草地早熟禾PpMYB2基因的克隆、生物信息學及亞細胞定位分析

收稿日期：2023-12-07；修回日期：2024-04-16

基金項目：雄安新區科技創新專項（2022XAGG0100）與國家自然科學基金（32371764）資助

作者簡介：蘇浩天（1994-），男，滿族，黑龍江牡丹江人，博士研究生，主要從事草坪草分子育種研究，E-mail：suhaotian2023@163.com；*通信作者Author for correspondence E-mail：yinsx369@bjfu.edu.cn

摘要：MYB（MYB transcription factors）是一類在植物生長發育及抗逆方面起重要作用的轉錄因子，其功能包含抗鹽脅迫、抗干旱脅迫、抗重金屬脅迫及抗病害脅迫等，它的基因家族屬于植物最大的轉錄因子家族之一。本研究基于草地早熟禾‘巴潤’（Poa pratensis ‘Baron’）前期轉錄組數據，利用同源克隆及染色體步移技術，獲得了PpMYB2的705 bp的編碼序列（Coding sequence，CDS）及1115 bp的啟動子序列。qRT-PCR結果顯示，PpMYB2在根中具有最高的表達量，其次是葉片在葉鞘中的表達量最低，同時，PpMYB2的表達可以響應植物激素GA及ABA，并在干旱脅迫（15% PEG6000）及高鹽脅迫（150 mmol·L^-1 NaCl）下，呈現出表達量顯著上調的變化趨勢。亞細胞定位結果表明，該基因定位于細胞核中。啟動子分析表明，該基因啟動子區域含有生長素、赤霉素等植物激素響應元件及低溫、干旱等逆境響應元件。由此表明，PpMYB2在植物響應脅迫中起到重要作用，對其的進一步研究對探索草地早熟禾抗逆機理具有指導意義。

關鍵詞：MYB基因；轉錄因子；基因克隆；表達模式；亞細胞定位

中圖分類號：Q943.2 文獻標識碼：A 文章編號：1007-0435（2024）10-3071-09

Cloning，Bioinformatics Analysis and Subcellular Localization of PpMYB2 Gene in Poa pratensis L.

SU Hao-tian， LIU Man， YIN Shu-xia^*

（School of Grassland Science in Beijing Forestry University， Beijing 100093， China）

Abstract：MYB （MYB transcription factor） is a class of transcription factors that plays an important role in plant growth and stress resistance，including salt stress，drought stress，heavy metal stress，and plant disease resistance，its gene family is one of the largest transcription factor families in plants. Based on the transcriptome data of Poa pratensis ‘Baron’，we obtained a 705 bp CDS sequence and a 1115 bp promoter sequence of PpMYB2 by using homologous cloning and chromosome walking techniques. The qRT-PCR results showed that PpMYB2 had the highest expression level in the roots，followed by the leaves and the lowest expression level in the，it also respond to plant hormones such as GA and ABA treatment，and showed a significantly upregulated expression trend under drought stress （15% PEG6000） and salt stress treatments （150 mmol·L^-1 NaCl）. The subcellular localization results indicated that PpMYB2 was located in the nucleus. Promoter analysis showed that the promoter region of PpMYB2 contains plant hormone responsive elements such as auxin and gibberellin，as well as stress responsive elements such as low temperature and drought. These results suggested that PpMYB2 played an important role in plant response to stresses，and further research on it had a guiding significance for exploring its stress resistance mechanism in Poa pratensis.

