鴨糞鏈球菌的分離與鑒定研究

摘 要：選擇廣東省惠東縣某養鴨場內疑似糞鏈球菌感染的患病鴨分離培養病原菌，通過鏡檢、PCR檢測、生化試驗與藥敏試驗進行鑒定。經培養鑒定，該病原菌為鴨糞鏈球菌，為革蘭氏陽性菌，PCR檢測可擴增出大小為546 bp的特異性電泳條帶；對木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、β-半乳糖苷酶、衛矛醇、氧化酶、動力、硫化氫等生化反應試驗結果呈陰性，蔗糖、乳糖、麥芽糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、甘露醇、山梨醇、精氨酸水解、七葉苷水解、硝酸鹽還原、水楊素等生化試驗呈陽性；對環丙沙星、磷霉素、氨芐西林、頭孢哌酮、諾氟沙星、左氧氟沙星、萬古霉素等幾種抗生素藥物較敏感。本研究結果為今后本病的正確診斷和有效防治提供科學參考依據。

關鍵詞：分離；鑒定；鴨；糞鏈球菌

中圖分類號：S858.32 文獻標識碼：B 文章編號：1673-1085（2024）10-0028-05

我國養鴨具有悠久的歷史，最早的養鴨記錄可追溯到公元前500年。目前，我國已成為主要養鴨生產國之一，肉鴨生產在世界上占據重要的地位。據相關數據統計顯示，我國肉鴨飼養量占全世界總量的70%左右，年屠宰量已超過30億只，鴨肉年產量超過500萬噸，年總產值高達500億元，是我國畜禽養殖業的主要經濟支柱產業之一，對我國社會發展具有重要意義[1-2]。然而，隨著養鴨規模的不斷擴大和集約化發展，鴨糞鏈球菌、鴨漿膜炎、小鴨肝炎、大腸桿菌病、禽流感等疾病頻繁發生，嚴重影響鴨的健康生產。糞鏈球菌是一種革蘭氏陽性菌，又稱糞腸球菌，是人和動物機體腸道內的一種主要菌，屬于條件性致病菌，當機體免疫功能改變或年齡、飲食等因素變化時，常會感染動物而發病，并可大范圍的水平傳播，給養鴨業帶來了極其嚴重的威脅[3]。因此，積極地分離、鑒定本病原菌，準確診斷該病，以便更好地防治鴨糞鏈球菌病。本研究選擇廣東省惠東縣某養鴨場內發生的疑似鴨糞鏈球菌病的6只患病鴨作為試驗對象，采集病料分離、鑒定病原菌，并進行藥敏試驗，旨在為本病的正確診斷和有效防治提供科學參考依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

LB液體培養基、葡萄糖肉湯、普通瓊脂培養板、麥康凱瓊脂培養基，購自北京索萊寶科技有限公司；PCR引物、10 × PCR buffer、dNTPs、Taq DNA 聚合酶等，購自大連寶生物有限公司；生化試驗鑒定試劑，購自杭州天和微生物試劑有限公司；藥敏試驗用紙片，購自天津利達醫療器材有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒，購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 病料來源

廣東省惠東縣某養鴨場內疑似鴨糞鏈球菌病的6只患病鴨，分別無菌采集心臟血液、關節液和肝臟組織，作為待檢病料。

1.3 病原菌的分離培養與顯微鏡檢查

分別將上述采集的三種病料劃線接種至普通瓊脂培養基、麥康凱瓊脂培養基上，37 ℃靜置培養 24 h，觀察細菌的生長狀態。挑取具有典型特征的單克隆菌落接種于普通營養瓊脂培養基上，37 ℃繼續培養24 h，然后挑取單個菌落分別接種至LB液體培養基和葡萄糖肉湯培養基中，轉移至37 ℃恒溫震蕩培養箱，繼續培養24 h，觀察病原菌的生長。將分離獲得的病原菌進行涂片和革蘭氏染色，光學顯微鏡下觀察其形態特征。

1.4 PCR檢測

按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取分離菌的基因組DNA，PCR檢測。PCR反應體系為：2 μL 10×PCR buffer，1.0 μL上游引物，1.0 μL下游引物，模板2.0 μL，0.5 μL Taq聚合酶，添加滅菌雙蒸水補充至20 μL體系。PCR反應參數設置為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30個反應循環；72 ℃繼續反應10 min，4 ℃保存。1%濃度的瓊脂糖凝膠對PCR反應產物進行電泳鑒定，觀察是否有特異性條帶產生。

