白術內酯Ⅲ調節Shh/Ptch1信號通路對腦卒中大鼠神經功能的影響

摘要 目的：探究白術內酯Ⅲ（ATⅢ）調節音猬因子（Shh）/碎片蛋白1（Ptch1）信號通路對腦卒中大鼠神經功能損傷的影響。方法：將60只大鼠隨機分為假手術組（sham組）、大腦中動脈閉塞（MCAO）組、ATⅢ L組、ATⅢ M組、ATⅢ H組與ATⅢ H＋Cyclopamine組，每組10只。ATⅢ L組、ATⅢ M組、ATⅢ H組分別灌胃0.5、1.0、2.0 mg/kg ATⅢ；ATⅢ H＋Cyclopamine組灌胃2 mg/kg ATⅢ，同時經尾靜脈注射10 mg/kg的Shh信號特異性阻斷劑環巴胺；sham組和MCAO組灌胃等量的生理鹽水。各組大鼠給藥每日1次，均連續給藥4周。進行平衡木行走實驗評分和神經功能缺損評分；檢測腦組織含水量；蘇木素-伊紅（HE）染色和尼氏染色檢測腦組織神經元損傷情況；蛋白質免疫印跡法檢測腦組織中Shh、Patch1蛋白表達。結果：與MCAO組相比，ATⅢ L組、ATⅢ M組、ATⅢ H組大鼠平衡木實驗評分、神經功能缺損評分、腦組織含水量明顯降低，尼氏小體及腦組織中Shh、Patch1蛋白表達增加（P＜0.05）；與ATⅢH組相比，ATⅢ H＋Cyclopamine組大鼠平衡木實驗評分、神經功能缺損評分及腦組織含水量明顯升高，尼氏小體數量及腦組織中Shh、Patch1蛋白表達明顯降低（P＜0.05）。結論：ATⅢ可改善缺血性腦卒中大鼠神經功能缺損，其作用機制和Shh/Ptch1信號通路激活有關。

關鍵詞 腦卒中；白術內酯Ⅲ；音猬因子/碎片蛋白1信號通路；神經功能；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.20.008

作者單位 中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇一醫院（合肥 230031），E-mail：neighpey124@21cn.com

引用信息 周茜，陸平.白術內酯Ⅲ調節Shh/Ptch1信號通路對腦卒中大鼠神經功能的影響［J］.中西醫結合心腦血管病雜志，2024，22（20）：3704-3709.

腦卒中是臨床常見的一種腦血管疾病，具有較高的致殘率和致死率^［1］。缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）是腦卒中常見類型之一，占所有腦卒中的75%～90%，其會中斷局部腦組織血流，促進組織軟化壞死及神經系統紊亂，從而導致病人出現昏迷或死亡^［2-3］。白術內酯Ⅲ（atractylenolide Ⅲ，ATⅢ）是白術的主要活性成分，有研究發現，白術內酯Ⅲ可顯著改善癡呆大鼠的學習記憶能力^［4］，但目前關于其對腦卒中大鼠神經功能的改善作用鮮有報道。音猬因子（sonic hedgehog，Shh）是一種分泌蛋白，在機體的組織和器官中廣泛表達，可介導胚胎組織器官的生成發育，且對缺血性損傷有較好的促進作用^［5-6］。Shh可結合特定的受體碎片蛋白1（patched 1，Ptch1）而解除Ptch1，通過抑制G蛋白偶聯受體平滑蛋白（smoothened，Smo）而激活下游轉錄因子膠質瘤相關癌基因同源物（glima-associated oncogene homolog，Gli-1），從而啟動與細胞周期進程相關的靶基因的表達。有研究發現，激活癡呆大鼠腦組織中Shh/Ptch1通路，可改善大鼠的認知功能障礙^［7-8］。但目前關于Shh/Ptch1通路對腦卒中大鼠神經功能的影響報道較少。因此，本研究旨在探究ATⅢ通過調節Shh/Ptch1信號通路對腦卒中大鼠神經功能損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

60只雄性SD大鼠均購自青海大學醫學院動物實驗中心，許可證號：SCXK（青）2018-0013。大鼠體質量為220～240 g，將大鼠統一飼養在動物房內，溫度22～25 ℃，相對濕度為50%，光照明暗12 h/12 h循環交替，自由飲水攝食，適應性喂養1周。

