總RNA，以GAPDH作為管家基因，利用SYBR green法檢測occludin、ZO-1和CYP1A1等基因在不同處理組中的相對表達水平。GAPDH上游引物序列：CATCACTGCCACCCAGAAGACTG，GAPDH下游引物序列：ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG；occludin上游引物序列：TGGCAAGCGATCATACCCAGAG，occludin下游引物序列：CTGCCTGAAGTCATCCACACTC；ZO-1上游引物序列：GTTGGTACGGTGCCCTGAAAGA，ZO-1下游引物序列：GCTGACAGGTAGGACAGACGAT；CYP1A1上游引物序列：GACCCTTACAAGTATTTGGTCGT，CYP1A1下游引物序列：GGTATCCAGAGCCAGTAACCT。

1.3.7流式細胞術分析小鼠MLN中Treg和Th17細胞的比例

采集各組小鼠腸系膜淋巴結（mesenteric ymph nodes，MLN），制備淋巴細胞單細胞懸液。按照表2中的方案向獲取的淋巴細胞中加入相應抗體進行孵育染色，而后利用流式細胞術分析各處理組Treg和Th17細胞的比例。

1.3.8統計學處理

使用8c3ee0ce38e6a2c1edd34028a76f7d14GraphPad Prism 9.00對數據進行單因素方差分析，結果以平均值±標準差表示，P<0.05表示存在統計學意義。

2實驗結果

2.1HAMSIAA改善小鼠結腸縮短程度及DAI評分

收集小鼠結腸并測量其長度，計算DAI評分。如圖1所示，與正常組比較，模型組小鼠結腸長度明顯縮短至（4.5±0.2） cm（P<0.001），且DAI值高達11.6±1.1（P<0.001）；而HAMSIAA可以顯著減輕結腸長度的縮短（5.6±0.4） cm，（P<0.05）并降低DAI值至8.4±2.9（P<0.01）。HAMSIAA可以顯著減輕結腸長度的縮短并降低小鼠疾病活動指數，給予CH223191會抑制HAMSIAA的作用。

2.2HAMSIAA增加小鼠血清中IAA的濃度

采集不同處理組小鼠的血清，加入內標IAA-d5孵育30 min后，加入甲醇/水/甲酸混合液，超聲提取，離心后過Oasis HLB柱萃取凈化，經高效液相進行洗脫，采用電噴霧離子源，在正離子MRM模式下進行采集，通過內標法進行定量。如圖2所示，HAMSIAA干預能夠明顯增加小鼠體內IAA的濃度至（549.2±345.9）μmol/L。

2.3HAMSIAA改善小鼠結腸炎癥損傷

炎性細胞因子包括IL-6、IL-17的上調是UC的一個明顯特征，MPO在指示中性粒細胞浸潤中起重要作用，而IL-10和TGF-β1與誘導Treg細胞抑制炎癥反應密切相關。采用ELISA法檢測小鼠結腸組織中IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β1和MPO的表達水平。如圖3所示，HAMSIAA可以顯著降低IL-6、IL-17和MPO的表達水平至（2 447±909.0） pg/mL（P<0.01）、（708.3±339.2） pg/mL（P<0.05） 和（3 399 898±571 099） pg/mL（P<0.01），并顯著促進IL-10和TGF-β1的表達水平至（68 185±15 512） pg/mL（P<0.05）和（673.4±106.3） pg/mL（P<0.05），給予CH223191會抑制HAMSIAA的作用。

2.4HAMSIAA減輕小鼠腸道屏障受損

在腸黏膜屏障功能的研究中，occludin和ZO-1是保持腸道黏膜屏障功能正常的重要組成部分，由occludin和ZO-1等維持的腸道黏膜屏障可以有效防止內毒素和腸道細菌移位。采用qPCR法檢測小鼠結腸組織中的緊密連接蛋白occludin和ZO-1的mRNA表達水平。如圖4所示，HAMSIAA可以顯著促進occludin和ZO-1的相對表達水平，分別是0.371 9±0.225 9（P<0.05）和0.575 2±0.509 9（P<0.05），而給予CH223191干預抑制了occludin和ZO-1的相對表達，抑制了HAMSIAA的作用。