Key words：MYB gene;Transcription factor;Gene cloning;Expression pattern;Subcellular localization

轉錄因子是植物體內重要的一類DNA結合蛋白，它可以特異性地結合在基因的啟動子區域，從而調控基因的表達^［1］。MYB家族是植物最大的轉錄因子家族之一，其中COLORED1（ZmMYBC1）是第一個被發現的植物MYB轉錄因子，它參與調控玉米花青素的生物合成^［2］。MYB蛋白通常含有數個重復的SANT保守結構域（R），通過R的數量可將MYB蛋白分為四個大類：1R-MYB，R2R3-MYB，3R-MYB，4R-MYB，以及5R-MYB等非典型MYB^［3］，其中R2R3-MYB是MYB家族中數量最多的一類，其對植物激素響應、抗生物與非生物脅迫以及生長代謝調節起到重要作用^［4］。與相對保守的結構域區域相反，MYB蛋白的C端為可調節其蛋白活性的激活域^［5］，序列可變性高，與其基因家族個體行使的不同功能有關^［6］。

研究表明，R2R3-MYB基因家族在植物抗生物與非生物脅迫的過程中起重要作用，在植物遭受脅迫時，會通過鈣離子信s9uhMFqN0DhTbj1mKqYkUm0yBNg3pNglg7c76Q25OC4=號通路等途徑，激活細胞核中MYB轉錄因子的表達，其可以結合在植物抗逆相關基因的啟動子上，調控此類基因的表達^［7］。目前，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）、大豆（Glycine max）、小麥（Triticum aestivum）、水稻（Oryza sativa）等多種植物中都鑒定出了R2R3-MYB基因家族成員^［8］。在擬南芥中，AtMYB2被證實與抗鹽脅迫相關^［9］，AtMYB15還可以通過與CBF轉錄因子（C-repeat binding transcription factors）的互作來影響擬南芥的抗冷脅迫反應^［10］。在水稻中，R2R3-MYB基因OsFLP可以與OsNAC1和OsNAC6互作，從而正向調節水稻的抗旱反應^［11］。在小麥中，R2R3-MYB基因TaODORANT1的過表達會使其抗旱性增強，抗氧化酶活性更強，活性氧（ROS）積累更低^［12］。同時，也有研究表明，MYB轉錄因子也參與了植物抗病的進程，如過表達OsMYB110可以結合肉桂酸和石草酸通路中關鍵基因的啟動子區域，激活其表達，促進阿魏酸的積累，從而增強水稻的抗病性^［13］。

草地早熟禾是應用廣泛的冷季型草坪草，其生長速度快，再生能力強，抗逆性優秀，被稱為“草坪之王”^［14］。隨著全球干旱氣候加劇^［15］，鹽堿土地面積不斷擴大^［16］，草地早熟禾的抗旱和耐鹽性也受到了新的考驗，在分子層面上研究其抗逆機理變得尤為重要，然而關于草地早熟禾R2R3-MYB基因家族成員的數量和特點還未見報道。本研究旨在探究草地早熟禾MYB2基因的生物信息學特征與表達模式，從而對草地早熟禾抗逆機理研究及分子育種提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以草地早熟禾品種巴潤作為材料，其種子購于北京正道種業有限公司，種植于含3∶3∶1的草炭、蛭石、珍珠巖的營養土中，并置于人工氣候箱內晝夜溫度20℃/15℃、光周期12 h、光照度3000 lx、相對濕度60%進行培養，至株高達到10 cm時進行實驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 草地早熟禾PpMYB2基因CDS序列及啟動子序列的克隆 使用草地早熟禾巴潤的前期轉錄組序列以及同源性較高的物種如小麥、大麥（Hordeum vulgare）、結縷草（Zoysia japonica）、多年生黑麥草（Lolium perenne）的基因組序列，通過同源克隆的技術，設計了基因片段引物（表1），經普通PCR擴增、TA克隆及測序獲得基因片段序列后，再通過染色體步移技術（Tail-PCR）^［17］設計三組特異性引物，使用三輪熱不對稱交錯巢式PCR獲得了CDS序列的5′端以及啟動子區域的序列。通過NCBI BLAST（https：//blast.cnbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）及Bioedit 7.2.1^［18］軟件進行多序列比對。

