黃梁木葉精油對(duì)柱花草和水稻秸稈發(fā)酵品質(zhì)及細(xì)菌群落的影響

收稿日期：2024-05-28；修回日期：2024-07-03

基金項(xiàng)目：廣東長隆慈善基金會(huì)（CLPF2021007Z）;國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31771345）；廣東省林業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目（2019KJCX001）資助

作者簡介：周雨歆（2000-），女，漢族，江西南昌人，碩士研究生，主要從事牧草青貯加工研究，E-mail：Deodatus@163.com;*通信作者Author for correspondence，E-mail：zqing1988@126.com

摘要：為探究黃梁木（Neolamarckia cadamba）葉精油分別對(duì)柱花草（Stylosanthes guianensis L.）和水稻（Oryza sativa L.）秸稈青貯發(fā)酵品質(zhì)和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，本試驗(yàn)基于新鮮柱花草和水稻秸稈重量的0.5%和1%添加黃梁木葉精油（NCEO）進(jìn)行青貯混合處理，每個(gè)處理3組重復(fù)，裝入聚乙烯密封袋并用真空封口機(jī)密封，青貯30 d后測定樣品的青貯發(fā)酵品質(zhì)指標(biāo)，分析細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明：添加黃梁木葉精油顯著降低了柱花草和水稻秸稈青貯飼料中pH值、氨態(tài)氮含量、乳酸菌和大腸菌群數(shù)量（P＜0.05），顯著提高了水稻秸稈青貯飼料的乳酸和真蛋白含量（P＜0.05）。乳酸菌在水稻秸稈青貯飼料中占優(yōu)勢地位，且數(shù)量隨黃梁木葉精油添加量的增加而升高。黃梁木葉精油的添加也增加了異根瘤菌屬、甲基桿菌屬和黃單胞桿菌屬的相對(duì)豐度。綜上所述，添加1%黃梁木葉精油可有效改善柱花草和水稻秸稈青貯發(fā)酵品質(zhì)。

關(guān)鍵詞：黃梁木葉精油；青貯品質(zhì)；細(xì)菌群落；柱花草；水稻秸稈

中圖分類號(hào)S816.5+3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-0435（2024）10-3326-09

Effect of Neolamarckia cadamba Leaf Essential Oil on Fermentation Quality and Bacterial Community of Stylo and Rice Straw Silage

ZHOU Yu-xin， YANG Dan， YANG Wei-tao， CHEN Dan-dan， CHEN Xiao-yang， ZHANG Qing^*

（College of Forestry and Landscape Architecture， South China Agricultural University， Guangzhou， Guangdong Province 510642， China）

Abstract：The objective of this experiment was to explore the effect of Neolamarkia cadamba leaf essential oil （NCEO） on the fermentation quality and bacterial community of stylo （Stylosanthes guianensis L.）and rice（Oryza sativa L.）straw silage. Based on the weight of fresh stylo and rice straw，adding the 0.5% and 1% NCEO into materials for 30 days ensiling. Vacuumed and sealed after three replicates of each treatment were packed into plastic bags （20 cm×30 cm）. After 30 days of ensiling，the chemical composition and silage indexes of the samples were evaluated statistically. The results of fermentation parameter，protein fraction and bacterial community indicated that NCEO addition decreased （P<0.05） pH value，ammonia-N content，and numbers of lactic acid bacteria and coliform bacteria both in stylo and rice straw silage. And lactic acid content and true protein proportion of rice straw silage increased （P<0.05） with NCEO addition. Lactobacillus was the most dominant genus and increased with NCEO addition in rice straw silage. The NCEO addition also increased the relative abundance of Allorhizobium，Methylobacterium and Xanthomonas. In conclusion，the 1% NCEO addition was an effective way to improve the fermentation of stylo and rice straw silage.

