乳酸菌與纖維素酶對丹參地上部分青貯品質的影響

收稿日期：2024-01-18；修回日期：2024-04-08

基金項目：山東省重點研發計劃項目（2019YYSP026）；浙江大學山東（臨沂）現代農業研究院服務地方經濟發展項目（ZDNY-2021-FWLY02004）資助

作者簡介：酆炳森（1997-），男，漢族，河北張家口人，碩士研究生，主要從事農產品深加工研究，E-mail：fengbingsen2021@163.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：hanqingdian@lyu.edu.cn；yguoliu@163.com

摘要：為研究不同添加劑對丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）地上部分青貯發酵品質和微生物群落多樣性的影響，以丹參地上部分為材料，自然發酵為對照組，添加乳酸菌（Lactobacillus）（1×10⁸ CFU）、添加纖維素酶（0.1 g·kg^-1）、組合添加（乳酸菌（1×10⁸ CFU、纖維素酶0.1 g·kg^-1）為試驗組，60 d后取樣分析其品質及微生物多樣性。結果表明：處理組對飼料的粗蛋白、總多糖、乳酸含量和pH值有顯著影響。與對照組相比，添加乳酸菌顯著提高飼料的粗蛋白含量，顯著降低氨態氮/總氮；添加纖維素酶顯著提高飼料乳酸含量，降低pH值、氨態氮/總氮；組合添加原飼料粗蛋白含量不變，顯著增加可溶性碳水化合物、總多糖、乳酸含量，降低pH值、氨態氮/總氮。發酵顯著增加了乳酸桿菌屬的相對豐度，降低了鏈球菌屬（Streptococcus）的相對豐度，乳酸桿菌屬在發酵過程中起主要作用。總之，處理組均能提高丹參地上部分青貯飼料的品質，組合添加組的丹參地上部分青貯品質最佳。

關鍵詞：丹參地上部分；青貯；發酵品質；微生物多樣性

中圖分類號：S816.53 文獻標識碼：A 文章編號：1007-0435（2024）10-3313-07

Effects of Lactic Acid Bacteria and Cellulase on the Silage Quality of Above-ground Parts of Salvia miltiorrhiza

FENG Bing-sen¹， LIU Yu-shan²， LIU Ling-xiao³， WANG Xiao⁴， HAN Qing-dian^1*， LIU Yun-guo^1*

（1. School of Life Sciences， Linyi University， Linyi， Shandong Province 276005， China; 2. Shandong （Linyi） Modern Agricultural Research Institute of Zhejiang University， Linyi， Shandong Province 276000， China;3. Linyi Academy of Agricultural Sciences， Linyi， Shandong Province 276012， China;4. Pingyi Yuantong Herbal Medicine Technology Development Co.， Ltd， Pingyi， Shandong Province 273300， China）

Abstract：In order to study the effects of different additives on the silage fermentation quality and microbial community diversity of aboveground parts of Salvia miltiorrhiza Bunge，the aboveground parts of Salvia miltiorrhiza Bunge were used as the material，natural fermentation was used as the control group，and bacteria （1×10⁸ CFU），cellulase （0.1 g·kg^-1），and the combination of additives （bacteria 1 × 10⁸ CFU，cellulase 0.1 g·kg^-1） were added as the experimental group，and the samples were taken after 60 days of fermentation. The results showed that the treatment groups had a significant effect on the crude protein，total polysaccharide，pH value and lactic acid content of the feed. Compared to the control group，the addition of the lactic acid bacteria significantly increased the crude protein content of the feed and significantly decreased the ammoniacal nitrogen/total nitrogen. The addition of cellulase significantly increased the lactic acid content of the feeds and decreased the pH and ammoniacal nitrogen/total nitrogen. The combination of the additions maintained the original feeds’ crude protein content，significantly increased the content of the soluble carbohydrates，total polysaccharides，and lactic acid，and decreased the pH value and ammoniacal nitrogen/total nitrogen. Fermentation significantly increased the relative abundance of Lactobacillus and decreased the relative abundance of Streptococcus. Lactobacillus played a major role in the fermentation process. In conclusion，all treatment groups improved the quality of Salvia miltiorrhiza Bunge above-ground part silage，and the best quality of Salvia miltiorrhiza Bunge above-ground part silage was obtained in the combination addition group.

