厚皮甜瓜‘SN-1’組培再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

關(guān)鍵詞：厚皮甜瓜；組培再生；遺傳轉(zhuǎn)化

甜瓜為葫蘆科瓜類(lèi)蔬菜，因其果實(shí)味甜多汁、香氣濃郁、且富含多種維生素和有機(jī)酸等營(yíng)養(yǎng)成分，深受消費(fèi)者喜愛(ài)，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。然而，目前我國(guó)甜瓜產(chǎn)業(yè)仍存在品種單一、趨同性高，高端、優(yōu)質(zhì)、特色品種匱乏等問(wèn)題，亟待通過(guò)持續(xù)的種源創(chuàng)新，推動(dòng)育種工作高質(zhì)量發(fā)展［1，2］。組培再生和遺傳轉(zhuǎn)化是開(kāi)展功能基因組學(xué)研究的前提條件之一。前人對(duì)甜瓜的組培再生體系展開(kāi)研究，成功誘導(dǎo)出多個(gè)品種的愈傷組織并獲得再生植株［1，3-5］；由于其類(lèi)型多樣，遺傳背景差異較大，因此組培再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系仍不成熟，存在不定芽和根系分化困難、轉(zhuǎn)化效率低等問(wèn)題。

影響甜瓜組培再生的因素包括基因型、苗齡、外植體類(lèi)型、培養(yǎng)基組分、激素種類(lèi)和配比等［6-9］。研究表明，不同類(lèi)型甜瓜間再生效果差異明顯，且薄皮類(lèi)型再生效率高于厚皮類(lèi)型［6］，不同品種甜瓜外植體的最佳取樣的時(shí)間為播種后2～6d［9，10］。培養(yǎng)基成分、特別是激素種類(lèi)和配比對(duì)外植體再生影響顯著。甜瓜組培中常用的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑包括6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）、吲哚-3-乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）等，其中6-BA為愈傷和不定芽誘導(dǎo)所必需，使用濃度一般在0.5～2.0mg·L-1，適量添加IAA或ABA可平衡內(nèi)源激素水平，抑制玻璃化的發(fā)生［11］。同時(shí)，遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程亦受到農(nóng)桿菌菌株種類(lèi)、侵染和共培養(yǎng)時(shí)間等因素影響，導(dǎo)致不同材料間轉(zhuǎn)化效率差異顯著［12］。課題組前期構(gòu)建了薄皮甜瓜‘YJM’的組培再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系［13］，但厚皮甜瓜如‘SN-1’在該體系條件下極易出現(xiàn)不定芽玻璃化和生根困難等問(wèn)題。針對(duì)這些難點(diǎn)，本研究通過(guò)篩選和優(yōu)化種子處理方法、外植體處理?xiàng)l件、共培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基成分、激素配比等，建立了適于‘SN-1’的組培再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系，為厚皮甜瓜種源創(chuàng)制和分子設(shè)計(jì)育種奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試甜瓜材料 供試材料為厚皮甜瓜（CucumismeloL.ssp.melo）自交系‘SN-1’，試驗(yàn)地點(diǎn)為山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃淮地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 菌株及載體 雙元表達(dá)載體pFGC5941-CRISPR_CmPMI1由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；大腸桿菌菌株Trans1-T1和農(nóng)桿菌菌株EHA105分別購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司和上海唯地生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 種子萌發(fā)和消毒條件的篩選 選取飽滿(mǎn)均一的甜瓜種子，滅菌后置于Agar、1/2MS+Agar和MS+Agar3種萌發(fā)培養(yǎng)基，28℃、暗培養(yǎng)2d后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率和整齊度；隨后配制3種濃度NaClO消毒液（2%、3%和4%，v/v），對(duì)種子分別進(jìn)行10、15、20和25min處理，28℃、暗培養(yǎng)2d后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率和整齊度。試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，每組30粒種子。

1.2.2 外植體收集時(shí)間和方法的篩選 在播種后24、32、40、48和56h收集子葉節(jié)，置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基［13］，在28℃、光周期16h/8h、光強(qiáng)8000lx條件下培養(yǎng)4周，統(tǒng)計(jì)不定芽分化情況。進(jìn)一步以“二分法”和“四分法”切取外植體（圖1），置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基、相同環(huán)境條件下培養(yǎng)3d后，統(tǒng)計(jì)外植體轉(zhuǎn)綠時(shí)間、污染率和不定芽分化情況。試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，每組15粒種子。

1.2.3 誘導(dǎo)和生根培養(yǎng)基激素配比的篩選 收集子葉節(jié)，置于含不同濃度6-BA（0.25、0.5、1和2mg·L-1）的誘導(dǎo)培養(yǎng)基［13］，環(huán)境條件同1.2.2，28d后統(tǒng)計(jì)不定芽分化和玻璃化情況；在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步添加不同濃度IAA和ABA（表1，IM-1～I(xiàn)M-16），培養(yǎng)4周后統(tǒng)計(jì)不定芽分化和玻璃化情況。切取長(zhǎng)度3cm左右的不定芽，轉(zhuǎn)至含不同濃度IAA的生根培養(yǎng)基（表1，RM-1～RM-5），環(huán)境條件同1.2.2，10d后統(tǒng)計(jì)生根率。試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，每組20個(gè)子葉節(jié)或不定芽。