Key words：Neolamarckia cadamba leaf essential oil；Fermentation quality；Bacterial community；Stylo；Rice straw

柱花草（Stylosanthes guianensis L.）是一種重要的豆科灌木，其年產(chǎn)量高且營養(yǎng)價(jià)值豐富，廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區(qū)^［1］，蛋白含量高，適口性好^［2］，常被用作牛、山羊和綿羊的飼料^［3］。在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中，水稻（Oryza sativa L.）秸稈屬于一種農(nóng)業(yè)廢棄物，一般情況下，這些秸稈廢棄物多在田間直接焚燒處理，導(dǎo)致甲烷和二氧化氮等溫室氣體大量排放^［4］。同時(shí)，水稻秸稈結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難以利用化學(xué)和生物方法對(duì)其進(jìn)行降解^［5］。青貯是將收獲的牧草長期有效貯存的一種常用手段，操作簡便、成本低廉且營養(yǎng)損失較少^［6］，但由于青貯過程中常存在發(fā)酵底物不足、不良微生物數(shù)量過多等不利情況，通常難以獲得優(yōu)質(zhì)青貯飼料^［7］。研究表明，因水溶性碳水化合物含量低且緩沖能值高，柱花草材料難以青貯成功^［8］，水稻秸稈青貯過程中也存在相似問題^［9］。飼料青貯過程中的pH值常無法迅速降低，同時(shí)梭狀芽孢桿菌和腸桿菌等不良微生物的存在使青貯過程中丁酸大量產(chǎn)生，蛋白質(zhì)被部分水解，導(dǎo)致青貯結(jié)果較差。為有效改善柱花草與水稻秸稈的青貯品質(zhì)，提高其營養(yǎng)價(jià)值，在青貯過程加入飼料添加劑，可減少青貯的不利因素，提高青貯質(zhì)量^［10］。

精油是植物中揮發(fā)性和疏水性物質(zhì)的混合物，具有良好的抗菌作用和較高的抗氧化生物活性^［11］，廣泛應(yīng)用于制藥和化妝品行業(yè)，也可應(yīng)用于畜牧業(yè)^［12］。黃梁木（Neolamarckia cadamba）是一種生長速度快的半落葉樹木，樹葉高產(chǎn)，具有高營養(yǎng)價(jià)值和高抗菌能力，可作為合適的飼料資源^［13］。研究發(fā)現(xiàn)，在柱花草青貯中添加黃梁木葉，可以通過降低pH值、氨態(tài)氮含量，提高乳桿nyYbqErdHzhoqvLqGbM2LA==菌豐度以改善青貯發(fā)酵品質(zhì)^［14］。因植物精油有抑菌消炎與防止飼料霉變等作用，其常被應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)中，然而，鮮有學(xué)者研究關(guān)注添加黃梁木葉精油對(duì)青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響。

因此，該試驗(yàn)假設(shè)黃梁木葉精油可以通過改變細(xì)菌多樣性來改善青貯品質(zhì)，分別添加0.5%和1%濃度的黃梁木葉精油對(duì)新鮮柱花草和水稻秸稈進(jìn)行青貯，在發(fā)酵30 d后分析檢測發(fā)酵特性，蛋白組分和細(xì)菌群落。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

柱花草，水稻秸稈和黃梁木葉均采集于中國廣東省廣州市華南農(nóng)業(yè)大學(xué)啟林北試驗(yàn)田（23 °19 ′N，113 °34 ′E）。柱花草全株未施用除草劑和化肥，經(jīng)栽培兩年后在現(xiàn)蕾期收獲，水稻秸稈在穗期后收獲，留茬5 cm人工收割。用鍘刀將試驗(yàn)材料切割成2 cm左右的小段，將2種材料分別混合均勻后各取3份進(jìn)行化學(xué)組分和微生物群落分析。以1∶2的料液比將新鮮黃梁木葉和純水充分混合，蒸餾3 h后得到黃梁木葉精油，精油提取率為0.3%（W/V），4℃保存?zhèn)溆?。本試?yàn)基于新鮮柱花草和水稻秸稈重量的0.5%和1%添加黃梁木葉精油進(jìn)行青貯混合處理，并以不添加精油作為對(duì)照組。處理后將混勻的青貯材料分別裝入聚乙烯塑料包裝袋（20 cm×30 cm）中，用真空封口機(jī)（廣東省東莞市益健機(jī)械包裝有限公司）進(jìn)行真空密封。將18個(gè)青貯袋（2種材料×3個(gè)處理×3個(gè)重復(fù)）放置在室溫（25℃～30℃）的房間中儲(chǔ)存，青貯30 d后取樣分析發(fā)酵參數(shù)和化學(xué)成分。

