新加蓯蓉菟絲湯通過線粒體自噬途徑促卵泡發育的分子機制

摘要：基于液相色譜-質譜聯用儀（LC-MS）技術、網絡藥理學和動物實驗探討新加蓯蓉菟絲湯（XJCRTST）通過顆粒細胞線粒體自噬途徑促卵泡發育的分子生物學機制。通過LC-MS和網絡藥理學篩選出XJCRTST的主要成分、其治療卵巢功能減退疾病靶點及通路。選取雌性SD大鼠分為模型組，西藥組，XJCRTST高、中、低劑量組共5組。HE染色觀測卵巢形態學變化；透射電鏡觀察卵巢顆粒細胞中線粒體結構形態及線粒體自噬體。結果表明，LC-MS技術鑒定出XJCRTST化合物共252個，其治療卵巢功能減退類疾病潛在作用靶點42個，GO功能富集過程中主要涉及BP（1 168項）、CC（45項）和MF（59項），KEGG通路富集顯示參與的通路有AGE-RAGE、Prolactin及TNF信號通路等，Mitophagy-animal過程中共富集了3個靶基因：Parkin/PINK1、HIF1A、MAPK8。動物實驗表明，中藥治療組大鼠卵泡數量增多，閉鎖卵泡減少。電鏡觀察中發現中藥組線粒體腫脹減輕、線粒體自噬情況減少。綜上得出XJCRTST治療卵巢功能減退可能通過調節卵巢顆粒細胞中線粒體功能和線粒體自噬相關通路發揮其治療作用。

關鍵詞：新加蓯蓉菟絲湯；卵巢功能減退；網絡藥理學；液相色譜-質譜聯用儀；線粒體

中圖分類號：R282文獻標志碼：A文章編號：1002-4026（2024）05-0025-10

開放科學（資源服務）標志碼（OSID）：

The molecular mechanisms by which Xinjia Cistanche Tusi Decoction

promotes follicular development through mitophagy

YAN Jin1， LI Fei2*， WU Keming3，YANG Haobo1

（1. School of Basic Medicine， Shaanxi University of Chinese Medicine， Xianyang 712000， China; 2. Affiliated Hospital of

Shaanxi University of Chinese Medicine， Xianyang 712000， China; 3. Affiliated Hospital of

Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 610000， China）

Abstract∶Using light chromatography-mass spectrometry （LC-MS）， network pharmacology， and animal experiments， we explored the molecular mechanism by which Xinjia Cistanche Tusi Decoction （XJCRTST） promotes follicular development through granulosa cell mitophagy. LC-MS and network pharmacology were used to screen for the main components of XJCRTST and its therapeutic targets and pathways related to hypoovarianism. Female Sprague-Dawley rats were divided into five groups： model group， western medicine group， and XJCRTST high dose， medium dose， and low dose groups. The morphological changes of the ovary were observed through hematoxylin and eosin staining， and the structure and morphology of mitochondria and mitophagosomes in ovarian granulosa cells were observed through transmission electron microscopy. Two hundred and fifty-two compounds were identified in XJCRTST， with 42 potential targets for treating hypoovarianism， and the Gene Ontology enrichment mainly involved biological process （1 168 items）， cell composition（45 items）， and molecular function（59 items）. KEGG pathway enrichment showed that the pathways involved were AGE-RAGE， Prolactin and TNF signaling pathways. Three target genes Parkin/PINK1， HIF1A and MAPK8 were enriched in the Mitophagy-animal process.Animal experiments showed that the number of follicles increased and the atretic follicles decreased in the Chinese medicine treatment group. Electron microscopy found that mitochondrial swelling and mitophagy decreased in the Chinese medicine group. XJCRTST may play a therapeutic role in treating hypoovarianism by regulating mitochondrial function and mitophagy-related pathways in ovarian granulosa cells.

