河南省確山縣禽源沙門氏菌分離鑒定及其耐藥性研究

摘 要：本研究旨在了解河南省確山縣禽源沙門氏菌流行現狀、血清型分布及其耐藥性情況。采集來自不同家禽養殖場疑似沙門氏菌感染家禽的泄殖腔拭子、心血、肝等病料147份，通過細菌分離培養、生化鑒定、PCR擴增和血清分型試驗進行鑒定，采用K-B紙片法對所有鑒定為沙門氏菌的菌株進行耐藥性檢測。結果顯示：共獲得53株沙門氏菌，檢出率為36.05%，分屬A、B、C1、D群7個血清型，其中雞白痢沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌分別占比41.59 %、28.30%；分離菌株對氨芐西林、阿莫西林、慶大霉素、阿米卡星、阿奇霉素、復方新諾明耐藥性較高，分離菌株耐藥種類介于1～10種之間，以4、5、6重耐藥菌株最多，分別占比16.98%、22.64%、20.75%，多重耐藥率為86.79%。試驗結果表明，確山縣禽源沙門氏菌血清型比較復雜，以雞白痢沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌為優勢流行血清型。禽源沙門氏菌耐藥性嚴重，建議加強監測，開展綜合防控措施。

關鍵詞：禽源沙門氏菌；分離鑒定；血清分型；耐藥性

中圖分類號：S852.61 文獻標識碼：A 文章編號：1673-1085（2024）10-0033-06

沙門氏菌（Salmonella）是屬于腸桿菌科的革蘭氏陰性兼性厭氧菌，可感染鳥類、爬行動物和哺乳動物，包括人類。該菌血清型眾多，據報道，目前已發現2 600多種，且多數對人和動物具有致病性[1]。禽沙門氏菌病是由某些致病血清型沙門氏菌感染家禽的一類細菌性傳染病總稱，通常包括雞白痢、禽傷寒、禽副傷寒等，臨床表現出腹瀉、輸卵管炎、腹膜炎、敗血癥等多樣性癥狀[2]，發病迅速，病死率較高，降低家禽生產性能，給家禽業造成嚴重經濟損失。耐藥性是一個重大的全球性挑戰，其迅速出現歸因于人類、動物不恰當或過度使用抗菌藥物。家禽養殖過程中抗生素的長期不科學使用導致耐藥菌株不斷增多和耐藥性增強，嚴重限制了疾病的治療和防控。沙門氏菌耐藥性檢測對于有效監測該病臨床抗生素應用效果非常必要。

河南省確山縣家禽業發展較快，但沙門氏菌病一直是危害當地家禽業的重要疫病之一，且目前未見沙門氏菌流行情況的報道。本研究對2023年來自不同家禽養殖場疑似沙門氏菌病的病料進行分離鑒定，并檢測分離菌株的耐藥性，以期為本地禽源沙門氏菌綜合防控提供臨床數據、資料支撐。

1 材料與方法

1.1 病料和質控菌株

2023年1～12月份，無菌采集自確山縣不同規模養雞、鴨、鵝場疑似感染沙門氏菌病（主要癥狀為腹瀉、腸炎、敗血癥）的病死禽泄殖腔拭子、心血、肝、脾、腸道內容物等，共147份。質控菌株為大腸桿菌（CVCC3367）、腸炎沙門氏菌（CVCC3377），購自中國獸醫藥品監察所。

1.2 主要試劑

LB液體培養基、BS瓊脂、XLD瓊脂、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液，購自江西其云生物有限公司；法國科瑪嘉沙門氏菌屬顯色培養基，購自HiMedia公司；沙門氏菌顯色培養基，購自鄭州博賽生物技術研究所；沙門氏菌屬診斷血清，購自寧波天潤生物藥業有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、DL 2000 DNA Marker、2×Probe PCR PreMix，購自寶日醫生物技術（北京）有限公司；K-B藥敏紙片（12種），購自杭州微生物試劑有限公司。

1.3 引物設計合成

根據GenBank公布的沙門氏菌特異性基因fimY（登錄號：JQ665438.1）序列設計一對引物，引物序列為：fimY/F：5＇－CGCCCAGCCATACGGATAACC－3′；fimY/R：5′－TACCACGCAGGGAAAGACACC－3′。目的條帶約為427 bp，引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 菌株分離培養

將采集的病料使用2 mL生理鹽水稀釋成液體，按1∶10比例加入亞硒酸鹽胱氨酸增菌液，37 ℃培養24 h后，再取增菌液分別接種于SS培養基、麥康凱營養瓊脂，37 ℃純培養24 h，挑取典型菌落（半透明、灰白、表面光滑）接種于沙門氏菌顯色培養基，37 ℃培養16 h。收集單個菌落，革蘭氏染色、鏡檢，觀察菌體形態。