Key words：Above-ground parts of Salvia miltiorrhiza;Silage;Fermentation quality;Microbial diversity

丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）是唇形科多年生草本植物，在國內種植面積約1.3萬km²，主要分布于山東臨沂、四川中江、山西萬榮等地^［1-2］。丹參具有活血止痛、通經止痛、寧心安神、涼血消癰等功效，在臨床上主要用于治療痛經經閉、胸痹心痛，脘腹脅痛等疾病^［3-4］。丹參的藥用部分主要是其根和根莖，而丹參的地上的組成部分占植株總生物量的60%～70%，花、莖、葉等非藥用部位未被充分利用，造成資源浪費^［5］。研究發現，丹參的地上部分具有和地下部分類似的生物活性和化學成分^［6］。丹參葉含有多種化學成分包括包酚類、黃酮類、萜類化合物等，其中有效成分為蘆丁、異槲皮素、山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖糖苷、丹參素、咖啡酸等物質^［7-9］。

丹參地上部分含有較高含量的粗纖維、蛋白質和多糖等物質，可以作為優質的牧草資源。纖維素酶被廣泛用作飼料添加劑，可有效破壞細胞壁，將細胞壁中的纖維素降解成還原糖，通過增強纖維消化來提高日糧的營養價值，并提高反芻動物的生產性能^［10］。乳酸菌可以迅速在青貯飼料中生長繁殖，形成優勢菌群，并有效抑制有害微生物的生長，改良青貯飼料的發酵品質^［11］。青貯可以提高丹參地上部分的適口性和利用率，也可緩解冬季粗飼料的不足。目前為止，關于丹參地上部分在飼料中的應用及研究鮮有報道，特別是利用乳酸菌和纖維素酶單一及組合添加對丹參地上部分影響的研究未見報道。

本試驗旨在探究乳酸菌、纖維素酶及組合添加對丹參地上部分青貯飼料發酵品質的影響，為丹參地上部分資源的開發利用提供科學依據，為優質牧草的青貯發酵提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

青貯原料為‘魯丹參1號’，收集結實期的丹參地上部分。經測定丹參地上部分青貯前的干物質（Dry matter，DM）含量為37.8%，粗蛋白（Crude protein，CP）含量為6.41%，中性洗滌纖維（Neutral detergent fiber，NDF）含量為20.8%，酸性洗滌纖維（Acid detergent fiber，ADF）含量為12.0%，可溶性碳水化合物（Water soluble carbohydrate，WSC）含量為3.08%、總多糖（Total polysaccharide，TP）含量為0.49%。乳酸菌（植物乳桿菌Lactobacillus plantarum，保存于臨沂大學生命科學學院食品實驗室菌種庫）添加量為1×10⁸ CFU·mL^-1，纖維素酶制劑購買于上海源葉生物科技有限公司，酶活力50 U·mg^-1。

1.2 試驗設計

試驗以丹參地上部分為原材料，設置自然青貯（CK_60）、添加植物乳桿菌（R_60），添加纖維素酶（M_60），添加植物乳桿菌+纖維素酶（RM_60）四個處理。R組植物乳桿菌添加量為2 × 10⁸ CFU·kg^-1，M組纖維素酶添加量為 0.1 g·kg^-1，R+M組植物乳桿菌和纖維素酶添加量與R組和M組相同。每個處理進行3個重復。

1.3 青貯調制

將丹參地上部分剪碎至1 cm以內，每個處理組稱取500 g，置入聚乙烯真空包裝袋中，排除空氣并封口。在28℃恒溫培養箱避光保存60 d后開封，進行相關指標測定分析。

1.4 測定指標和方法

營養指標分析：原料及青貯飼料的CP含量采用凱氏定氮法^［12］測定；ADF和NDF含量參考嚴小龍等人的方法^［13］測定；WSC含量采用蒽酮-硫酸比色法測定，參考余汝華等的方法測定^［14］；TP含量采用苯酚-硫酸法^［15］測定；DM含量測定方法參考GB/T 6435-2014^［16］測定。