Key words∶Xinjia Cistanche Tusi Decoction; ovarian hypoplasia; network pharmacology; LC-MS；mitochondria

卵泡發育障礙是導致40歲以下女性月經稀發量少、閉經等病癥的“罪魁禍首”，嚴重影響女性身心健康。近年來，受環境污染、工作學習壓力增加、食品安全問題等因素影響，臨床上卵巢功能減退類病癥發病率逐年增高［1-2］，這類病癥是以卵巢內卵泡的數量、質量降低，卵泡發育和成熟障礙，同時伴隨低雌激素及高促性腺激素為特征，出現以稀發量少、月經紊亂甚至閉經、生育力降低或不孕的一類病癥，包括卵巢儲備功能低下（decline in ovarian reserbe，DOR）、早發性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）和卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）等［3］。西醫尚無有效恢復患者卵巢功能的方法，多采用雌-孕激素補充或替代療法（hormone replacement therapy，HRT），以改善患者圍絕經期癥狀和維持人工月經，但停藥后病情常常反復。中醫學認為卵巢功能減退多因腎精不足、腎氣虧虛、兼肝郁血瘀，造成沖任虛衰、天癸早竭而發病，以補腎益精、養血活血為基本治法，在結合明代醫家武之望《濟陰綱目》蓯蓉菟絲丸與卓雨農《中醫婦科治療學》加減蓯蓉菟絲丸的基礎上，吳克明教授創制新加蓯蓉菟絲湯，臨床用于治療卵巢功能減退類病癥效果顯著［4-7］，但其具體分子生物學機制尚未完全闡明。

因此，本研究利用液相色譜-質譜聯用儀（liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS）技術、網絡藥理學篩選出方劑中的所有有效成分及其治療卵巢功能減退的相關靶點和通路，進行動物實驗驗證，以期為后續研究提供一定參考方向。

1材料與方法

1.1新加蓯蓉菟絲湯中藥復方LC-MS物質鑒定分析

1.1.1新加蓯蓉菟絲湯中藥復方

肉蓯蓉15 g、菟絲子15 g、黃精10 g、淫羊藿15 g、覆盆子10 g、山茱萸10 g、當歸10 g、熟地10 g、澤蘭10 g、烏藥10 g（10味藥，共重115 g）。規格：每115 g生藥加工成12 g免煎顆粒劑。

1.1.2實驗試劑和儀器

質譜乙腈（Fisher）、甲酸（Sigma-Aldrich）、質譜儀（TripleTOF5600+）、色譜儀（Nexera UHPLC LC-30A）。

1.1NoNhK/aHuKg4W0IaP053yQ==.3實驗方法

取樣品2.5 g于EP管，加入10 mL熱水，超聲10 min， 12 000 r/min轉速下離心10 min，取上清液0.45 μm膜過濾后進樣檢測，進樣10 μL。

1.2網絡藥理學分析

1.2.1主要活性成分篩選與潛在靶點信息收集

使用TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），將新加蓯蓉菟絲湯中各味中藥分別輸入，并將口服生物利用度、類藥性分別設置為OB>30%，DL>0.18［8-10］。通過R包將靶點轉換成gene symbol。將質譜所獲取的化合物輸入Pubchem、Drugbank、TCMSP、SwissTargetPrediction平臺來預測藥物靶點，去重后，共得到374個靶點。使用Cytoscape 3.7.1構建網絡。在GeneCards（https：//www.genecards.org）及OMIM（http：//www.omim.org）中進行搜索卵巢功能減退類病癥，合并兩個庫的數據后去重，得到潛在疾病靶點。

1.2.2PPI 網絡及網絡拓撲分析

為更進一步闡明新加蓯蓉菟絲湯對卵巢功能減退類病癥的治療作用，先利用R包對成分與疾病靶點取交集，并繪制Venn圖。在STRING中的構建蛋白質-蛋白質網絡（PPI）中選擇篩選得到的交集靶點，生物種類選定為“人類”，作用閾值選擇“highest confidence”后得到PPI網絡，保存文件，利用Cytoscape3.7.1的“NetworkAnalyzer”工具進行分析，制圖。