1.2.2 草地早熟禾PpMYB2基因的組織表達及誘導表達模式分析 根據獲得的CDS全長序列，使用Primer Premier 5.0^［19］設計一對qRT-PCR引物（表1）。因草地早熟禾在日常使用中最重要的三個組織部位為葉片、葉鞘和根部，故取成熟植株的葉片、葉鞘和根部組織分別測定PpMYB2相對表達量，并設置三個生物學重復。誘導表達方面設置5個實驗組，對照組（CK）為正常澆灌（30 mL純凈水澆透）、GA處理組正常澆灌并噴施250 mg·L^-1的GA3水溶液^［20］10 mL、ABA處理組正常澆灌并噴施50 μmol·L^-1的ABA水溶液^［21］10 mL、干旱處理組澆灌30 mL 15% PEG6000水溶液^［22］、高鹽處理組澆灌30 mL 150 mmol·L^-1 NaCl水溶液^［23］，每組設置三個生物學重復，因草地早熟禾的坪觀質量主要取決于葉片形態，故分別于處理的0 h，1 h，6 h，12 h，24 h，48 h取葉片樣本并分別測定PpMYB2相對表達量。

1.2.3 RNA提取、反轉錄及qRT-PCR分析 RNA提取試劑盒OMEGA Plant RNA Kit（50），貨號R6927-019，購于美國OMEGA公司；反轉錄試劑盒PrimerScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time），貨號RR047A，qRT-PCR試劑盒TB Green Premix Ex Taq^TM II FAST qPCR，貨號CN830A，均購于TAKARA公司（北京）。在qRT-PCR中每個生物學重復設3個技術重復，使用2^-△△Ct法計算相對表達量，內參基因選用草地早熟禾的PpActin基因^［24］（表1）。

1.2.4 草地早熟禾PpMYB2基因的生物信息學分析 利用在線ExPAsy工具（https：//web.expasy.org/protparam）預測草地早熟禾PpMYB2預測蛋白的理化性質，包括氨基酸數量、分子量、分子式、理論等電點、不穩定性指數、脂肪族指數、親水系數及保守性^［25］；利用在線Predict protein工具（https：//predictprotein.org）對蛋白質的二級結構進行預測^［26］；利用在線SWISS MODEL工具（https：//swissmodel.expasy.org）對蛋白質的三級結構進行預測^［27］；利用在線Interpro工具（https：//www.ebi.ac.uk/interpro）對蛋白質的結構域進行分析^［28］。利用在線YLoc工具（https：//abi-services.cs.uni-tuebingen.de/yloc/webloc.cgi）預測亞細胞定位^［29］；利用在線PlantCARE工具（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare）對啟動子區域進行順式元件的分析^［30］，利用TB tools 2.056對結果進行可視化^［31］。

1.2.5 草地早熟禾PpMYB2基因的系統進化樹分析 利用MEGA 10.0軟件中的Neighborhood Join法^［32］，分析擬南芥、丹參（Salvia miltiorrhiza）、苦蕎麥（Fagopyrum tataricum）、大豆、玉米（Zea mays）、羊草（Leymus chinensis）、水稻、小麥、節節麥（Aegilops tauschii）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）、草地早熟禾的MYB基因家族，并使用氨基酸序列繪制系統進化樹，利用在線iTOL工具（https：//itol.embl.de）對進化樹進行美化^［33］。

1.2.6 亞細胞共定位分析 采用同源重組法，將PpMYB2基因連接于pBWA（V）HS亞細胞定位載體的GFP熒光蛋白序列之前，構建重組載體PpMYB2-GFP-pBWA（V）HS，再準備含細胞核Marker nls蛋白（氨基酸序列為MDPKKKRKV）與mkata熒光蛋白的重組載體nls-mkata-pBWA（V）HS，并將二者使用凍融法轉化至農桿菌GV3101中，在28℃的搖床內以180 r·min^-1的轉速避光培養至OD600=0.6，再采用表皮注射法將兩種農桿菌菌液同時注射至本生煙草葉片背部^［34］，于人工氣候箱內20℃暗培養48 h后置于共聚焦顯微鏡下觀測熒光，其中GFP熒光蛋白的激發光波長為400 nm，mkate熒光蛋白的激發光波長為561 nm。

1.2.7 數據分析 采用SPSS 23.0（SPSS Inc.，USA）進行數據分析^［35］，用平均值和標準誤差表示測定結果，統計學分析采用t檢驗方法，采用GraphPad Prism 9進行數據可視化^［36］。