1.2 試劑和儀器

AT Ⅲ（純度＞99.91%，上海純優生物科技有限公司）；尼氏染色液、RIPA裂解液（上海碧云天生物科技有限公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白試劑盒、Trizol試劑盒、反轉錄試劑盒（賽默飛世爾科技中國公司）；蘇木素染色液、伊紅染色液（北京雷根生物技術有限公司）；Shh信號特異性阻斷劑環巴胺（美國MCE公司）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）（美國Sigma公司）；兔抗鼠Shh抗體、兔抗鼠Ptch1抗體（美國Santa Cruz公司）；組織研磨器（武漢新縱科生物技術有限公司）。

1.3 分組和模型制備^［9］

將60只大鼠隨機分為6組：假手術組（sham組）、大腦中動脈閉塞（MCAO）組、ATⅢ L組、ATⅢ M組、ATⅢ H組與ATⅢ H＋Cyclopamine組，每組10只。各組大鼠參照Longa等方法制備缺血性腦卒中模型。麻醉大鼠并固定于鼠板上，切開大鼠頸部正中線處皮膚，將頸總動脈、頸內動脈和頸外動脈分離，將頸總動脈的近心端和頸外動脈的分叉處結扎，用手術線在頸總動脈遠心端靠近頸總動脈分叉處打一個活結，將頸內動脈夾閉，在頸總動脈上用眼科剪剪一個V形的小口，用鑷子將蘸有石蠟的線栓插入頸總動脈，直到有輕微阻力時停止插入。將頸總動脈遠心端靠近頸總動脈分叉處全部結扎，縫合大鼠頸部皮膚，碘附消毒。腦缺血2 h后，拔出線栓形成再灌注。sham組除不插入線栓外，步驟和其余各組相同。造模成功標準：大鼠出現神經功能缺損。

造模成功后2 h，ATⅢ L組、ATⅢ M組、ATⅢ H組分別灌胃0.5、1.0、2.0 mg/kg ATⅢ；ATⅢ H＋Cyclopamine組灌胃2.0 mg/kg ATⅢ，同時經尾靜脈注射10 mg/kg的Shh信號特異性阻斷劑環巴胺；sham組和MCAO組灌胃等量的生理鹽水。各組大鼠給藥每日1次，均連續給藥4周。

1.4 平衡木行走實驗評分

分別于造模后1 d、給藥1周、2周、4周時測定運動整合及協調能力，將長80 cm、寬2.5 cm的平衡木平放在距離地面高10 cm處，術前1周訓練大鼠能順利在平衡木上行走，每天早晚各1次，每次10 min。按照Feeney 5級評分標準評分，詳見表1。

1.5 神經功能缺損評分

采用Zeo Longa 5分評定法對大鼠神經功能進行評分，評分標準見表2。

1.6 腦組織含水量測定

隨機處死各組部分大鼠，立即取腦，摘掉小腦及腦干，將腦組織表面的血液沖洗并擦拭干凈，沿大腦的中線切開腦組織，稱取缺血側腦組織重量為濕重；將稱量濕重后的腦組織置于恒溫烘烤箱中，烘干腦組織之恒重后稱取重量為干重。用濕重減干重再除以濕重計算各組大鼠腦組織含水量。

1.7 蘇木素-伊紅（HE）染色

麻醉大鼠并取大鼠缺血側腦組織，固定腦組織于4%多聚甲醛溶液中，48 h后經乙醇梯度脫水，后將切片組織用石蠟包埋，用切片機將組織切成薄片，厚度為3 μm，分別經HE染色，于顯微鏡下觀察腦組織中神經元病理學變化。

1.8 尼氏染色

取1.7中切片脫蠟處理，在37 ℃環境中用硫堇染色切片1 h。將切片分化5 s，消除切片中大部分的染色。中性樹膠將清洗后的切片組織封片。光學顯微鏡下觀察大腦皮層和海馬CA1區細胞形態，以評估腦損傷。

1.9 蛋白質印跡法檢測腦組織中Shh、Ptch1蛋白表達

收集胃黏膜組織，提取組織中總蛋白， 3，3′-二氨基聯苯胺（DAB）法檢測蛋白濃度。配置等濃度蛋白溶液2 μg/mL，體積的煮沸溶液10 min后保存蛋白溶液于－20 ℃的冰箱。取蛋白樣品30 μg，電泳蛋白樣品后轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，加入5%的脫脂奶粉到PVDF膜上，封閉PVDF膜1 h，分別加入一抗Shh、Ptch1（1∶1 000），在4 ℃環境中孵育一抗過夜，后清洗PVDF膜，加入相應的二抗（1∶1 000），室溫孵育二抗2 h。將電化學發光（ECL）劑加入細胞中曝光，用顯影液顯影，用Image Lab軟件分析各條帶灰度值。