1.2 微生物及化學(xué)指標(biāo)的測定

各取3份柱花草和水稻秸稈青貯樣品，進(jìn)行發(fā)酵參數(shù)分析^［7］，分別取20 g青貯樣品，加入180 mL生理鹽水，置于恒溫?fù)u床中（37℃，180 r·min^-1）混合均勻，逐級(jí)稀釋上清液，從10^-1稀釋到10^-6。將稀釋液接種到MRS瓊脂培養(yǎng)基、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基和孟加拉紅定性培養(yǎng)基中，用平板計(jì)數(shù)法測定乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）、酵母菌、霉菌及大腸菌群的數(shù)量。

另取20 g青貯樣品加入180 mL純水，置于4℃冰箱中放置24 h后，用定性濾紙過濾，測定pH、有機(jī)酸和氨態(tài)氮（Ammonium nitrogen，NH-N）。pH值用pH計(jì)（雷磁PHS-3C型pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司）測定，氨態(tài)氮用苯酚-次氯酸鈉比色法測定^［15］。使用高效液相色譜（KC-811column，Shodex，Shimadzu，日本；柱溫50℃；流速1 mL·min^-1；波長210 nm；SPD-M10AVP檢測器；高氯酸流動(dòng)相3 mmol·L^-1，進(jìn)樣量5 μL）對(duì)包括乳酸、乙酸、丙酸和丁酸在內(nèi)的有機(jī)酸含量進(jìn)行測定^［16］。

剩余各處理的60 g青貯樣品經(jīng)烘箱烘干后計(jì)算干物質(zhì)（Dry matter，DM）的量，磨碎后分析其化學(xué)成分。蛋白質(zhì)組分包括粗蛋白（Crude protein，CP）和真蛋白（True protein，TP），使用凱氏定氮儀（FOSS全自動(dòng)凱氏定氮儀KJELTEC 2300，瑞典）進(jìn)行檢測^［17］。使用15%（W/V）的三氯乙酸對(duì)烘干后的青貯樣品處理1 h，烘干后對(duì)真蛋白含量進(jìn)行分析。非蛋白氮含量為粗蛋白與真蛋白的差值。依照范式纖維素測定法^［18］對(duì)中性洗滌纖維（Neutral detergent fiber，NDF）和酸性洗滌纖維（Acid detergent fiber，ADF）進(jìn)行纖維組分分析。使用蒽酮比色法^［19］測定水溶性碳水化合物（Water-soluble carbohydrates，WSC）含量。

1.3 Illumina Hiseq2500測序和細(xì)菌多樣性分析：

青貯柱花草和水稻秸稈樣品中的細(xì)菌DNA通過HiPure Soil DNA提取試劑盒（廣州美基生物科技有限公司，廣州）提取得到，并使用1%瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)檢測DNA質(zhì)量。后對(duì)16 s rDNA的V3-V4區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列為341F：CCTACGGGNGGCWGCAG;806R：GGACTACHVGGGTATCTAAT，在50 μL的體系中進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（5 μL 10×KOD緩沖液，1.5 μL引物（5 μmol·L^-1），1 μL KOD聚合酶，5 μL 2.5 mmol·L^-1脫氧核苷三磷酸（dNTP）和100 ng模板DNA）。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性2 min，98℃變性10 s，62℃退火30 s，68℃延伸30 s，27個(gè)循環(huán)，68℃延伸10 min，10℃保存產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化和定量后，在Illumina HiSEq 2500測序系統(tǒng)進(jìn)行測序。在生物信息學(xué)分析之前進(jìn)行質(zhì)量控制和聚類，包括reads過濾、reads組裝、原始數(shù)據(jù)過濾、聚類及嵌合體去除，最后使用R語言ggplot2包（2.2.1版本）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化。使用R語言pheatmap包繪制物種豐度熱圖。各組間的ɑ指數(shù)比較采用Tukey事后檢驗(yàn)和R語言Vegan包（2.5.3版本）的Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。包括PcoA（主坐標(biāo)分析）在內(nèi)的多變量統(tǒng)計(jì)技術(shù)在R語言Vegan包（2.5.3版本）中生成。各組間的功能差異分析采用R語言Vegan包（2.5.3版本）的Welch’s-test檢驗(yàn)、Wilcoxon秩和檢驗(yàn)、Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)、Tukey事后檢驗(yàn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