2 結果與分析

2.1 PpMYB2的CDS序列及編碼蛋白的理化性質分析

使用同源克隆及染色體步移技術，設計全長引物PpMYB-CDS-F/R，經PCR獲得約700 bp的CDS序列，測序結果顯示其長度為705 bp，共編碼234個氨基酸（圖1A-1B）。

如表2所示，PpMYB2編碼蛋白的分子量為27 005.46；分子式為C1184H1841 N345O357S12；等電點為5.60，屬于酸性蛋白質，在中性環境中帶負電荷；不穩定性系數為62.17，屬于不穩定蛋白；脂肪族系數為74.66；親水性系數為-0.64，屬于親水性蛋白質。

2.2 PpMYB2的系統進化樹分析及保守性分析

通過系統進化樹分析得知，PpMYB2屬于典型的R2R3-MYB類群，其與水稻、小麥、節節麥、二穗短柄草等禾本科植物的MYB基因進化親緣關系較近，與擬南芥、玉米、丹參等植物的親緣關系較遠（圖2）。保守性分析結果顯示，PpMYB2的氨基酸序列在5′端趨于保守，而在3′端趨于多變（圖3B）。

2.3 PpMYB2編碼蛋白的結構域（Motif）分析

通過結構域分析可以得知，PpMYB2基因含有兩個MYB基因家族保守的SANT結構域（R）（圖3A），故其為典型的R2R3-MYB基因，這些結構域在MYB基因作為轉錄因子執行功能時，具有結合目的基因啟動子區域靶標DNA的功能。

2.4 PpMYB2編碼蛋白的二級、三級結構預測及亞細胞定位

通過二級結構分析可以得知，PpMYB2蛋白的主要結構為無規則卷曲，占整體的77.77%，其次為α-螺旋，占整體的20.51%，最少的是β-螺旋，占整體的1.28%。其中α-螺旋和β-螺旋集中在R2-R3結構域中（圖4A）；通過三級結構分析可以得知，PpMYB2蛋白含有兩個連續的SANT結構域（R），并且這兩個結構域之間存在180°的折疊，這個空間構象決定了它可以利用這個折疊的結構域區域結合靶標基因的啟動子區域，行使其作為轉錄因子的功能（圖4B）。

通過煙草瞬時表達分析可以得知，PpMYB2與細胞核Marker共同定位于細胞核內（圖4C）。

2.5 PpMYB2的啟動子序列順式元件分析

通過染色體步移技術^［17］lVaNQhnvvaSerg//E0EGugWWcsXOYDoRRDiBqflEUEg=，利用已知序列片段設計引物，擴增獲得1115 bp的啟動子序列。通過啟動子區域順式作用元件分析可以得知，PpMYB2的啟動子區域除含有TATA-box等植物通用元件、MYB特征元件、MYB及MYC結合位點之外，還含有生長素（AUX）、赤霉素（GA）、脫落酸（ABA）、茉莉酸甲酯（MeJA）等植物激素的響應元件，以及誘導光反應、低溫反應、干旱反應、冷脅迫反應、厭氧反應的響應元件（圖5），這些順式作用元件可以在植物激素誘導反應及抗逆反應中起到重要作用。