1.10 倫理審查

本研究獲得我院醫學倫理委員會審核批準（審批號：PH-2024-05-36）。

1.11 統計學處理

實驗數據采用Graphpad priam 8.0軟件進行統計學分析。符合正態分布的定量資料用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），各組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠平衡木實驗評分比較

造模后1 d，MCAO組、ATⅢ L組、ATⅢ M組、ATⅢ H組和ATⅢ H＋Cyclopamine組大鼠平衡木實驗評分相比差異無統計學意義（P＞0.05），且各組評分均高于sham組（P＜0.05）；給藥后1周、2周、4周時與MCAO組相比，ATⅢ L組、ATⅢ M組、ATⅢ H組大鼠平衡木實驗評分明顯降低，且呈濃度依賴性（P＜0.05）；與ATⅢ H組相比，ATⅢ H＋Cyclopamine組大鼠平衡木實驗評分明顯升高（P＜0.05）。詳見表3。

2.2 各組大鼠神經功能評分比較

MCAO組大鼠神經功能評分較sham組增加（P＜0.05）；與MCAO組相比，ATⅢ L組、ATⅢ M組、ATⅢ H組大鼠神經功能評分均逐漸降低，呈濃度依賴性（P＜0.05）；與ATⅢ H組相比，ATⅢ H＋Cyclopamine組大鼠神經功能評分明顯增加（P＜0.05）。詳見圖1。

2.3 各組大鼠缺血側腦組織含水量比較

與sham組相比，MCAO組大鼠缺血側腦組織含水量明顯增加（P＜0.05）；與MCAO組相比，ATⅢ L組、ATⅢ M組、ATⅢ H組大鼠缺血側腦組織含水量明顯降低，且呈劑量依賴性（P＜0.05）；與ATⅢ H組相比，ATⅢ H＋Cyclopamine組大鼠缺血側腦組織含水量明顯升高（P＜0.05）。詳見圖2。

2.4 各組大鼠腦組織病理學變化比較

sham組大鼠腦組織神經元排列整齊緊密，細胞大小均一，神經結構清晰，細胞膜完整且核膜清晰，胞質感染均勻；MCAO組大鼠有大量壞死的神經細胞，神經元細胞減少，細胞膜破裂，核膜消失，胞質染色變淺；ATⅢ L組、ATⅢ M組、ATⅢ H組大鼠神經元損傷程度較MCAO組明顯改善，僅有少部分神經元壞死及細胞核膜破裂，胞質染色逐漸均勻，且隨著ATⅢ濃度的增加神經元損傷程度減輕；ATⅢH＋Cyclopamine組神經元損傷程度較ATⅢ H組加重，與MCAO組相似。詳見圖3。

2.5 各組大鼠尼氏小體數量比較

sham組大鼠神經元細胞尼氏小體結構完整，多呈三角形；MCAO組大鼠尼氏小體數量較sham組明顯減少（P＜0.05）；與MCAO組相比，ATⅢ L組、ATⅢ M組、ATⅢ H組尼氏小體數量逐漸增加，且呈劑量依賴性（P＜0.05）；與ATⅢ H組相比，ATⅢH＋Cyclopamine組大鼠尼氏小體數量明顯降低（P＜0.05）。詳見圖4、圖5。

2.6 各組大鼠腦組織中Shh、Ptch1蛋白表達比較

與sham組相比，MCAO組、ATⅢ L組、ATⅢ M組、ATⅢ H組大鼠腦組織中Shh、Patch1蛋白表達均明顯增加（P＜0.05），且ATⅢ L組、ATⅢ M組、ATⅢ H組大鼠腦組織中Shh、Patch1蛋白表達明顯高于MCAO組（P＜0.05）；與ATⅢH組相比，ATⅢ H＋Cyclopamine組大鼠腦組織中Shh、Patch1蛋白表達明顯降低（P＜0.05）。詳見圖6～圖8。

3 討 論

缺血性腦卒中是一種常見的急性腦血液循環障礙性疾病，其病理機制復雜，和炎癥、細胞凋亡、氧化應激等多種因素密切相關^［9-10］。目前組織型纖溶酶原激活物（tissue plasminogen activator，tPA）是臨床治療缺血性腦卒中最有效的藥物之一，但由于tPA的有效治療窗口僅為4～6 h，且在治療過程中極易發生出血轉化，因此其在臨床上的應用具有一定局限性。據統計，1966年至今，僅有不足5%的缺血性腦卒中病人得到了tPA的有效治療^［11］，且目前多種治療缺血性腦卒中的神經保護劑在臨床的應用效果并不理想，由此可見開發新的防治缺血性腦卒中的藥物是目前臨床研究的重中之重。