利用IBM SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析黃梁木葉精油對(duì)柱花草和水稻秸稈青貯發(fā)酵的影響，進(jìn)行單因素分析（One-way ANOVA），采用Tukey法進(jìn)行多重比較，P＜0.05表示有顯著差異。生物信息學(xué)分析使用實(shí)時(shí)交互式在線數(shù)據(jù)平臺(tái)Omicsmart（http：//www.omicsmart）進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 青貯原料的特點(diǎn)

柱花草和水稻秸稈的青貯前特性如表1所示，柱花草和水稻秸稈的干物質(zhì)含量分別為363 g·kg^-1和279 g·kg^-1，粗蛋白含量分別為99.0 g·kg^-1和72.6 g·kg^-1，真蛋白含量分別為774 g·kg^-1和619 g·kg^-1。柱花草和水稻秸稈的纖維含量較高，中性洗滌纖維分別為701 g·kg^-1和611 g·kg^-1，酸性洗滌纖維分別為473 g·kg^-1和308 g·kg^-1；可溶性糖含量較低，分別為18.1 g·kg^-1和21.6 g·kg^-1。青貯原料表面附著的微生物數(shù)量豐富，柱花草和水稻秸稈表面的酵母菌數(shù)量為5.06 lg cfu·g^-1和4.33 lg cfu·g^-1，霉菌數(shù)量為4.46 lg cfu·g^-1和3.56 lg cfu·g^-1，大腸桿菌數(shù)量為7.59 lg cfu·g^-1和6.40 lg cfu·g^-1。

2.2 柱花草和水稻秸稈的青貯發(fā)酵品質(zhì)，微生物群落數(shù)量和蛋白質(zhì)含量

柱花草和水稻秸稈的青貯發(fā)酵品質(zhì)，微生物群落數(shù)量和蛋白質(zhì)含量見表2和表3。在添加黃梁木葉精油后，青貯柱花草與水稻秸稈的pH值，柱花草的乙酸含量，水稻秸稈的丁酸含量均顯著降低（P＜0.05），而兩種青貯牧草的乳酸含量和水稻秸稈的乙酸含量均顯著增加（P＜0.05）。同時(shí)，在添加黃梁木葉精油后青貯飼料中乳酸菌和大腸桿菌數(shù)量顯著降低（P＜0.05），酵母和霉菌的數(shù)量也均低于檢測水平。黃梁木葉精油的添加使青貯柱花草的真蛋白含量（P＜0.05）顯著增加，非蛋白氮含量顯著降低（P＜0.05），青貯柱花草和水稻秸稈的氨態(tài)氮含量均顯著降低（P＜0.05）。

2.3 柱花草和水稻秸稈青貯的細(xì)菌多樣性

在本試驗(yàn)中，青貯柱花草和水稻秸稈的細(xì)菌群落ɑ多樣性見表4。在柱花草和水稻秸稈青貯處理中，良好覆蓋值均達(dá)到0.99以上，添加黃梁木葉精油能使Sobs，Chao1，Ace，Shannon和Simpson指數(shù)均提高，使柱花草和水稻秸稈青貯的OTUs，豐富度和多樣性均提高。