2.6 PpMYB2的空間表達分析及誘導表達分析

如圖6所示，qRT-PCR分析表明，在草地早熟禾的不同組織中，根部的PpMYB2相對表達量最高，為葉片的4.923倍；而葉鞘的PpMYB2相對表達量最低，為葉片的0.253倍（圖6E）。在未經處理時，對照組的PpMYB2表達量沒有顯著變化；經GA處理后，PpMYB2的表達呈先下降后上升的趨勢，其表達量從1 h開始顯著上升（P<0.05），在24 h表達量最低，為0 h的0.54倍，在48 h表達量顯著上升（P<0.05），為0 h的0.80倍（圖6A）；ABA處理后，PpMYB2的表達呈先下降后上升的趨勢，與GA處理相似，其表達量從1 h開始顯著下調（P<0.05），在12 h表達量最低，為0 h的0.41倍，在24 h表達量顯著上升（P<0.05），為0 h的0.70倍，在48 h表達量上升為0 h的1.03倍（圖6B）；NaCl處理后，PpMYB2的表達呈先上升后下降的趨勢。其表達量從6 h開始顯著上升（P<0.05），為0 h的2.40倍，在12 h表達量相較6 h顯著下降（P<0.05），為6 h的0.39倍（圖6C）；PEG6000處理后，PpMYB2的表達呈一直上升的趨勢。其表達量從1 h開始顯著上升（P<0.05），為0 h的2.43倍，在48 h表達量再次顯著上升（P<0.05），為0 h的4.81倍（圖6D）。

可以得知，在GA處理和ABA處理后，PpMYB2的表達量均為先下降后回升，說明該基因對植物激素GA和ABA存在響應，并呈現出相似的表達模式（圖6A-6B）；在NaCl和PEG6000處理后，PpMYB2表達量均有上升，說明該基因受到鹽脅迫和干旱脅迫的誘導，但二者表達模式存在差異（圖6C-6D）。

3 討論

MYB轉錄因子家族是植物最大基因家族之一，這些MYBs可分為數個亞族，其中最大的兩個亞族為R1-MYB和R2R3-MYB^［37］。多項研究表明，R2R3-MYB在植物抗逆境脅迫中起重要作用^［38］，研究R2R3-MYB在植物抗逆進程中發揮的作用與機理，是近些年研究的熱點之一，而隨著研究的不斷深入，對于R2R3-MYB的研究也從雙子葉植物向單子葉植物比如禾本科植物中拓展^［39］。

本研究中，我們鑒定了一個草地早熟禾巴潤的R2R3-MYB轉錄因子PpMYB2，其與其他單子葉植物如小麥、水稻等的MYB基因親緣關系較近，與擬南芥等雙子葉植物親緣關系較遠。預測蛋白二級與三級結構分析及結構域分析表明，該蛋白的α-螺旋及β-折疊集中于其兩個重復SANT結構域區域，這與在大豆MYB124中研究的結果類似^［40］，此空間構象可能與其結構域行使功能相關。亞細胞定位結果顯示其定位于細胞核內，符合其作為轉錄因子的特征，但在其他物種如瓠瓜中MYB基因卻可能定位于其他部位，比如細胞質膜或細胞外^［41］。

保守性分析顯示，PpMYB2在5′端重復SANT結構域的區域趨于保守，而在3′端的可變區趨于多變，這與MYB基因在不同器官、組織或物種中的功能多樣化相關^［42］，比如在擬南芥中AtMYB44可以調控氣孔的關閉，使擬南芥響應各種逆境脅迫^［43］，AtMYB33可以促進擬南芥的生殖發育^［44］，同時有研究表明，在瓠瓜（Lagenaria siceraria）中MYB基因可以響應白粉菌的侵染^［40］，揭示了其在植物抗病方面可能也起到重要作用。

誘導表達分析和啟動子序列分析表明，PpMYB2具有響應多種植物激素及逆境脅迫的能力，如生長素、赤霉素、脫落酸、茉莉酸甲酯及干旱脅迫、高鹽脅迫、冷脅迫等。在非洲菊（Gerbera jamesonii）中，GhMYB4與GhMYB5在GA3處理后表達量下調，這與本研究中的結論相似，而GhMYB1與GhMYB3在GA3處理后表達量上調^［45］；在葡萄（Vitis vinifera）中，VvMYB95在ABA處理后表達量下調，這與本研究中的結論相似，而另外8個VvMYB基因在ABA處理后表達量上調^［46］，這些說明了MYB基因家族在植物激素響應模式上存在差異性。在棗樹（Ziziphus jujuba）中，9個ZjMYB基因受到鹽處理后表達量上調^［47］，在藍莓（Vaccinium）中，4個VcMYB基因在受到干旱處理后表達量上調^［48］，這些與本研究中的結論相似，但這些基因上調表達的起始時間存在很大差異^［47-48］，說明了MYB基因家族在脅迫響應方面存在時間差異性，這些差異可能與其行使不同功能相關。