發酵品質分析：pH值采用pH計測定；氨態氮（Ammonia nitrogen，AN）含量采用凱氏定氮法測定^［17］；乳酸（Lactic acid，LA）、乙酸（Acetic acid，AA）、丙酸（Propionic acid，PA）、丁酸（Butyrate，BA）含量采用液相色譜法測定^［18］。

微生物多樣性的測定：使用E.Z.N.A^TM Mag-Bind Soil DNA Kit（Omega，美國）試劑盒對樣品中微生物的總DNA進行提取。選取細菌16S rRNA基因的V3-V4可變區，使用細菌16S rRNA通用引物F（CCTACGGGNGGCWGCAG）和R（GACTACHVGGGTATCTAATCC）對提取的DNA模板進行PCR擴增（95℃下保持3 min，95℃保持30 s，45℃保持30 s，72℃保持30 s循環5次，然后95℃保持30 s，55℃保持30 s，72℃保持30 s循環20次，最后72℃延伸5 min）。使用Illumina MiSeq平臺（Illumina Corporation，San Diego，美國）進行測序。

1.5 數據分析

使用Microsolft Eecel進行數據整理，Graphpad prism 9.0軟件進行方差分析和多重比較。數據結果以平均數±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 不同處理對丹參地上部分青貯飼料營養成分的影響

丹參地上部分的DM含量為 379 g·kg^-1，CP含量為 63.77 g·kg^-1，NDF含量為209.67 g·kg^-1，ADF含量為122.33 g·kg^-1，WSC含量為30.67 g·kg^-1，TP含量為4.93 g·kg^-1。丹參地上部分青貯后，DM，CP，NDF，WSC，TP含量降低，ADF含量增加。添加乳酸菌和纖維素酶對丹參地上部分的營養成分影響情況如表1所示。

各處理組的DM含量均顯著低于對照組（P<0.05），添加纖維素酶組的DM含量最低為346.33 g·kg^-1。乳酸菌處理的CP含量高于對照組，但組合添加處理的CP含量低于對照組，纖維素酶處理的CP含量顯著低于對照組（P<0.05）。乳酸菌和纖維素酶處理的NDF含量均顯著低于對照組（P<0.05），組合添加處理的NDF含量也低于對照組。乳酸菌、纖維素酶及組合添加處理的ADF含量均顯著低于對照組（P<0.05）。乳酸菌處理的WSC含量顯著低于對照組（P<0.05），纖維素酶和組合添加處理的WSC含量均顯著高于對照組（P<0.05）。乳酸菌處理的TP含量低于對照組，纖維素酶和組合添加處理的TP含量均顯著高于對照組（P<0.05）。

2.2 不同處理對丹參地上部分青貯飼料發酵品質的影響

丹參地上部分的pH值為6.28，AN/TN為1.63，LA含量為3.33 g·kg^-1，乙酸含量為8.30 g·kg^-1，丙酸含量為0.85 g·kg^-1。丹參地上部分青貯后，飼料品質有明顯變化，pH值和AA含量顯著降低，AN/TN，LA，PA含量顯著增加（P<0.05）。乳酸菌、纖維素酶和組合添加處理對丹參地上部分青貯飼料發酵品質的影響如表2所示。

乳酸菌處理降低了青貯飼料的pH值，纖維素酶和組合添加處理的pH值均顯著低于對照組（P<0.05），組合添加處理的pH值最低為4.43。乳酸菌、纖維素酶和組合添加處理的AN/TN值均顯著低于對照組（P<0.05），纖維素酶處理的AN/TN值最低，為2.30，與對照組相比下降了59.22%。乳酸菌處理的LA含量顯著低于對照組（P<0.05），達到最低值18.94 g·kg^-1，纖維素酶和組合添加處理的LA含量顯著高于對照組（P<0.05），纖維素酶處理的LA含量最高為21.34 g·kg^-1。乳酸菌、纖維素酶和組合添加處理的AA含量均顯著低于對照組（P<0.05），乳酸菌處理的AA含量最低，為4.27 g·kg^-1。乳酸菌、纖維素酶和組合添加處理的PA含量均顯著低于對照組（P<0.05），乳酸菌處理的PA含量最低為0.62 g·kg^-1。在原料和處理組樣品中均未檢測到BA。