本研究采用Longa線栓法制備缺血性腦卒中大鼠模型，其由于簡便易操作，對動物的創傷性小，可重復性高，且和臨床上腦卒中病理體征相似，被學者們廣泛應用。本研究結果顯示，MCAO組大鼠平衡木實驗評分明顯降低，神經功能缺損評分和腦組織含水量明顯升高，且HE染色顯示神經細胞有大量的壞死，說明缺血性腦卒中模型制備成功。尼氏小體是神經元內嗜酸性顆粒，當神經功能正常時其結構較固定，當神經功能損傷時，尼氏小體會減少甚至溶解，因此，通過尼氏小體數量可判斷腦組織神經功能損傷情況^［12］。本研究結果顯示，MCAO組大鼠尼氏小體數量明顯減少，進一步說明缺血性腦卒中大鼠有明顯的神經功能損傷。白術為菊科植物白術的干燥根莖，其氣清香，性溫，味甘苦，具有益氣、健脾、止汗等功效，常被用于治療脾虛食少、慢性腹瀉、水腫、自汗等癥狀^［13］，近年來，藥理學研究表明，白術還具有抗菌、抗衰老、調節免疫等作用，且對神經系統也有一定的調節作用^［14］。ATⅢ是常用中藥白術中含有的一種內酯類有效成分，有研究發現，與MCAO組比較，ATⅢ能夠通過抑制caspase-3信號通路抑制谷氨酸誘導的細胞凋亡，還能減輕慢性高劑量注射同型半胱氨酸誘導的學習記憶障礙^［15］。本研究結果顯示，與MCAO組比較，ATⅢ L組、ATⅢ M組、ATⅢ H組大鼠平衡木實驗評分、神經功能缺損評分和腦組織含水量降低，神經細胞壞死數量減少，尼氏小體數量增加，提示ATⅢ可改善缺血性腦卒中大鼠神經功能缺損，減輕腦水腫，且呈濃度依賴。陳潔^［16］研究證實，ATⅢ可通過抑制酪氨酸蛋白激酶2（JAK2）/信號轉導和轉錄激活因子3（STAT3）/線粒體動力相關蛋白（Drp1）通路減小MCAO小鼠腦梗死面積，促進腦血流量恢復，改善腦缺血損傷。

Shh是Hedgehog基因家族成員之一，其信號由Shh蛋白、兩個跨膜蛋白質受體Ptched和Smoothened組成的受體復合物以及下游的鋅指轉錄因子Gli蛋白家族等組成^［17］。分泌型信號蛋白是Shh信號通路級聯反應的啟動信號，跨膜受體Ptched和Smoothened是Shh信號傳導通路的介導受體。當無信號傳導時，Ptched與Smoothened結合并抑制其活性，而當Shh蛋白和Ptched蛋白結合后，Ptched就解除了對Smoothened的抑制作用^［18］。研究發現，Shh蛋白在腦缺血大鼠模型急性期有短暫性的升高，而外源性Shh蛋白能夠保護受損神經細胞^［19］。本研究結果顯示，MCAO組大鼠腦組織中Shh、Ptch1蛋白表達升高，提示腦缺血發生時腦組織中Shh、Ptch1蛋白短暫性的升高保護腦組織，和上述研究一致。通過給予ATⅢ發現，ATⅢ L組、ATⅢ M組、ATⅢ H組大鼠腦組織中Shh、Ptch1蛋白表達高于MCAO組，提示ATⅢ可增加缺血性腦卒中大鼠腦組織中Shh/Ptch1信號的激活。許俊杰等^［20］研究發現，Shh信號可改善MCAO大鼠神經功能，降低梗死面積。因此，推測Shh/Ptch1信號可能是ATⅢ改善腦卒中大鼠神經損傷的作用機制，為了驗證這一猜想，本研究采用Shh/Ptch1信號通路特異性阻斷劑環巴胺和高劑量的ATⅢ共同干預缺血性腦卒中大鼠，結果顯示，ATⅢ H＋Cyclopamine組大鼠較ATⅢ H組平衡木實驗評分、神經功能缺損評分和腦組織積水量明顯升高，尼氏小體數量減少，提示環巴胺能抑制ATⅢ對缺血性腦卒中大鼠神經功能缺損的改善作用。

綜上所述，ATⅢ可改善缺血性腦卒中大鼠神經功能缺損，其作用機制和Shh/Ptch1信號通路激活有關。

參考文獻：

［1］ FESKE S K.Ischemic stroke［J］.The American Journal of Medicine，2021，134（12）：1457-1464.