1.2.4 共培養(yǎng)條件的篩選 將農(nóng)桿菌侵染后的子葉節(jié)置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基，28℃、暗培養(yǎng)1～4d，統(tǒng)計(jì)外植體污染情況；進(jìn)一步配制不同激素配比共培養(yǎng)培養(yǎng)基（表1，CM-1～CM-5），28℃、暗培養(yǎng)3d后，統(tǒng)計(jì)外植體褐化和污染情況。試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，每組20個(gè)子葉節(jié)。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗的鑒定 取適量葉片充分研磨，隨后將PAT/BAR金標(biāo)免疫快速檢測(cè)試紙條浸入組織勻漿，室溫靜置5min，觀(guān)察顯色結(jié)果以確定再生植株Basta抗性；進(jìn)一步利用CTAB法提取基因組DNA，PCR擴(kuò)增、Sanger測(cè)序分析靶位點(diǎn)突變情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同萌發(fā)培養(yǎng)基對(duì)‘SN-1’種子萌發(fā)的影響

如圖2所示，Agar、1/2MS+Agar和MS+Agar三種培養(yǎng)基上種子萌發(fā)率雖無(wú)顯著差異，但在萌發(fā)整齊度和時(shí)間方面卻差異明顯，其中Agar組兩指標(biāo)（86%和40h）均優(yōu)于1/2MS+Agar（78%和45h）和MS+Agar組（70%和55h），故選擇其為‘SN-1’的萌發(fā)培養(yǎng)基。

2.2 消毒劑配比和處理時(shí)間對(duì)‘SN-1’種子萌發(fā)的影響

以不同濃度NaClO溶液對(duì)種子進(jìn)行消毒處理，28℃、暗培養(yǎng)2d后統(tǒng)計(jì)其萌發(fā)率和整齊度，結(jié)果如圖3A～B所示，三組種子萌發(fā)率雖無(wú)顯著差異，但整齊度指標(biāo)差異明顯，其中2%和3%兩組均在85%以上，而4%組僅為60%，顯著低于前兩組；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)3%組種子萌發(fā)率和整齊度均值分別為95.3%和88.9%，略高于2%組兩指標(biāo)的均值（92%和72%），故選擇該濃度消毒劑進(jìn)行種子處理。隨后比較不同消毒時(shí)間對(duì)種子萌發(fā)的影響，結(jié)果如圖3C～D所示，隨著處理時(shí)間的增加，種子萌發(fā)率和整齊度呈先上升后下降的趨勢(shì)，其中15min處理的種子兩指標(biāo)分別為91%和88%，顯著優(yōu)于其他處理，因而確定其為最佳消毒時(shí)間。

2.3 外植體切取方式和時(shí)間對(duì)‘SN-1’子葉節(jié)組培再生的影響

如圖4A～C所示，相較傳統(tǒng)的“二分法”，“四分法”取樣在不影響子葉節(jié)轉(zhuǎn)綠時(shí)間、污染率和不定芽分化率的前提下，大幅度增加了外植體的獲取數(shù)量和種子的利用率；進(jìn)一步對(duì)子葉節(jié)取樣時(shí)間進(jìn)行篩選，結(jié)果如圖4D～E所示，不同時(shí)期子葉節(jié)的不定芽誘導(dǎo)率差異明顯，相較其他取樣時(shí)期，以播后48h、胚根長(zhǎng)度約5mm的種子為供體所收集的子葉節(jié)，不定芽分化率最高（75.3%），因此該時(shí)期為‘SN-1’外植體最佳取樣時(shí)間。

2.4 不同激素濃度和配比對(duì)‘SN-1’子葉節(jié)組培再生的影響

如圖5A～B所示，隨著誘導(dǎo)培養(yǎng)基中6-BA濃度的增加，不定芽分化率呈先升高后降低的趨勢(shì)，玻璃化率則逐漸升高，其中6-BA濃度0.5mg·L-1時(shí)子葉節(jié)的不定芽誘導(dǎo)率可達(dá)85%，顯著優(yōu)于其他處理，且不定芽玻璃化率較低、大多可分化為正常植株；在此6-BA濃度基礎(chǔ)上添加IAA和ABA，分析不同激素配比對(duì)不定芽分化和玻璃化的影響，結(jié)果如圖5C～D所示，相較其他激素組合，IM-10不定芽分化率最佳，達(dá)到90%以上，且玻璃化率較低，因此誘導(dǎo)培養(yǎng)基的激素配比確定為0.5mg·L-16-BA+0.05mg·L-1IAA+1mg·L-1ABA。進(jìn)一步分析IAA對(duì)‘SN-1’生根的影響，結(jié)果如圖6所示，再生苗在不同IAA濃度生根培養(yǎng)基上均可產(chǎn)生不定根，但所需時(shí)間存在差異，當(dāng)IAA濃度為0.4mg·L-1時(shí)生根率最高、且生根時(shí)間最短，因此該濃度為最佳。