1.5 生化試驗

按照沙門氏菌生化鑒定試劑盒說明書操作，將純化培養的菌落接種于包含靛基質、硫化氫、氰化鉀、尿素、甘露醇、葡萄糖、山梨醇、賴氨酸、蔗糖、V-P試驗10種生化試驗項目的沙門氏菌生化鑒定條和鑒定管，37 ℃培養24 h，對照試劑盒說明書標準判定結果。

1.6 分離菌株PCR鑒定

典型菌落接種于LB液體培養基中，經純化培養后，利用細菌基因組試劑盒，嚴格遵循說明書操作，分別提取分離菌株和質控菌株的基因組DNA。以提取的基因組DNA為模板，采用特異性引物進行PCR擴增。PCR反應體系如下：2×Probe PCR PreMix 12.5 μL，DNA模板0.5 μL，上下游引物各1 μL，雙蒸水補足至總體積25 μL。PCR反應程序設定為：93 ℃預變性3 min，90 ℃變性30 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共運行35個循環；最后，72 ℃延伸8 min。同時設腸炎沙門氏菌標準株為陽性對照，大腸桿菌為陰性對照。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用凝膠成像儀記錄結果。

1.7 分離菌株血清型鑒定

參考《GB 4789.4-2016沙門氏菌檢驗》[3]中公布的玻片凝集試驗方法，待檢分離菌首先用A～F 多價O血清鑒定分離菌株O抗原，必要時鑒定Vi抗原，屬于A～F 各O群的菌型，依次用H因子血清檢查H抗原的第1相和第2相。具體操作為：取10 μL沙門氏菌診斷血清滴于載玻片中央，再取經純培養的單個菌落，使其與載玻片上的診斷血清混勻，1 min后觀察結果；同時設無菌生理鹽水為對照。出現凝集現象者為陽性，渾濁者為陰性。將鑒定出的O抗原和H抗原結構式，對照常見沙門氏菌抗原表，判斷分離菌株的血清型。

1.8 耐藥性試驗

采用美國和臨床實驗室標準協會（CLSI）公布的K-B紙片擴散法檢測所有分離菌株對12種抗菌藥物的藥敏性，腸炎沙門氏菌質控菌株為對照組。測量各抑菌圈直徑，參考CLSI藥敏標準判斷結果。

2 結果

2.1 細菌分離培養

病料接種于各培養基，37 ℃培養16～24 h，BS瓊脂培養基上可見棕褐色或灰綠色菌落，菌落四周培養基為黑色；XLD瓊脂培養基上可見中心黑色的粉紅色菌落，個別為黃色；法國科瑪嘉沙門氏菌顯色培養基上可見紫色菌落生長。革蘭氏染色為陰性，鏡檢分離菌株呈兩端稍微鈍圓的短桿菌，單個或數個聚集排列在一起。參考《GB 4789.4-2016沙門氏菌檢驗》標準以及顯色培養基說明書，初步判斷分離菌株為沙門氏菌，分離的53株菌株，其中雞源沙門氏菌為25株，鵝源和鴨源分別為12、16株。

2.2 生化試驗

采用沙門氏菌生化鑒定試劑盒進一步對53株疑似沙門氏菌進行生化試驗，結果見表1。結果顯示，所有分離菌株對山梨醇、甘露醇、葡萄糖、硫化氫、賴氨酸試驗為陽性，V-P試驗為陰性；50株分離菌靛基質試驗為陰性，3株為陽性，且這3株分離菌的血清凝集試驗出現凝集現象，顯示為陽性；同時發酵山梨醇、甘露醇；51株氰化鉀試驗陰性，而2株分離菌氰化鉀、賴氨酸試驗為陽性，尿素反應為陰性。參考《GB4789.4-2016 沙門氏菌檢驗》標準，判定3株分離菌為沙門氏菌靛基質陽性變體，2株分離菌與沙門氏菌Ⅳ或Ⅴ群生化特性一致[4]，其余菌株生化特性均符合沙門氏菌生化特性。

2.3 分離菌株的PCR擴增反應

利用特異性引物fimY—F/R對53株分離菌進行PCR擴增，擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示所有的分離菌在427 bp處有一條清晰的條帶，與目的條帶吻合，表明53株分離菌為沙門氏菌。部分擴增結果見圖1。

2.4 血清分型鑒定

血清型鑒定結果顯示，53株分離菌分屬A、B、C1、D群7個血清型；22株血清型為雞白痢沙門氏菌，占比41.59 %；15株為鼠傷寒沙門氏菌，占比28.30%；7株傷寒沙門氏菌，占比13.21%；3株乙型副傷寒，占比5.66%；圣保羅沙門氏菌、湯卜遜沙門氏菌和甲型副傷寒沙門氏菌各2株，分別占比3.77%。結果表明，確山縣禽源沙門氏菌血清型比較復雜，以雞白痢沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌為優勢流行血清型。