2.5HAMSIAA調節小鼠腸道免疫平衡

Treg細胞具有維持自身免疫耐受及抑制相關免疫反應過度活化的功能，其數量和功能對機體維持正常的免疫穩態至關重要，而Th17細胞在炎癥性疾病的發病、發展和轉歸過程中扮演重要角色。采用流式細胞術分析小鼠MLN中Th17和Treg細胞的比例。如圖5所示，HAMSIAA可以顯著提高MLN中Treg細胞的比例至7.0±1.5（P<0.05），并顯著降低MLN中Th17細胞的比例至0.3±0.2（P<0.05）。

2.6HAMSIAA促進AhR下游蛋白與基因的表達水平

激活AhR信號通路，會促進該信號通路下游CYP1A1和IL-22的表達，其中IL-22參與修復腸道黏膜屏障。采用ELISA法檢測小鼠結腸組織中IL-22的表達水平，采用qPCR法檢測小鼠結腸組織中CYP1A1的基因相對表達水平。如圖6所示，HAMSIAA可以顯著促進細胞因子IL-22的表達（927.4±334.9）pg/mL，P<0.05，并提高基因CYP1A1的相對表達至7.8±2.2，給予CH223191會抑制HAMSIAA的作用。

3討論與結論

UC是一種威脅人類健康的疾病，傳統的治療方法會產生副作用，并帶來巨大的經濟負擔。因此，迫切需要安全有效的新型藥物。越來越多的證據表明，飲食、腸道微生物群及其代謝產物與UC密切相關［17］。芳香族氨基酸色氨酸對宿主健康起著至關重要的作用，高色氨酸攝入已被證明對許多疾病有益，包括UC［18］。IAA是腸道菌群分解色氨酸后生成的一種代謝產物，已被證實具有抗炎、抗氧化及輔助胰腺導管腺癌化療等作用［6-8］。

IAA是非水溶性的，目前發表的文章一般是通過吲哚乙酸鹽的形式來補充，而吲哚乙酸鹽無法實現對結腸的靶向補充，且補充吲哚乙酸鹽會大量攝入金屬陽離子（如鈉和鈣），而本文中采用的HAMSIAA是一種抗性淀粉，攝入后可抵抗小腸消化，到達結腸部位后被腸道菌群發酵并大量釋放IAA，補充效率高且避免了傳統補充方式中存在的異味及金屬陽離子的不利影響。

本文將HAMSIAA應用于DSS誘導的急性潰瘍性結腸炎模型，腸道菌群分解HAMSIAA釋放大量的IAA于腸道中，有利于減輕患病小鼠結腸縮短、降低小鼠DAI，而CH223191可抑制這種改善作用。與正常組比較，模型組小鼠結腸組織中的促炎細胞因子IL-6、MPO表達水平顯著升高，而抑炎細胞因子IL-10、TGF-β1表達水平明顯降低，而HAMSIAA干預可以調節細胞因子水平失衡，促進抑炎細胞因子IL-10和TGF-β1的表達并抑制促炎細胞因子IL-6、MPO的表達。緊密連接蛋白對腸道屏障的完整性至關重要，它可以防止脂多糖等內毒素從腸腔滲漏。當包括occludin和ZO-1在內的緊密連接蛋白被破壞時，腸道屏障就會被破壞［19］。與正常組比較，模型組小鼠腸道組織中occludin和ZO-1的相對表達水平明顯降低，而HAMSIAA干預能明顯促進occludin和ZO-1的表達。機體免疫功能異常與UC密切相關，免疫系統中CD4+ T細胞的免疫失調在UC發病過程中起到關鍵作用。Treg細胞和Th17細胞是重要的CD4+ T細胞亞群，它們之間的協調平衡是維持機體免疫平衡的重要環節［20］。多項研究表明，Treg/Th17的失衡可能是UC發病的最直接和最重要的因素［21］。而HAMSIAA干預可以顯著糾正患病小鼠MLN中的Treg/Th17失衡。HAMSIAA干預可以明顯促進AhR下游CYP1A1基因的相對表達水平，同時明顯增加AhR下游IL-22的分泌。而給予CH223191后，HAMSIAA的改善作用均被抑制。

綜上可見，在小鼠急性潰瘍性結腸炎模型中，HAMSIAA可以通過激活AhR信號通路降低結腸炎癥反應，調節腸道Treg/Th17平衡，促進腸道損傷修復。

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