2.3 青貯飼料微生物多樣性分析

通過16S rRNA基因擴增子的高通量測序，一共得到205 347個細菌序列。基于生物信息學分析的結果，這些序列被聚類成了501個可操作的分類單元（Operational taxonomic units，OTU）。如表3所示，各樣本的OTUs范圍為56～128，對照原料的OTU最低為56，添加乳酸菌、纖維素酶及其組合的青貯后飼料的OTU均大于100，其中組合添加組的最高為128。不同樣品中的覆蓋率均達到0.99，可以代表樣品中的真實情況，Shannon指數、Chao指數和Ace指數和OTUs具有相似的趨勢，接種乳酸菌組和添加纖維素酶組以及組合添加組的細菌豐度高。組合添加組的Shannon指數和Ace指數最高，Chao指數在添加纖維素酶組最高。對OTU數量進行比對得到CK時期菌群結構最簡單，RM60時期菌群結構最復雜；Shannon指數越大，群落豐富度越高，Simpson指數與其相反，指數越大群落豐富度越低，說明了接種乳酸菌和纖維素酶的混合組群落豐富度最高。

5個處理組共獲得138 個OTU（圖1），其中共有OTU數量28個，占比20.29%。CK，CK_60，R_60，M_ 60和RM_60分別含有56，102，110，105和128，表明組合添加組的物種數目最多。CK，CK_60，R_60，M_ 60和RM_60特有的OTU數目分別含為3，0，2，4和33個，表明組合添加組的特有物種數目最大。

發酵后青貯飼料中微生物群落結構發生顯著改變，在門水平下細菌微生物多樣性變化如圖2所示，藍細菌門（Cyanobacteria）是發酵前新鮮丹參葉最優勢的菌門，占比87.61%，不同方式發酵后青貯飼料中厚壁菌門（Firmicutes）代替藍細菌門成為最優勢菌門，從發酵前的0.16%，顯著增加至51.55%～80.34%。對比CK60，R60和M60三種不同處理方式，M60中厚壁菌門的相對豐度最高。在屬水平下不同方式發酵前后青貯飼料中微生物多樣性變化如圖3所示，發酵前后共有6種優勢菌屬（物種豐度≥1%），分別為乳桿菌屬（Lactobacillus）、鏈球菌屬（Streptophyta）、片球菌屬（Pediococcus）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、短波桿菌屬（Brevundimonas）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）。

發酵后乳桿菌屬的相對豐度增加，從發酵前的0.04%，顯著增加至發酵后49.55%～76.30%，表明乳桿菌屬在不同處理方式的發酵過程中均起主要作用。鏈球菌屬的相對豐度降低，從87.62%下降至15.87%～27.04%。

3 討論

3.1 不同處理對丹參地上部分青貯飼料營養品質和發酵指標的影響

飼料的營養成分是評價飼料品質最直觀的指標，測定飼料營養成分的含量可以對飼料品質進行初步評估^［19］。飼料的DM含量是反映飼料營養價值的重要指標之一^［20］，在青貯過程中，添加劑組的DM含量顯著下降，該結果與牛瓊梅等研究的青貯飼料在不同處理組的DM含量下降結果一致^［21］。該結果可能由于青貯前期，有氧環境中的好氧微生物將CP迅速分解并產生AN/TN，同時消耗大量營養物質，導致青貯飼料中DM含量降低。該試驗中添加乳酸菌的CP含量高于空白對照組，可能是因為乳酸菌促進LA發酵，同時抑制腐敗菌等有害微生物的生長繁殖，降低了蛋白質和氨基酸的降解。三個處理組中，添加纖維素酶組的CP含量最低，添加乳酸菌組的CP含量最高，因此添加乳酸菌可以獲得CP含量較高的飼料。