2.4 柱花草和水稻秸稈青貯的細(xì)菌豐度

青貯柱花草和水稻秸稈在門水平上的細(xì)菌群落相對(duì)豐度如圖2（a）所示，在屬水平上的細(xì)菌群落相對(duì)豐度如圖2（b）所示。添加黃梁木葉精油使厚壁菌門（69.1%到53.3%）、變形菌門（25.6%到6.46%）數(shù)量減少，而使藍(lán)藻門（1.91%到22.9%）和放線菌門（1.73%到7.93%）數(shù)量增加。在柱花草青貯處理中，黃梁木葉精油使乳酸菌減少（16.9%到4.05%），異根瘤菌增加（1.11%到7.02%），甲基桿菌增加（1.54%到7.74%）。在水稻秸稈青貯處理中，乳桿菌、黃單胞桿菌、乳球菌和明串球菌占主導(dǎo)地位，這些屬的豐度也因添加黃梁木葉精油的處理而發(fā)生變化。水稻秸稈青貯細(xì)菌群落熱圖如圖3所示，添加黃梁木葉精油降低了梭狀芽孢桿菌的豐度，16S rRNA基因預(yù)測的柱花草和水稻秸稈青貯功能熱譜圖如圖4所示。黃梁木葉精油添加組和對(duì)照組之間有明顯差異。

3 討論

3.1 青貯原料的特點(diǎn)

從柱花草和水稻秸稈的高粗蛋白含量可見，它們可以作為緩解全球飼料供應(yīng)壓力的有效蛋白質(zhì)資源^［20］。真蛋白在蛋白質(zhì)利用中起到重要作用，雖然柱花草和水稻秸稈中的真蛋白含量高，但它們的纖維含量過高，難以被直接利用，因此需要采用合適的加工方式進(jìn)行處理。青貯作為一種常用的新鮮牧草保存方式，不僅可以為牲畜提供全年所需的飼料^［21］，還可以提高飼料的質(zhì)量，使飼料的氣味香，口感佳^［22］。影響青貯品質(zhì)的關(guān)鍵因素有原料的可溶性糖含量和主要附生于乳酸菌的附生微生物等^［23］?？扇苄蕴鞘乔噘A飼料的發(fā)酵底物，主要是由細(xì)菌分解代謝產(chǎn)生有機(jī)酸，使得青貯的pH值降低。一般來說，為得到保存良好的青貯飼料，飼料的可溶性糖含量需超過60～70 g·kg^-1［24］，而在本研究中，柱花草與水稻秸稈的可溶性糖含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不滿足需求，這意味著有機(jī)酸產(chǎn)量將極大受限，導(dǎo)致青貯過程中的高pH值無法抑制梭狀芽孢桿菌等有害細(xì)菌^［25］。有研究者認(rèn)為，要保證青貯品質(zhì)良好，乳酸菌含量至少達(dá)到5 lg cfu·g^{-1 ［26］}。本研究青貯原料中乳酸菌數(shù)量多，柱花草中乳酸菌含量為6.29 lg cfu·g^-1，水稻秸稈中為6.18 lg cfu·g^-1，但同時(shí)其他微生物含量亦高，如酵母（柱花草為5.06 lg cfu·g^-1，水稻秸稈為4.33 lg cfu·g^-1），霉菌（柱花草為4.46 lg cfu·g^-1，水稻秸稈為3.56 lg cfu·g^-1）和大腸桿菌（柱花草為7.59 lg cfu·g^-1，水稻秸稈為6.40 lg cfu·g^-1）。不同種類的微生物會(huì)競爭不足的底物進(jìn)行好氧或厭氧發(fā)酵，這表示在柱花草與水稻秸稈青貯的早期階段，乳酸菌可能難以占據(jù)主導(dǎo)地位。因此，青貯原料的上述特性表明，如不添加適當(dāng)?shù)那噘A添加劑，由于可溶性糖含量不足和不良微生物帶來的影響，柱花草和水稻秸稈是難以直接進(jìn)行青貯處理的。