2.5 耐藥性檢測

利用K-B紙片法進行抗菌藥物檢測，結果見表2。分離菌株對氨芐西林、阿莫西林、慶大霉素、阿米卡星、阿奇霉素、復方新諾明耐藥性較高，耐藥率介于52.83%～88.68%；其余抗菌藥物耐藥率相對較低，介于11.32～45.28%。多重耐藥性分析結果見圖2。分離菌株耐藥種類介于1～10種之間，以4、5、6重耐藥菌株最多，分別占比16.98%、22.64%、20.75%，多重耐藥（耐藥種類≥3）率為86.79%。

3 討論

沙門氏菌病是一種在動物和人類之間傳播的傳染病，由多種沙門氏菌引起。沙門氏菌是兼性厭氧菌，可以在低氧、溫暖和潮濕的環境中生存，在家禽中傳播通常通過糞口途徑，一旦被攝入，很容易在家禽腸道中定植，粘附在腸道上皮細胞上，導致腸道穩態破壞，引發腸道內的炎癥反應并損害腸道屏障功能，從而導致感染禽腹瀉和生長障礙[5]，導致家禽業遭受重大經濟損失，并對公眾衛生健康構成風險。因此，開展沙門氏菌監測對于家禽養殖業的健康發展尤為重要。

血清分型是調查沙門氏菌感染流行病學狀況的基本生物標志物[6]。此外，由于不同地區、環境、飼養管理、用藥行為、用藥時期等因素會影響沙門氏菌血清型的分布，并且血清型鑒定有利于選擇候選疫苗株進行疫苗研制和應用。張若楠[7]報道，2020年7月—2021年6月，江蘇和安徽部分地區的禽源沙門氏菌總體分離率為12.26%（76/620），以鼠傷寒沙門菌（56.58%）和雞白痢沙門菌（34.21%）為優勢流行菌株，與本研究中確山縣禽源沙門氏菌優勢血清型的結果一致。撒朗文朱[8]報道，2020年12月—2021年8月，四川部分地區的禽源沙門氏菌總分離率為10.60%（100/943），鑒定出7種血清型，其中雞白痢沙門、鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌為優勢血清型。本研究對來自確山縣不同規模養禽場疑似感染沙門氏菌的147份病料進行細菌培養、生化反應試驗、分子生物學檢測和血清型鑒定試驗，分離鑒定出53株沙門氏菌，檢出率為36.05%，表明該地區禽源沙門氏菌感染比較普遍。血清型鑒定結果顯示，確山縣禽源沙門氏菌血清型比較復雜，分屬A、B、C1、D群7個血清型，其中優勢血清型為雞白痢沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌，說明危害確山縣家禽養殖業的沙門氏菌病主要為雞白痢和禽副傷寒，這為研發疫苗候選菌株提供了方向。不同地區沙門氏菌流行程度存在差異，這是因為許多因素影響沙門氏菌感染的嚴重程度，包括宿主年齡、宿主免疫力、合并感染、感染劑量、管理問題、環境壓力等[9]。本研究的試驗結果豐富了沙門氏菌的研究資源，為今后預防和控制該病的流行提供了重要數據支持。

長期以來，抗菌藥物廣泛應用于獸醫臨床和養殖生產，對于控制畜禽疫病發生和提高生產性能發揮了積極作用，但是，無節制地使用抗菌藥物破壞了家禽腸道菌群的平衡，導致抗菌藥物耐藥性不斷增強、耐藥譜進一步擴大，獸藥殘留問題已經成為人們關注的焦點。據報道，許多沙門氏菌存在抗生素耐藥性，自然地表現出對多種抗生素的耐藥性，包括氨基糖苷類、大環內酯類、頭孢菌素類、四環素類、磺胺類和多粘菌素類[10-12]。這種廣泛的自然耐藥性使該疾病的抗生素治療變得復雜。根據美國國家抗菌素耐藥性監測系統 （NARMS） 的數據，2019 年從雞肉和火雞肉零售肉中分離出的所有沙門氏菌血清型中，分別有29% 和7%是多重耐藥[13]。本研究對53株沙門氏菌抗菌藥物耐藥性檢測，結果顯示，所有菌株對氨芐西林、阿莫西林、慶大霉素、阿米卡星、阿奇霉素、復方新諾明耐藥性較高。多重耐藥性比較嚴重，分離菌株耐藥種類介于1～10種之間，以4、5、6重耐藥菌株最多，分別占比16.98%、22.64%、20.75%，多重耐藥（耐藥種類≥3）率高達86.79%。與溫錦芳等[14]、王瑤等[15]報道的沙門氏菌耐藥性研究結果存在差異，這是由于流行菌株、用藥行為、飼養管理等導致細菌耐藥性具有一定的差異性。本研究的耐藥性檢測分析表明，確山縣禽源沙門氏菌普遍存在比較嚴重的耐藥性。目前，益生菌、中草藥等天然免疫增強劑因其環境友好、副作用小、無化學殘留等優點，常被用作飼料添加劑來控制細菌性疾病。建議推廣應用抗菌肽、益生菌、抗菌性中草藥等作為飼料添加劑來控制沙門氏菌病流行，阻止耐藥性菌株的進一步擴大。

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