［2］ HERPICH F，RINCON F.Management of acute ischemic stroke［J］.Critical Care Medicine，2020，48（11）：1654-1663.

［3］ RABINSTEIN A A.Update on treatment of acute ischemic stroke［J］.Continuum，2020，26（2）：268-286.

［4］ YANG L，YU H，HOU A J，et al.A review of the ethnopharmacology，phytochemistry，pharmacology，application，quality control，processing，toxicology，and pharmacokinetics of the dried rhizome of Atractylodes macrocephala［J］.Frontiers in Pharmacology，2021，12：727154.

［5］ AKULA S K，MARCIANO J H，LIM Y，et al.TMEM161B regulates cerebral cortical gyration，sonic hedgehog signaling，and ciliary structure in the developing central nervous system［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2023，120（4）：e2209964120.

［6］ COSTA M R，DOS SANTOS A Y I，DE MIRANDA T B，et al.Impact of neuroinflammation on epigenetic transcriptional control of Sonic Hedgehog members in the central nervous system［J］.Brain Research，2023，1799：148180.

［7］ ARSALAN Z，ASFARAM A，GHITASI I，et al.Empowerment of balb/C mouse neuron and glial cells in steroidogenesis after activation of the SHH signaling pathway and co-treatment with pregnenolone［J］.Armaghane Danesh，2022，27（3）：321-335.

［8］ CHUNG K M，KIM H，ROQUE C G，et al.A systemic cell stress signal confers neuronal resilience toward oxidative stress in a Hedgehog-dependent manner［J］.Cell Reports，2022，41（3）：111488.

［9］ MOUSAVI S M，AKBARPOUR B，KARIMI-HAGHIGHI S，et al.Therapeutic potential of hair follicle-derived stem cell intranasal transplantation in a rat model of ischemic stroke［J］.BMC Neuroscience，2022，23（1）：47.

［10］ JOSHI B，SINGH D，WASAN H，et al.Tideglusib ameliorates ischemia/reperfusion damage by inhibiting GSK-3β and apoptosis in rat model of ischemic stroke［J］. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases，2022，31（4）：106349.

［11］ LI J X，ZHAO T T，QIAO H Z，et al.Research progress of natural products for the treatment of ischemic stroke［J］.Journal of Integrative Neuroscience，2022，21（1）：14.

［12］ CHEN N，YING X，XIE Q.Inhibition of p-caveolin1 attenuates neurological injury induced by cerebral ischemia-reperfusion in rats［J］.Basic & Clinical Medicine，2022，42（12）：1879.

［13］ 左軍，張金龍，胡曉陽.白術化學成分及現代藥理作用研究進展［J］.遼寧中醫藥大學學報，2021，23（10）：6-9.

［14］ 杜航，何文生，胡紅蘭，等.白術活性成分藥理作用研究進展［J］.江蘇中醫藥，2022，54（5）：76-80.

［15］ 左夢雨，湯同娟，周鵬，等.基于分子對接探討白術內酯Ⅲ通過ROS/GRP78/caspase-12信號通路減輕H9c2細胞凋亡的作用機制［J］.中國中藥雜志，2022，47（16）：4436-4445.

［16］ 陳潔.基于JAK2/STAT3/Drp1通路探討白術內酯Ⅲ減輕神經炎癥改善腦缺血的作用研究［D］.溫州：溫州醫科大學，2020.

［17］ ZHOU H，ZHANG L，CHEN Y，et al.Research progress on the hedgehog signalling pathway in regulating bone formation and homeostasis［J］.Cell Proliferation，2022， 55（1）：e13162.

［18］ 季輝，門欣怡，孫倩，等.Shh信號通路對腦梗死大鼠BCFB的影響及機制研究［J］.腦與神經疾病雜志，2022，30（6）：385-389.

［19］ 賈藍羽，杜元灝.電針“水溝”穴對腦梗死大鼠Shh信號通路蛋白表達的影響［J］.針刺研究，2021，46（11）：914-920.

［20］ 許俊杰，王寶祥，朱東勝，等.SHH信號通路對MCAO模型大鼠腦缺血后的保護機制分析［J］.中國現代醫生，2022，60（10）：4.

（收稿日期：2023-04-10）

（本文編輯 王麗）