1.5 生化試驗

按照細菌生化試驗鑒定試劑操作說明書中規定的試驗方法，將本試驗中分離培養的病原菌進行相關生化試驗鑒定，主要包括蔗糖、乳糖、麥芽糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、山梨糖、鼠李糖、β-半乳糖苷酶、甘露醇、山梨醇、衛矛醇、精氨酸水解、七葉苷水解、氧化酶、動力、硫化氫、硝酸鹽還原、水楊素等生化反應試驗。

1.6 藥敏試驗

采用藥敏紙片擴散法，對分離菌進行藥物敏感性試驗，主要包括四環素、環丙沙星、奈米替星、磷霉素、青霉素、克拉霉素、阿奇霉素、紅霉素、氨芐西林、頭孢他啶、頭孢噻吩、頭孢哌酮、頭孢唑林、頭孢呋辛、諾氟沙星、左氧氟沙星、氧氟沙星、萬古霉素等多種抗生素藥物。

2 結果

2.1 細菌分離培養與鏡檢結果

從組織病料中分離出6株病原菌，在普通培養基和麥康凱培養基上均可見較一致的針尖大小、光滑濕潤、半透明、灰白色、圓形凸起的露滴狀菌落。顯微鏡下觀察可見，革蘭氏陽性菌，呈單個、成對或多個菌體連接成短鏈狀排列，無芽孢。對照《伯杰氏鑒定細菌學手冊》，初步鑒定這6株分離菌均為糞鏈球菌。

2.2 PCR鑒定結果

針對糞鏈球菌16S rRNA特異性基因片段設計、合成擴增上下游引物，上游引物序列為：5’-ATGGCTGATGCTCCATAAGCG-3’，下游引物序列為：5’-GGTTACCTTCTTACGAGCTCGA-3’，應用該引物對6株分離菌進行PCR擴增檢測，均擴增出大小為546 bp的特異性電泳條帶，如圖1所示；這與預期的目的基因片段條帶大小相一致，PCR擴增結果進一步鑒定分離的病原菌為糞鏈球菌。

2.3 生化鑒定結果

將分離菌進行生化試驗鑒定，結果見表1。結果顯示，蔗糖、乳糖、麥芽糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、甘露醇、山梨醇、精氨酸水解、七葉苷水解、硝酸鹽還原、水楊素等生化試驗呈陽性，木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、β-半乳糖苷酶、衛矛醇、氧化酶、動力、硫化氫等生化試驗結果呈陰性。

2.4 藥敏試驗結果

分離菌的藥敏試驗抑菌情況見表2。分離菌對環丙沙星、磷霉素、氨芐西林、頭孢哌酮、諾氟沙星、左氧氟沙星、萬古霉素等幾種抗生素藥物較敏感，對克拉霉素、頭孢唑林、氧氟沙星等中等敏感，對其余抗生素耐藥。

3 討論

近年來，隨著科學規范化養鴨的不斷發展，對鴨病的防控已成為健康養殖的關鍵環節，且得到養殖者的重視。糞鏈球菌感染是養鴨業中比較常見的疫病之一，發病率和死亡率一直居高不下，給養鴨業造成了嚴重的經濟損失。因此，本試驗通過對鴨糞鏈球菌的分離、鑒定，為后續正確診斷和防治鴨糞鏈球菌病具有重要意義。大量研究文獻證明，鴨糞鏈球菌是一種革蘭氏陽性菌，無芽孢，能夠在各種培養基上形成針尖大小、光滑濕潤、半透明、灰白色、圓形凸起的露滴狀菌落，常呈單在、成對或多個菌體連接成短鏈狀排列[4]。本試驗從患病鴨的病料中分離獲得6株病原菌，觀察其培養和生長狀態，與糞鏈球菌的形態特征基本一致，初步說明本試驗分離的病原菌極有可能是糞鏈球菌。進一步結合PCR檢測，選擇糞鏈球菌高度保守基因序列16S rRNA作為靶標序列進行引物設計，應用該引物能夠在分離菌的基因組DNA中擴增出大小為546 bp的特異性電泳條帶，進一步證明了該6株分離菌為糞鏈球菌。