同時，在蘋果樹（Malus pumila）中，MYB88可以在干旱條件下參與脫落酸的合成^［49］；在水稻中，MYB102可以抑制脫落酸的合成^［50］；在粳稻（Oryza sativa subsp. japonica）中，MYB1可以在低磷脅迫下參與赤霉素的合成^［51］，由此推測MYB基因家族參與植物抗逆的機理可能與調控植物激素的水平相關。除影響植物的抗逆外，MYB還可以調控一些萜類物質的生物合成，如丹參酮、紫杉醇、青蒿素、類胡蘿卜素、羅勒烯、蟲菊素等^［8］，展示了其在功能上的多樣性。

由此可見，對草地早熟禾MYB基因家族的研究，在研究植物抗逆機理以及分子育種的領域具有重要意義，PpMYB2可以作為一個重要的分子指標或分子育種的候選基因，在后續的研究中用以提高草地早熟禾的抗逆性。

4 結論

本研究鑒定了草地早熟禾的一個R2R3-MYB基因PpMYB2的705 bp的CDS序列及1115 bp的啟動子序列。PpMYB2在不同的組織中存在表達量的差異，在根中最高，在葉鞘中最低，其表達對植物激素GA及ABA具有響應，且在兩種激素誘導下的表達模式相似，均為在48 h內先下降后上升。該基因也可被干旱脅迫和鹽脅迫誘導，但在兩種脅迫下表達模式不一致。亞細胞定位結果表明，該基因定位于細胞核中，符合其作為轉錄因子的特性。順式元件分析表明，PpMYB2的啟動子區域含有多種植物激素反應元件及植物逆境反應元件。這些結論揭示了研究MYB基因家族對研究草地早熟禾抗逆機理所具備的潛力。

參考文獻

［1］KHAN S A，LI M Z，WAN S M，et al. Revisiting the role of plant transcription factors in the battle against abiotic stress［J］. International Journal of Molecular Sciences，2018，19（6）：1634

［2］PAZ-ARES J，GHOSAL D，WIENAND U，et al. The regulatory c1 locus of Zea mays encodes a protein with homology to myb proto-oncogene products and with structural similarities totranscriptional activators［J］. EMBO，1987，6（12）：3553-3558

［3］許文杰，黃遠浩，韓蓉蓉，等.基于全基因組的梔子苷生物合成相關MYB轉錄因子系統分析［J］.藥學學報，2023，58（8）：2522-2531

［4］DUBOS C，STRACKE R，GROTEWOLD E，et al. MYB transcription factors in Arabidopsis［J］. Trends in Plant Science，2010，15（10）：573-581

［5］RAMYA M，KWON O K，AN H R，et al. Floral scent：regulation and role of MYB transcription factors［J］. Phytochemistry Letters，2017（19）：114-120

［6］CAO Y，LI K，LI Y，et al. MYB transcription factors as regulators of secondary metabolism in plants［J］. Biology，2020，9（3）：61

［7］王浩田，蔣景龍，王倩，等.R2R3-MYB轉錄因子響應植物抗逆機制研究進展［J/OL］. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20230810.1507.012.html，2023-08-10/2024-2-1

［8］藍卡爾，劉宇陽，吳詩怡，等.MYB轉錄因子調控植物萜類生物合成的研究進展［J］.植物生理學報，2023，59（9）：1709-1719

［9］YANG A，DAI X Y，ZHANG W H. A R2R3-type MYB gene，OsMYB2，is involved in salt，cold，and dehydration tolerance in rice［J］. Journal of Experimental Botany，2012，63（7）：2541-2556

［10］LI M，LIN L，ZHANG Y，et al. ZmMYB31，a R2R3-MYB transcription factor in maize，positively regulates the expression of CBF genes and enhances resistance to chilling and oxidative stress［J］. Molecular Biology Reports，2019，46（4）：3937-3944