3.2 柱花草和水稻秸稈的青貯發(fā)酵品質(zhì)，微生物群落數(shù)量和蛋白質(zhì)含量

添加黃梁木葉精油對(duì)青貯的pH值、乳酸、乙酸、乳酸菌和大腸桿菌數(shù)量及氨態(tài)氮含量均有顯著影響。青貯過程中利用附生微生物并將其轉(zhuǎn)化為可溶性糖以生成有機(jī)酸，而青貯的pH值會(huì)隨著有機(jī)酸的積累而降低。在本試驗(yàn)中，柱花草和水稻秸稈的青貯處理均呈現(xiàn)較高的pH值，且柱花草青貯后的pH值高于水稻秸稈青貯pH值（pH＞4.20，青貯保存效果佳），這表明不同的飼料在青貯過程中的pH值變化是不同的，有研究表示青貯原料的pH值受原料緩沖能值和蛋白質(zhì)水解反應(yīng)影響大^［27］。除此之外，黃梁木葉精油的添加利于青貯pH值的下降，可能是由于精油的抑菌性質(zhì)抑制了大腸桿菌等不良微生物對(duì)乳酸的代謝，使乳酸的量增加，從而使青貯的pH值隨著乳酸的積累而降低。在此試驗(yàn)中，乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物乳酸隨黃梁木葉精油的添加而增加，主要反映在青貯初期pH值的下降，是占主導(dǎo)地位的有機(jī)酸，而乙酸主要是由乳酸菌的異質(zhì)發(fā)酵而產(chǎn)生的^［28］。乙酸是腐敗微生物的抑制劑，因此在青貯好氧暴露階段使好氧穩(wěn)定性更強(qiáng)^［29］。同時(shí)，在柱花草和水稻秸稈青貯材料中均未檢測到丙酸，而丁酸也僅在水稻秸稈中檢測到，是由于黃梁木葉精油的添加而降低了其含量。丁酸是由梭狀芽孢桿菌二次發(fā)酵產(chǎn)生的，這對(duì)營養(yǎng)保存是不利的^［7］。上述有機(jī)酸組成也可以解釋黃梁木葉精油改善乳酸菌發(fā)酵的原因。表2所示的微生物群落可以進(jìn)一步證明黃梁木葉精油的抗菌作用。乳酸菌是青貯中最占優(yōu)勢的微生物，而隨黃梁木葉精油的添加，乳酸菌數(shù)量顯著降低，這可能是因?yàn)榘c球菌，明串球菌，片球菌和乳球菌在內(nèi)的球菌對(duì)低pH值的耐受性較差^［30-31］，一些不耐酸乳酸菌的生長受到了發(fā)酵時(shí)大量產(chǎn)生的乳酸的抑制。此外，添加黃梁木葉精油使青貯飼料中大腸桿菌的數(shù)量顯著降低，酵母和霉菌的數(shù)量也均低于檢測水平。綜上所述，添加黃梁木葉精油有利于提高柱花草和水稻秸稈的青貯發(fā)酵品質(zhì)。

青貯飼料的蛋白質(zhì)組成是評(píng)價(jià)發(fā)酵品質(zhì)的重要指標(biāo)，而飼料的青貯處理目的是對(duì)牧草中生物質(zhì)和營養(yǎng)的高效保存，然而由于蛋白質(zhì)水解而引起的營養(yǎng)損失是不可避免的。蛋白質(zhì)水解也稱為蛋白質(zhì)降解，是一種動(dòng)態(tài)的酶和微生物的反應(yīng)過程，將真蛋白轉(zhuǎn)化為包括小肽、游離氨基酸氮和氨態(tài)氮在內(nèi)的非蛋白氮^［30］。因此，青貯過程中蛋白質(zhì)的水解不僅會(huì)使青貯品質(zhì)降低，而且會(huì)產(chǎn)生過多的瘤胃可降解的蛋白質(zhì)。許多研究聚焦關(guān)注青貯過程中蛋白質(zhì)的保存，如單寧酸提高桑葉青貯中的真蛋白比例^［14］，沒食子酸降低大豆秸稈全株青貯中的氨態(tài)氮含量^［7］。