1.2.3疾病-靶點-成分作用機制

將合并后的疾病-靶點-成分關系文件，導入Cytoscape3.7.1進行網絡構建。

1.2.4富集功能分析

將交集靶點利用R包進行GO和KEGG分析，分別對GO中的細胞組成（CC），生物學過程（BP），分子功能（MF）進行富集分析并制圖；對KEGG通路進行分析，選取P < 0.01下前20的信號通路，并繪制柱狀圖。預測新加蓯蓉菟絲湯對卵巢功能減退類病癥的作用機制。

1.3動物實驗驗證

1.3.1實驗動物

選取7～8周齡、體重約200～220 g的成年雌性SD大鼠30只，所有大鼠實驗前在SPF級實驗室條件下適應性喂養一周。光暗循環時間為12 h/12 h，相對濕度為40%～60%，并配以標準飲食和水，室內溫度設置（25±2）℃。實驗動物購自四川成都達碩生物科技有限公司，SD大鼠使用許可證：SYXK（川）2019-189；SD大鼠生產許可證：SCXY（川）2020-030。清潔級飼養，由專人負責更換墊料、飼料等。實驗方案經過陜西中醫藥大學動物實驗倫理委員會審查，審查批件號為SUCMDL20220304040。

1.3.2藥物、試劑與儀器

新加蓯蓉菟絲湯中藥復方詳見前LC-MS物質鑒定分析、雷公藤甲素（TP，生產批號：DST200515-034，成都德思特生物技術有限公司）、戊酸雌二醇片（補佳樂，德國拜耳醫藥）、醋酸甲羥孕酮片（浙江仙琚制藥股份有限公司）、倒置生物顯微鏡（DMI1德國徠卡）、透射電鏡（JEM-1400PLUS）。

1.3.3造模、分組和給藥

購入7～8周齡、體重約200～220 g的成年雌性SD大鼠50只，選取其中動情周期正常的30只作為本次實驗動物，隨機選取5只為空白對照組，其余25只進行灌胃造模。雷公藤甲素500 μg/（kg·d） 30 d進行造模，各組大鼠均于灌胃結束前第10 d開始，每日9：00，使用陰道灌洗法采集各組大鼠陰道脫落上皮細胞：移液槍吸取30 μL生理鹽水，緩慢插入大鼠陰道內3～5 mm，吹打3～5次，見液體變渾濁，立即回抽；將每只大鼠的陰道回抽液制備2份陰道涂片，進行巴氏染色制片，光鏡下觀察，各組大鼠均出現動情周期紊亂或延長，確定造模成功。將造模成功后的25只大鼠按隨機數字表法分為5組，每組5只，分別為：模型組、西藥組、中藥高劑量組、中藥中劑量組、中藥低劑量組，隨機預留的5只為空白對照組，總共6組。給藥：每劑新加蓯蓉菟絲湯生藥總量為115 g，由陜西中醫藥大學藥劑科制作成免煎顆粒劑（規格：每115 g生藥加工成12 g免煎顆粒劑），按60 kg成人臨床用藥劑量為12 g/d為標準，根據《藥理實驗方法學》［11］等效劑量系數折算法，劑量大鼠=6.3×劑量（g/kg） （成人體重按60 kg計，大鼠按0.2 kg計）折合后計算出大鼠的用藥劑量為高劑量2.52 g/（kg·d）、中劑量1.26 g/（kg·d）、低劑量0.63 g/（kg·d），按每只大鼠每100 g體重1 mL量灌胃，每日1次，連續2周。

1.3.4標本采集與指標檢測

動物處死后，迅速解剖并分離雙側卵巢，固定組織，中性甲醛固定大于24 h沖洗后全自動脫水，石蠟包埋，冷卻后切片，溫水展片，60 ℃以上烤片10～30 min，自動HE染色儀加液染色，二甲苯脫蠟置水，中性樹膠封片。光鏡下觀察卵巢結構變化及各級卵泡。新鮮卵巢組織3%戊二醛固定，1%四氧化鋨再固定，丙酮逐級脫水，濃度間隔20%至5%逐漸縮小，環氧樹脂置換80 ℃過夜包埋，包埋塊顯微鏡下仔細修出便于切片的規整形態，分別以醋酸鈾與枸櫞酸鉛染色風干后，JEM-1400PLUS透射電鏡下觀察卵巢顆粒細胞線粒體形態、線粒體自噬體。