［11］QU H H，ZOU J J，WANG J X，et al. A Rice R2R3-Type MYB transcription factor OsFLP positively regulates drought stress response via OsNAC［J］. International Journal of Molecular Sciences，2022，23（11）：5873

［12］WEI Q H，LUO Q C，WANG R B，et al. A Wheat R2R3-type MYB transcription factor TaODORANT1 positively regulates drought and salt stress responses in transgenic tobacco plants［J］. Frontiers in Plant Science，2017（8）：1374

［13］WANG T T，JIN Y，DENG L X，et al. The transcription factor MYB110 regulates plant height，lodging resistance，and grain yield in rice［J］. The Plant Cell，2024，36（2）：298-323

［14］甘露.草地早熟禾矮化突變體的遺傳差異分析及DXS1基因功能研究［D］.北京：北京林業大學，2019：3-4

［15］王君玲，劉穎.草地早熟禾對干旱脅迫的響應研究進展［J］.青海畜牧獸醫雜志，2022，52（5）：62-65

［16］劉燕，楊偉，馬暉玲，等.鹽脅迫對6種草地早熟禾幼苗生理特性的影響［J］.甘肅農業大學學報，2019，54（5）：140-150，162

［17］康丹，方小艷，游騰飛，等.染色體步移技術克隆已知序列側翼啟動子的研究進展［J］.農業生物技術學報，2013，21（3）：355-366

［18］ALZOHAIRY M A. BioEdit：An important software for molecular biology［J］. GERF Bulletin of Biosciences，2011，2（1）：60

［19］翟中會，陳希南，王娟.利用Primer Premier 5.0進行引物設計［J］.西北醫學教育，2008（4）：695-698

［20］李金梅，張偉，趙威軍，等.噴施赤霉素對甜高粱控蘗效果的影響［J］.中國農學通報，2019，35（22）：10-13

［21］周立國，劉灶長，孔德艷，等.水稻OsAHL1基因的啟動子及包含其的重組載體，轉化體以及其應用：中國，CN201510271470.6［P］. 2015-05-25

［22］朱瑞婷，牛奎舉，張然，等.草地早熟禾NAC基因鑒定及非生物脅迫下表達模式分析［J］.草原與草坪，2021，41（4）：26-35

［23］王英，馮家敏，潘金禧，等.鹽脅迫下不同抗性水稻三葉期根系生長特性分析［J/OL］. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/32.1214.S.20240320.0833.010.html，2024-03-21/2024-04-15

［24］張蘭，檀鵬輝，滕珂，等.草地早熟禾熒光定量PCR分析中內參基因的篩選［J］.草業學報，2017，26（3）：75-81

［25］張曉洋，何思，瞿宏悅，等.苧麻CCCH基因家族生物信息學及表達譜分析［J］.草地學報，2024，32（3）：703-713

［26］馬相如，肖冬.基于predictprotein平臺的蛋白質結構預測［J］.計算機光盤軟件與應用，2013，16（14）：41-42

［27］TYPHAINE P，MATTHIAS B，SARA C，et al. InterPro in 2022［J］. Nucleic Acids Research，2022，51（D1）：D418-D427

［28］諶容，陳敏，楊春賢，等.基于SWISS-MODEL的蛋白質三維結構建模［J］.生命的化學，2006（1）：54-56

［29］SEBASTIAN B，JORG R，OLIVER K. YLoc--an interpretable web server for predicting subcellular localization［J］. Nucleic Acids Research，2010（38）：497-502

［30］宋志鋼，劉穎，劉瑞，等.海雀稗PvCIPK9基因克隆及耐鹽功能鑒定［J］.草地學報，2023，31（10）：2938-2948

［31］CHEN C，CHEN H，ZHANG Y，et al. TBtools：An integrative toolkit developed for interactive analyses of big biological data［J］. Molecular Plant，2020，13（8）：1194-1202