此外，生化試驗是利用生物化學反應的原理來測試細菌的代謝方式、代謝條件及代謝產物等，以此來鑒別該微生物屬于類別和種屬[5]。蔣文燦等[4]通過對四川省某肉鴨養殖場感染糞鏈球菌的瀕死鴨進行采集病料，分離培養后進行生化試驗，結果表明該分離培養獲得的鴨糞鏈球菌能夠發酵D-半乳糖、纖維二糖、果糖、甘露醇、蔗糖、麥芽糖、乳糖和葡萄糖，且產酸不產氣。本試驗研究中分離菌的生化試驗結果顯示，蔗糖、乳糖、麥芽糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、甘露醇、山梨醇、精氨酸水解、七葉苷水解、硝酸鹽還原、水楊素等生化反應為陽性。這與該病原菌的其它相關生化試驗研究報道結果相類似，表明本試驗中分離的6株病原菌均為鴨糞鏈球菌。

藥敏試驗是指在體外環境下對各種抗生素藥物殺菌或抑菌效果的一種檢測方法，主要是了解特定病原菌對各種抗生素藥物的敏感性和耐受程度，以便更好地指導臨床科學選擇適宜的抗生素，用于治療病原菌感染類疾病[6]。目前，常用的藥敏試驗方法主要有稀釋法、抗生素濃度梯度法、儀器分析法及藥敏紙片擴散法[7]。本試驗研究采用常規的藥敏紙片擴散法，選擇18種不同的抗生素藥物紙片對分離的糞鏈球菌進行藥敏試驗，結果顯示該糞鏈球菌對環丙沙星、磷霉素、氨芐西林、頭孢哌酮、諾氟沙星、左氧氟沙星、萬古霉素較敏感，對克拉霉素、頭孢唑林、氧氟沙星中等敏感，這為后續臨床合理用藥治療鴨糞鏈球菌病提供了科學依據。于泓洋等[8]從天津市某養牛場內感染糞鏈球菌的病牛中分離培養病原菌，進行藥敏試驗，其研究結果與本試驗中的結果相一致，這均為后續合理選擇抗生素、科學防治糞鏈球菌感染奠定了基礎。

4 結論

本研究對廣東省惠東縣某養鴨場內疑似糞鏈球菌感染的患病鴨分離培養病原菌，經鑒定分離的6株病原菌均為鴨糞鏈球菌，且對環丙沙星、磷霉素、氨芐西林、頭孢哌酮、諾氟沙星、左氧氟沙星、萬古霉素較敏感，這為今后本病正確診斷和有效防治提供科學參考依據。

參考文獻：

[1]劉徽.肉鴨場飼養管理與疾病防治分析[J].家禽科學，2023，45 （1）： 52-53.

[2]周廣馳.規?；B鴨常見疾病的診斷及防治[J].畜禽業，2021，32（9）：129+131.

[3]周改玲，喬宏興.番鴨感染糞腸球菌與沙門氏菌的分離鑒定、遺傳進化及耐藥基因檢測分析[J].家畜生態學報，2023，44（10）：82-88.

[4]蔣文燦，陳一資，王曉玉.商品肉鴨糞鏈球菌的分離鑒定[J].四川農業大學學報，1997（3）： 92-94.

[5]肖正中，凌文卿，蔡秋香，等.豬糞腸球菌的分離鑒定與藥物敏感性分析[J].韶關學院學報，2021，42（9）：48-52.

[6]陳曉慧，徐淑琴，馬祥兆，等.歐拉型藏羊源糞腸球菌的分離鑒定及藥敏實驗[J].食品工業科技，2021，42（22）：133-139.

[7]吳蘭，竹堃園，劉燕霏，等.多重耐藥性糞腸球菌的分離與鑒定[J].黑龍江畜牧獸醫，2019（9）：85-87+90+181.

[8]于泓洋，劉燕霏，楊建德.糞鏈球菌的分離與鑒定[J].黑龍江畜牧獸醫，2012（17）： 97-98.

Isolation and Identification of Duck Fecal Streptococcal Faecalis

Abstract： A diseased duck suspected of being infected with fecal streptococcus in a duck farm in Huidong County， Guangdong Province was selected for isolation and cultivation of pathogenic bacteria. Identification was carried out through microscopy， PCR detection， biochemical testing， and drug sensitivity testing. The result showed that the pathogen was identified as Streptococcus faecalis which is Gram positive. PCR detection can amplify a specific electrophoresis band with a size of 546 bp， which can detect xylose， arabinose， rhamnose β- The biochemical reaction test results of galactosidase， celastrol， oxidase， kinetic， hydrogen sulfide， etc. were negative， and they were more sensitive to several antibiotics such as ciprofloxacin， fosfomycin， ampicillin， cefoperazone， norfloxacin， levofloxacin， vancomycin， etc. The results of this study provide scientific reference for the correct diagnosis and effective prevention and treatment of this disease in the future.

Keywords： Separation; Identification; Duck; Streptococcus faecalis