2結果

2.1新加蓯蓉菟絲湯中藥復方分析及LC-MS物質鑒定分析

新加蓯蓉菟絲湯臨床用治卵巢功能減退類病癥的基礎方。本方主治DOR、POI、POF導致的月經后期量少、不孕癥、復發性自然流產等多種婦科疑難病癥。該方中肉蓯蓉、菟絲子、黃精為君藥，平補肝脾腎三臟，固腎益精。熟地、山茱萸、覆盆子、淫羊藿、當歸五味藥共為臣藥，其中熟地滋腎陰、養精血，滋養肝腎之陰血，山茱萸養陰澀精，與熟地共用，補斂兼具，覆盆子和淫羊藿補益肝腎之精，又可同補腎中之陽，當歸補血，為血中氣藥。澤蘭為佐藥，行氣活血，調經祛瘀。烏藥為使藥，理氣行滯。

通過混合四極TOF LC-MS質譜儀系統完成了對新加蓯蓉菟絲湯成分鑒定。共鑒定出252個化合物，其中負離子物質168種、正離子物質84種，涵蓋了蛋白質與氨基酸類、脂類、糖及其衍生物、有機酸、酚類和鞣質、醌類、內酯、香豆精和異香豆精類、木脂素類、萜類、揮發性成分、生物堿類等物質類別，其中以黃酮類、有機酸類、生物堿類含量較為豐富。（圖1）

2.2基于網絡藥理學分析新加蓯蓉菟絲湯治療卵巢功能減退類病癥的作用機制

2.2.1主要活性成分篩選與潛在靶點信息收集

新加蓯蓉菟絲湯經質譜分析共得到252個化合物，其中負離子物質168種、正離子物質84種，將所獲取的化合物輸入Pubchem、Drugbank、TCMSP、SwissTargetPrediction平臺來預測藥物靶點，共得到374個靶點。在Gene Cards，OMIM、TTD、Drugbank數據庫中輸入Premature ovarian failure（POF）、Primary Ovarian Insufficiency（POI）、Diminished ovarian reserve（DOR）關鍵詞進行搜索，將所得到的疾病基因合并去重后得到698個基因，再將數據導入R4.1.1中繪制韋恩圖，見圖2。得到新加蓯蓉菟絲湯與“DOR/POI/POF”共有基因42個，即新加蓯蓉菟絲湯治療“DOR/POI/POF”潛在作用靶點有42個。

使用Pubchem、Drugbank、化源網對新加蓯蓉菟絲湯中所獲取的藥物成分進行CAS號、相對分子質量、分子式進行補充，并結合質譜結果進行Precursor m/z與Reference m/z的補充，部分成分信息數據見OSID科學數據與內容附表1。

2.2.2PPI 網絡及網絡拓撲分析

將所得到的疾病基因與藥物靶點取交集后輸入STRING數據分析平臺，進行蛋白互作用分析后，下載TSV文件導入Cytoscape3.7.1軟件繪制PPI網絡圖，使用軟件工具欄中的“Network Analyzer”功能，使度值越低的點、線越小越暗，度值越高的點、線越大越明亮，見圖3和表1。網絡圖中共包含40個節點，203條邊，圖中圓形節點代表每個基因蛋白，邊代表蛋白相互作用關系。使用“cytoHubba”對整個網絡進行度值分析，得到蛋白互作關系排名前10的蛋白為COMT、HIF1A、AKT1、CHRNA4、VEGFA、MAOA、TNF、ESR2、ESR1、SLC6A3。