NDF和ADF可以反映飼料的纖維含量，纖維素含量影響動物的采食率和消化率^［22］。丹參地上部分原料中NDF和ADF含量較高，青貯后NDF含量下降，ADF含量增加，與對照組相比乳酸菌、纖維素酶及組合添加均降低了NDF，ADF含量。有研究表明，添加乳酸菌和纖維素酶可以降低青貯飼料中的纖維含量，這與本研究結果一致^［23-24］。原因可能為乳酸菌發酵過程中利用了纖維素而導致其含量降低，纖維素酶促使細胞壁分解，細胞內容物泄漏，導致飼料的纖維含量下降，并轉化為發酵底物^［25-26］。WSC是青貯飼料發酵品質的重要指標^［27］，原料中WSC和TP含量較高，青貯后顯著下降，與對照組相比添加纖維素酶和組合添加中的WSC和TP含量較高，可能因為添加劑處理后，降解組織細胞，導致NDF和ADF含量降低，而轉化為糖類物質，該結果與楊紅、張歡等的研究結果相一致^［28-29］。

不同處理組對青貯飼料的pH值，AN，LA，AA和PA含量有顯著影響（P<0.05）。pH值是評價青貯飼料品質的重要指標，較低的pH值可以抑制有害微生物的生長繁殖，當飼料的pH值小于4.5時說明飼料品質較好^［30］。AN/TN可以判斷有害微生物分解青貯飼料蛋白質的程度，比值越低，品質越好^［31］。本研究中添加纖維素酶和組合添加組青貯飼料的pH值均在4.5以下，且顯著低于對照組（P<0.05）。三個處理組均顯著提高了青貯飼料的LA含量，顯著降低了AN/TN以及AA和PA含量，該結果與鄭明揚、魏曉斌等的研究結論相一致^［32-33］。

3.2 丹參地上部分青貯飼料的微生物多樣性

在門水平下，發酵后青貯飼料中厚壁菌門代替藍細菌門成為最優勢菌門，這與吳陸處等人的研究結果相一致。厚壁菌門是起主要作用的發酵菌門，可以有效地分解植物飼料中的粗纖維，從而提高飼料的適口性^［34］。對比三種不同添加方式，在添加纖維素酶的飼料中厚壁菌門的相對豐度最高，由此可知添加纖維素酶處理的青貯飼料可以提高厚壁菌門的相對豐度，與Mu等的結果相一致^［35］。厚壁菌門本身就具有以纖維素作為營養物質分解纖維素的效果^［36］，所以在RM60中纖維素酶本身分解了一部分纖維素，同時添加了植物乳桿菌，菌種數量大幅度增加導致營養不足出現了爭搶現象，最終導致了厚壁菌門在RM60時相對豐度較低的現象。

在屬水平下，可能由于纖維素酶降解了一部分乳桿菌生長代謝所需的營養物質，或纖維素酶分解代謝產物更有利于鏈球菌屬、片球菌屬等微生物生長，使得在添加酶的樣品中的乳桿菌比重比自然發酵和乳酸菌單菌發酵的樣品中低。纖維素酶在青貯飼料發酵過程中起到的主要作用為將植物中的纖維素降解成還原糖，同時還可以起到破壞植物的細胞壁使得胞內的蛋白質等營養物質釋放到環境中的作用；發酵后的對照組和添加乳酸菌組Shannon指數、Chao指數和Ace指數低于添加纖維素酶及組合添加組，表明自然發酵和添加乳酸菌減少了微生物群落的豐富性，這與Li等人的研究結果一致^［37］。這可能是丹參地上部分含有較多乳桿菌及乳桿菌接種迅速降低了pH值，因此許多微生物被抑制并被乳桿菌取代^［38］。鏈球菌屬是一種在室外空氣中常見的高度交叉污染的菌株^［39］。鏈球菌屬在發酵前豐度較高，說明其在丹參地上部分大量附著，發酵后鏈球菌屬豐度降低，可能是低pH值、溫度或無氧環境抑制其生長繁殖。發酵后增加了青貯飼料中有益菌的相對豐度，不僅可以抑制腐敗菌致病菌等有害菌的生長，還可以降低養分的消耗^［40］。

4 結論

綜上，單獨添加或組合添加乳酸菌、纖維素酶提高了青貯飼料的粗蛋白、洗滌纖維、可溶性碳水化合物等營養成分含量，提高了pH值和氨態氮含量。飼料的青貯過程影響了微生物結構，青貯增加了飼料中的有益微生物豐度，提高了青貯飼料的品質和適口性。綜合分析，組合處理組的丹參地上部分青貯飼料質量最佳。

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（責任編輯 閔芝智）