［32］劉雪梅，李文，黃管大，等.相異度算法結合鄰接法構建系統進化樹的評估［J］.華南理工大學學報（自然科學版），2019，47（6）：136-141，148

［33］IVICA L，PEER B. Interactive tree of life （iTOL） v3：an online tool for the display and annotation of phylogenetic and other trees［J］. Nucleic Acids Research，2016，44（1）：242-245

［34］ZHAO F，ZHAO T，DENG L，et al. Visualizing the essential role of complete virion assembly machinery in efficient hepatitis C Virus cell-to-cell transmission by a viral infection-activated split-intein-mediated reporter system［J］. Journal of Virology，2017，91（2）：1720

［35］OKELLO O G. Statistical methods using SPSS［M］. Florida：CRC Press，2024：10

［36］MITTEER D R，GREER B D，et al. Using GraphPad Prism’s heat maps for efficient，fine-grained analyses of single-case data［J］. Behavior Analysis in Practice，2022，15（2）：1-10

［37］YAO L，YANG B，XIAN B，et al. The R2R3-MYB transcription factor BnaMYB111L from rapeseed modulates reactive oxygen species accumulation and hypersensitive-like cell death［J］. Plant Physiology and Biochemistry，2020（147）：280-288

［38］CAI C，ZHOU F，LI W，et al. The R2R3-MYB transcription factor GaPC controls petal coloration in cotton［J］. The Crop Journal，2023，11（5）：1319-1330

［39］WU R，DING Y Q，LI C Y，et al. An R2R3-type transcription factor OsMYBAS1 regulates seed germination under artificial accelerated aging in transgenic rice （Oryza sativa L.）［J］. Agronomy，2022，12（8）：1955

［40］呂陸佳，隋超，王德穎，等.大豆MYB124基因克隆及表達模式分析［J/OL］. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20230913.2304.008.html，2023-09-15/2024-04-05

［41］田守波，吳玨，胡家陽，等.瓠瓜MYB家族成員鑒定及響應白粉病菌的表達分析［J］.分子植物育種，2023，21（21）：6982-6997

［42］LV J H，XU Y，DAN X M，et al. Genomic survey of MYB gene family in six pearl millet （Pennisetum glaucum） varieties and their response to abiotic stresses［J］. Genetica，2023，151（3）：251-265

［43］JOO J，OH N，NGUYEN H N，et al. Intergenic transformation of AtMYB44 confers drought stress tolerance in rice seedlings［J］. Applied Biological Chemistry，2017，60（4）：447-455

［44］XUE T，LIU Z，DAI X，et al. Primary root growth in Arabidopsis thaliana is inhibited by the miR159 mediated repression of MYB33，MYB65 and MYB101［J］. Plant Science，2017（262）：182-189

［45］鐘心珂.赤霉素和MYB調控非洲菊花瓣類胡蘿卜素代謝機制的研究［D］.廣州：華南農業大學，2019：24-25

［46］夏爽，鄧喬允，王秀芹.葡萄MYB轉錄因子家族分析及對糖和ABA信號的響應［J/OL］. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20240325.1214.002.html，2024-03-26/2024-4-11

［47］王軍曉，李婷，馬志博，等.棗樹MYB基因家族鑒定、果實表達和鹽脅迫響應研究［J］.西北林學院學報，2022，37（2）：20-28，36

［48］王愛斌.藍莓響應干旱MYB基因篩選及調控機制研究［D］.北京：北京林業大學，2022：68-69

［49］XIE Y P，BAO C N，CHEN P X，et al. Abscisic acid homeostasis is mediated by feedback regulation of MdMYB88 and MdMYB124［J］. Journal of Experimental Botany，2021，72（2）：592-607

［50］PIAO W L，KIM S H，LEE B D，et al. Rice transcription factor OsMYB102 delays leaf senescence by down-regulating abscisic acid accumulation and signaling［J］. Journal of Experimental Botany，2019，70（10）：2699-2715

［51］GU M，ZHANG J，LI H H，et al. Maintenance of phosphate homeostasis and root development are coordinately regulated by MYB1，an R2R3-type MYB transcription factor in rice［J］. Journal of Experimental Botany，2017，68（13）：3603-3615

（責任編輯 劉婷婷）