將篩選得到的基因輸入Cytoscape3.7.1中，選擇BisoGenet功能，繪制出蛋白互作網絡PPI，共得到2 200個節點，45 832條邊。使用CytoNCA插件對整體網絡進行網絡拓撲分析，選擇DC模式，并選擇最小值61篩選得到網絡圖，篩選后共得到466個節點，16 623條邊。將所得到的網絡圖放大后選擇BC模式，最小值選擇600篩選得到網絡圖，篩選后共得到72個節點，1 058條邊，見OSID科學數據與內容附圖1。

2.2.3疾病-靶點-成分作用機制

將所得到的藥物成分CAS號和疾病基因靶點導入Cytoscape3.7.1繪制“疾病-靶點-成分”網絡圖，得到包括147個節點和153條邊，每條邊則表示化合物分子與靶點之間的潛在作用關系，見圖4。

2.2.4富集功能分析

通過R4.1.1對潛在治療靶點進行GO功能富集和KEGG通路富集可視化。在GO功能富集過程中共得到1 272條結果，主要涉及BP（1 168項）、CC（45項）和MF（59項）。以pvalueCutoff=0.05， qvalueCutoff=0.05為篩選條件，獲得1 272個條目，篩選出涉及BP、CC和MF的前20條富集結果。在BP方面，主要涉及對活性氧代謝過程調控、對單胺轉運的調控、對磷脂酶C激活G蛋白偶聯受體信號通路的調控、對多巴胺代謝過程的調控等，見圖5（a）；在CC方面，主要涉及突觸后膜、突觸膜、線粒體、膜蛋白突觸后膜的固有成分、膜筏等，見圖5（c）；在MF方面，主要涉及兒茶酚胺結合、胺結合、神經遞質受體活性、G蛋白偶聯胺受體活性、突觸后神經遞質受體活性、核受體活性、配體激活轉錄因子活性等，見圖5（b）。KEGG通路富集顯示新加蓯蓉菟絲湯參與的通路有AGE-RAGE信號通路、Prolactin信號通路及TNF信號通路、HIF-1信號通路、PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路等，Mitophagy-animal過程等，KEGG通路見圖5（d）。Mitophagy-animal過程中共富集了三個靶基因Parkin/PINK1、HIF1A、MAPK8。其中PINK1作為線粒體去極化的傳感器，招募Parkin，然后泛素依賴性招募線粒體吞噬受體。Mitophagy-animal過程，見圖6。

2.3新加蓯蓉菟絲湯動物實驗驗證結果

2.3.1中藥對大鼠卵巢組織形態學的影響

光鏡觀察下，與空白對照組（Control）相比，TP模型組（TP）卵巢組織病理改變程度顯著加重，可見卵泡數量減少，閉鎖卵泡增多，顆粒層細胞排列紊亂、脫落、壞死、卵泡囊性擴張和血管充血等病理改變。與TP組相比較，新加蓯蓉菟絲湯低劑量組（TP+XJCRTST-Low）卵巢組織病理改變程度相對略微減輕，新加蓯蓉菟絲湯中劑量組（TP+XJCRTST-Middle）組卵巢組織病理改變程度相對較輕，TP+XJCRTST-High組和西藥組（TP+EV）卵巢組織病理改變程度相對最輕。（詳見圖7）

2.3.2中藥對大鼠卵巢顆粒細胞中線粒體形態學的影響

Control組：電鏡下見卵巢顆粒細胞其細胞核呈不規則多邊形，染色質分布均勻，以常染色質為主，核膜清晰完整；胞漿中可見線粒體、粗面內質網和核糖體等細胞器且結構完整清晰。TP組：卵巢顆粒細胞中見大量腫脹的線粒體，其嵴斷裂、溶解甚至消失，偶見有線粒體自噬。TP+EV組：卵巢顆粒細胞中多數線粒體已發生輕度腫脹，亦可見多量線粒體自噬。TP+XJCRTST-High組：卵巢顆粒細胞中多數線粒體已發生輕度腫脹，亦可見多量線粒體自噬。TP+XJCRTST-Middle組：卵巢顆粒細胞中多數線粒體已發生輕度腫脹，可見有少量線粒體自噬。TP+XJCRTST-Low組：卵巢顆粒細胞中多數線粒體已發生腫脹，嵴斷裂、溶解甚至消失，偶見有線粒體自噬。（見圖8）