青貯飼料中的氨態(tài)氮含量是蛋白質(zhì)分解的重要指標(biāo)^［32］，能夠直接反映青貯飼料的質(zhì)量，主要與大腸桿菌等不良微生物的活性有關(guān)。因此，黃梁木葉精油的添加對(duì)降低青貯柱花草和水稻秸稈中的氨態(tài)氮含量有積極作用，它可能通過抑制大腸桿菌的生物活性從而減少氨基酸或多肽的脫氨基作用^［7］。氨態(tài)氮占非蛋白氮的比例隨黃梁木葉精油的添加而增加，說明非蛋白氮中可能有豐富的多肽游離氨基酸，多肽游離氨基酸對(duì)牲畜的健康生長起到積極作用。綜上所述，添加黃梁木葉精油的青貯柱花草和水稻秸稈能較好地保存青貯蛋白。

3.3 柱花草和水稻秸稈青貯的細(xì)菌多樣性

近年來，許多研究證明青貯過程中的菌群與發(fā)酵質(zhì)量密切相關(guān)^{［23，33］}，也因此，新一代微生物測序技術(shù)已成為青貯飼料質(zhì)量評(píng)價(jià)的常規(guī)技術(shù)手段并已廣泛應(yīng)用。在本試驗(yàn)中，青貯柱花草和水稻秸稈的細(xì)菌群落ɑ多樣性見表4?？傮w而言，兩種飼料青貯處理的良好覆蓋值均達(dá)到0.99以上，表明樣品數(shù)據(jù)足以代表不同青貯處理中所有細(xì)菌群落?？傮w而言，與對(duì)照組相比，添加黃梁木葉精油使柱花草和水稻秸稈青貯的OTUs，豐富度和多樣性均提高。類似試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，大豆秸稈青貯的OTUs，豐富度和多樣性指數(shù)也隨沒食子酸的添加而增加^［7］。此外，單獨(dú)青貯的兩種牧草的細(xì)菌群落與經(jīng)黃梁木葉精油添加處理的樣品有明顯區(qū)別。由此可見，添加0.5%和1.0%黃梁木葉精油的柱花草和水稻秸稈青貯發(fā)酵品質(zhì)較好，可能是因?yàn)榫偷奶砑犹岣吡思?xì)菌群落的多樣性、組成和豐度，從而使發(fā)酵品質(zhì)提高。