2.5 共培養(yǎng)條件對(duì)‘SN-1’子葉節(jié)組培再生的影響和轉(zhuǎn)基因材料的獲得

共培養(yǎng)是農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中的關(guān)鍵步驟之一［14］。對(duì)共培養(yǎng)培養(yǎng)基的激素組成進(jìn)行篩選，結(jié)果如圖7A～B所示，CM-2（MS+0.5mg·L-16-BA+0.1mg·L-1IAA+9g·L-1Agar）子葉節(jié)的存活率和褐化率較CM-1、CM-3～CM-5四組為優(yōu)，故確定該激素組合為最佳；進(jìn)一步比較共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)子葉節(jié)生長(zhǎng)的影響，結(jié)果如圖7C～F所示，子葉節(jié)隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸膨大、至3d時(shí)達(dá)到最佳，當(dāng)4d時(shí)因農(nóng)桿菌大量出現(xiàn)而使其生長(zhǎng)受到抑制，因此確定暗處理3d為本研究所用共培養(yǎng)時(shí)間；隨后對(duì)再生苗的進(jìn)行Basta抗性和測(cè)序驗(yàn)證，鑒定到具有Basta抗性、且目標(biāo)基因發(fā)生兩個(gè)堿基缺失的植株，表明‘SN-1’的組培再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系已成功建立。

3 討論

前人研究表明，種子生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)不定芽誘導(dǎo)效率至關(guān)重要［15］。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)甜瓜種子消毒條件、外植體收收集時(shí)間和制備方法等進(jìn)行篩選優(yōu)化，顯著提高了種子利用率和不定芽分化率（圖2-3）。甜瓜組培再生與激素濃度和配比關(guān)系密切［16，17］，添加不同激素會(huì)直接影響外植體生長(zhǎng)狀態(tài)和不定芽誘導(dǎo)效果［18］。本試驗(yàn)對(duì)誘導(dǎo)培養(yǎng)基的激素配比進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)隨著6-BA濃度的升高，甜瓜愈傷組織和不定芽的玻璃化迅速加重，進(jìn)而影響不定芽的分化和伸長(zhǎng)；當(dāng)添加了IAA和ABA兩種激素后，不定芽玻璃化程度顯著減輕、分化率顯著提高。這與高寧寧等［1］和王果等［19］研究結(jié)果類(lèi)似。

有報(bào)道指出，IAA對(duì)側(cè)根的形成和發(fā)育有顯著影響［19］，低濃度時(shí)可促進(jìn)葉菜型甘薯不定根生長(zhǎng)，而高濃度抑制其生長(zhǎng)［20］。據(jù)此，我們?cè)谏囵B(yǎng)基中添加了IAA，并對(duì)其適宜濃度進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)在一定范圍內(nèi)IAA濃度的增加可顯著縮短不定芽的生根時(shí)間，但當(dāng)其濃度超過(guò)0.8mg·L-1時(shí)，會(huì)導(dǎo)致再生苗早衰、生長(zhǎng)受抑等（圖6）。

遺傳轉(zhuǎn)化效率受多種因素的影響。李娟等在西瓜研究中發(fā)現(xiàn)，農(nóng)桿菌在外植體切口處需保持至少16h，才有可能誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生愈傷組織并啟動(dòng)侵染過(guò)程，因此建議共培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)超過(guò)16h［21］。本研究對(duì)‘SN-1’共培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)處理時(shí)間3d效果最佳，若時(shí)間過(guò)短，外植體無(wú)法完全膨大，影響后續(xù)不定芽分化，但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則會(huì)導(dǎo)致農(nóng)桿菌過(guò)度侵染，外植體出現(xiàn)死亡、褐化等（圖7C～F），這與劉麗峰等［22］結(jié)果一致。隨后對(duì)激素配比進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加ABA極易導(dǎo)致外植體褐化、死亡，因此‘SN-1’共培養(yǎng)所用培養(yǎng)基僅添加了適宜濃度6-BA和IAA，這與萬(wàn)麗麗等［12］研究結(jié)果有所差異，可能是由甜瓜品種間差異所致。

4 結(jié)論

本研究建立了厚皮甜瓜‘SN-1’的組培再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系，發(fā)現(xiàn)以3%NaClO溶液處理種子15min、Agar培養(yǎng)基作為萌發(fā)培養(yǎng)基，滅菌和萌發(fā)效果最佳；播種后48h、胚根長(zhǎng)度約5mm時(shí)，所收集子葉節(jié)的不定芽分化效果最優(yōu)；最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基配方分別為（MS+0.5mg·L-16-BA+0.05mg·L-1IAA+1mg·L-1ABA+9g·L-1Agar）和（MS+0.4mg·L-1IAA+9g·L-1Agar）；農(nóng)桿菌侵染的子葉節(jié)置于含0.5mg·L-16-BA和0.1mg·L-1IAA的MS固體培養(yǎng)基、共培養(yǎng)3d，其生長(zhǎng)均一、污染率最低、且后期愈傷誘導(dǎo)和不定芽分化最好。