3討論

卵巢功能減退是指卵巢內可募集卵泡數量和質量降低，并伴隨低雌激素及高促性腺激素，臨床表現為月經紊亂或閉經，生育力降低或不孕。根據中醫學腎藏精、主生殖和精血同源的基本理論，認為卵子屬腎中之精，精能生血，血可養精，卵泡發育賴于腎精充盛，卵子排出有賴腎氣鼓動，因此，卵巢功能減退的核心病機是腎氣不足、精血虧虛，因虛致瘀，根本治法應補腎益精、養血活血。課題組臨床運用補腎養血活血中藥復方新加蓯蓉菟絲湯，治療卵巢功能減退類疾病療效肯定［4-7］。

本研究通過LC-MS技術和網絡藥理學，共篩選出補腎養血活血中藥復方新加蓯蓉菟絲湯中的有效成分252種，以黃酮類、有機酸類、生物堿類含量較為豐富；其治療卵巢功能減退類疾病潛在作用靶點有42個、得到COMT、HIF1A等蛋白是其核心靶點，參與通路主要涉及AGE-RAGE、Prolactin及TNF信號通路等，Mitophagy-animal過程中共富集了3個靶基因Parkin/PINK1、HIF1A、MAPK8。本次篩選出新加蓯蓉菟絲湯中有效成分黃酮類物質，也是本方君藥肉蓯蓉和菟絲子的主要活性成分，在以往研究中顯示［12-14］：菟絲子黃酮可減輕因雷公藤多苷造成的大鼠POF，促進顆粒細胞增殖，其在大鼠體內具有雌激素樣活性，通過影響動物下丘腦-垂體-性腺軸發揮對生殖內分泌系統的作用；肉蓯蓉總黃酮抗氧化效果最佳，能提高線粒體抗氧化活性，改善線粒體功能。后續篩選出的富集靶基因Parkin/PINK1，是目前研究較多的、經典的線粒體質量控制信號通路， PINK1是具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性的線粒體外膜蛋白， 作為分子感受器，接收受損線粒體的分子信號; Parkin是具有E3泛素連接酶活性的蛋白， 主要有調節蛋白降解和信號轉導等作用。PINK1位于Parkin上游， 兩者間協調控制各自表達水平， 誘導線粒體自噬發生［15］。以上研究結果提示新加蓯蓉菟絲湯中黃酮類藥效成分可能是通過線粒體質量控制信號通路發揮其治療作用。

進一步的動物實驗表明：模型組大鼠卵泡數量減少，閉鎖卵泡增多，顆粒層細胞脫落等病理改變，而中藥各組卵巢卵泡數量增加、顆粒細胞脫落等病理改變減輕。電鏡觀察表明，與模型組相比，經中藥各組治療后，顆粒細胞線粒體腫脹減輕，其嵴斷裂、溶解、消失均未明顯見到，同時線粒體自噬現象增多，表明新加蓯蓉菟絲湯可能通過改善線粒體病理狀態、修復線粒體功能的同時，增加線粒體自噬水平從而起到修復顆粒細胞損傷的作用。以上研究結果初步表明新加蓯蓉菟絲湯可能通過線粒體自噬途徑促卵泡發育的分子機制。

本研究基于LC-MS、網絡藥理學及動物實驗后期驗證，初步證實新加蓯蓉菟絲湯通過線粒體自噬途徑促卵泡發育的分子機制，這一結果為后期深入探討該方在治療卵巢功能減退類病癥的分子機制奠定了基礎，為補腎養血活血類中藥復方通過顆粒細胞線粒體自噬促卵泡發育的研究提供了新方向。但本實驗也存在不足之處，如未將線粒體自噬通路相關蛋白做Western blot檢測。

參考文獻：

［1］DEVINE K， MUMFORD S L， WU M E， et al. Diminished ovarian reserve in the United States assisted reproductive technology population： Diagnostic trends among 181， 536 cycles from the Society for Assisted Reproductive Technology Clinic Outcomes Reporting System［J］. Fertility and Sterility， 2015， 104（3）： 612-619.e3. DOI： 10.1016/j.fertnstert.2015.05.017.