3.4 柱花草和水稻秸稈青貯的細(xì)菌豐度

細(xì)菌群落積累圖譜可以清晰地反映出門和屬水平上的多樣性和豐度變化，總體而言，在柱花草青貯處理中，厚壁菌門、變形菌門、藍(lán)藻門和放線菌門是前四大優(yōu)勢門，黃梁木葉精油的添加極大程度地改變了這些門的相對(duì)豐度。在水稻秸稈青貯處理中，前四大優(yōu)勢門與柱花草青貯處理一致，但添加黃梁木葉精油前后，厚壁菌門、變形菌門、藍(lán)藻門和放線菌門的變化都不大。該試驗(yàn)結(jié)果與此前其他研究者的發(fā)現(xiàn)基本一致^［34］，即厚壁菌門和變形菌門是大麥青貯處理中最占優(yōu)勢的門（占總相對(duì)豐度的99%以上）。藍(lán)藻菌和放線菌也常見于許多其他青貯處理中^{［21，30］}，但青貯柱花草與青貯水稻秸稈在屬水平上的細(xì)菌群落組成和豐度還是存在較大差異。在水稻秸稈青貯處理中，乳桿菌、黃單胞桿菌、乳球菌和明串球菌占主導(dǎo)地位，這些屬的豐度也因添加黃梁木葉精油的處理而發(fā)生變化。一般來說，乳桿菌作為一種嚴(yán)格同質(zhì)發(fā)酵的乳酸菌，可以分解1 mol葡萄糖產(chǎn)生2 mol乳酸，從而在青貯初期使pH值快速降低，抑制梭狀芽孢桿菌等不良細(xì)菌^［35］。添加黃梁木葉精油降低了梭狀芽孢桿菌的豐度，在青貯過程中梭狀芽孢桿菌是不利于飼料蛋白質(zhì)和干物質(zhì)保存的屬^［36］。與此同時(shí)，乳桿菌和其他乳酸菌（包括魏斯氏菌、腸球菌和乳球菌）通常被用作青貯飼料添加劑^［37］，目的是在可溶性糖不足的飼料青貯發(fā)酵過程中占據(jù)主導(dǎo)地位。但在水稻秸稈青貯處理中，添加黃梁木葉精油使乳球菌和明串球菌的相對(duì)豐度降低了，這可能是因?yàn)檫@兩個(gè)屬的耐酸能力弱^［31］。明串球菌是發(fā)酵初期到中期的優(yōu)勢菌屬^［38］，后期明串球菌的數(shù)量減少可能反映了經(jīng)添加黃梁木葉精油處理青貯飼料后，干物質(zhì)含量較高的原因，因?yàn)槊鞔蚓菂捬醢l(fā)酵過程中二氧化碳的主要來源^［39］。由于可以抑制大腸桿菌和真菌的生長^［40］，從而降低苜蓿青貯中的pH值和氨態(tài)氮含量^［41］，泛菌在柱花草青貯中占據(jù)著主導(dǎo)地位。青貯中甲基桿菌的相對(duì)豐度因黃梁木葉精油的添加而增加。甲基桿菌是一種嚴(yán)格的嗜中性和需氧細(xì)菌，在飼料青貯中常見^［7］。甲基桿菌在碳循環(huán)中起到了至關(guān)重要的作用^［42］，且其還可用于發(fā)酵工業(yè)中生產(chǎn)各種氨基酸、輔酶和維生素^［43］。異根瘤菌在生物固氮中起重要作用，同時(shí)它常導(dǎo)致葡萄在栽培過程中感冠癭病^［44］。添加黃梁木葉精油提高了水稻秸稈青貯中黃單胞桿菌的豐度，但有研究證明^［45］黃單胞桿菌是植物病原體，會(huì)導(dǎo)致許多牧草品種患細(xì)菌性枯萎病。甲基桿菌、異根瘤菌和黃單胞桿菌在青貯中的具體功能尚不明確，我們預(yù)估黃梁木葉精油可能是通過改變細(xì)菌群落的多樣性和豐度來改善青貯質(zhì)量。與柱花草青貯相比，水稻秸稈青貯的發(fā)酵品質(zhì)更好，可能是由于水稻秸稈青貯中有較為理想的菌群，乳桿菌、明串球菌和乳球菌的豐度高，而異根瘤菌和甲基桿菌的豐度低。添加黃梁木葉精油對(duì)柱花草和水稻秸稈青貯的脂質(zhì)、能量、碳水化合物和氨基酸代謝均有促進(jìn)作用。隨黃梁木葉精油的添加，生物合成和其他次生代謝產(chǎn)物的量也在增加，說明黃梁木葉精油不僅是可以提高青貯品質(zhì)的有效添加劑，而且在畜牧業(yè)中具有潛在的生物學(xué)功能。

4 結(jié)論

本研究表明，添加黃梁木葉精油可以降低柱花草和水稻秸稈青貯過程中的pH值、氨態(tài)氮含量、乳酸菌和大腸桿菌的數(shù)量，提高水稻秸稈青貯中乳酸的含量和真蛋白的比例，增加細(xì)菌多樣性和最優(yōu)勢屬乳桿菌的相對(duì)豐度。綜上所述，添加1%黃梁木葉精油可有效改善柱花草和水稻秸稈青貯發(fā)酵品質(zhì)。

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（責(zé)任編輯 劉婷婷）