［2］ATA B， SEYHAN A， SELI E. Diminished ovarian reserve versus ovarian aging： Overlaps and differences［J］. Current Opinion in Obstetrics & Gynecology， 2019， 31（3）： 139-147. DOI： 10.1097/GCO.0000000000000536.

［3］賀宇. 補腎養血活血法治療卵泡發育障礙類疾病的導師臨床經驗總結及實驗研究［D］. 成都： 成都中醫藥大學， 2020.

［4］劉小紅， 霍君怡， 羅前， 等. 吳克明教授運用新加蓯蓉菟絲子丸治療卵巢早衰助孕成功經驗擷粹［J］. 云南中醫中藥雜志， 2016， 37（4）： 19-22. DOI： 10.16254/j.cnki.53-1120/r.2016.04.009.

［5］黃莎， 蘇靖， 吳克明. 吳克明教授運用新加蓯蓉菟絲子丸治療不孕癥驗案舉隅［J］. 中醫臨床研究， 2015， 7（1）： 83-84. DOI： 10.3969/j.issn.1674-7860.2015.01.045.

［6］郭志清， 黎潔， 蘇靖， 等. 吳克明運用蓯蓉菟絲子丸調治月經后期經驗［J］. 湖南中醫雜志， 2014， 30（11）： 45-46. DOI： 10.16808/j.cnki.issn1003-7705.2014.11.019.

［7］蔡光霞， 田維萍， 何雨聰， 等. 吳克明教授治療卵巢儲備功能下降經驗擷箐［J］. 世界中西醫結合雜志， 2013， 8（7）： 664-665. DOI： 10.13935/j.cnki.sjzx.2013.07.008.

［8］宋予馨，雷萍，魏東升， 等.基于網絡藥理學及生物信息學探討歸脾湯改善化療肌無力的作用機制［EB/OL］.［2024-03-20］. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/21.fQuGXHNgQ+LtwIGJBNYy4CorkSH17gotL89u7+pddvA=1187.R.20240308.1030.004.html.

［9］代婷媛，王劍波，徐福平，等.基于網絡藥理學的舒心安神湯抗抑郁實驗研究［J］.中藥藥理與臨床，2024，40（5）：14-22.DOI：10.13412/j.cnki.zyyl.20240307.003.

［10］卯銀輝，王卓，孫軍濤，等.逍遙散治療糖尿病性勃起功能障礙的網絡藥理學分析及實驗［EB/OL］.［2024-03-20］. https：//doi.org/10.13422/j.cnki.syfjx.20240414.

［11］徐叔云. 藥理實驗方法學［M］. 3版. 北京： 人民衛生出版社， 2002.

［12］黃長盛， 賀守第， 管雁丞， 等. 菟絲子黃酮和槲皮素對雷公藤多苷致卵巢早衰大鼠卵巢功能的影響［J］. 中國臨床藥理學雜志， 2020， 36（6）： 667-670. DOI： 10.13699/j.cnki.1001-6821.2020.06.021.

［13］劉倩， 田元春， 賓彬， 等. 菟絲子黃酮對生殖系統的保護作用研究進展［J］. 中醫藥導報， 2020， 26（12）： 148-151. DOI： 10.13862/j.cnki.cn43-1446/r.2020.12.037.

［14］鄧楠， 申雅娟， 丁輝， 等. 肉蓯蓉多糖類成分藥理作用研究進展［J］. 遼寧中醫藥大學學報， 2020， 22（6）： 67-71. DOI： 10.13194/j.issn.1673-842x.2020.06.018.

［15］SATO S， FURUYA N. Induction of PINK1/parkin-mediated mitophagy［M］//Mitophagy. New York， NY： Springer New York， 2017： 9-17. DOI： 10.1007/7651_2017_7.