薄殼山核桃花粉LTP基因的克隆和功能分析

關鍵詞：薄殼山核桃；花粉離體萌發；脂質轉移蛋白；植物內生菌

中圖分類號：S664.1 文獻標志碼：A 文章編號：1003—8981（2024）03—0001—09

山核桃屬Carya Nutt. 植物多是重要的堅果和木本油料作物[1]，其中原產北美的薄殼山核桃[2]Carya illinoinensis （Wangenh.） K. Koch 和浙江山核桃Carya cathayensis Sarg 是目前山核桃屬植物中最具經濟價值的兩個種[3]。薄殼山核桃作為山核桃屬植物[4] 中雌雄同株異花的風媒花異交植物，較早就有對其生殖機理的研究報道，內容多集中在花粉萌發方面，現已建立了較好的花粉離體萌發體系， 是山核桃屬花粉研究中一個很好的實驗模型。浙江山核桃雖然也是雌雄同株異花，但傾向于無融合生殖[5-6]，其花粉的發育和萌發規律尚不清楚，這也是浙江山核桃雜交育種的難點。從進化角度看，雖然薄殼山核桃和浙江山核桃染色體數都是32，但是薄殼山核桃是山核桃組中較為進化的，而浙江山核桃卻是比較原始的類型[7]。Sparks[8] 根據分子進化和化石方面的信息，可以將山核桃屬植物分為東北美（East North American，簡稱“ENA”）和東亞（East Asian，簡稱“EA”）2 個類群，薄殼山核桃和浙江山核桃分別是這兩個類群的代表。開展這2 個種生殖機理的比較研究對于揭示山核桃屬植物的遺傳進化規律具有重要意義。

近年來，蛋白質組學技術在挖掘授粉有關機理方面發揮了重要作用。例如，Teixeira 等[9] 分析了蓖麻花粉成熟、水合和萌發3 個不同階段的蛋白質組，發現了40 多種在成熟花粉和萌發花粉中差異顯著的蛋白質，并且其中的大多數與能量代謝和信號傳導有關。ITRAQ（Isobaric tags forrelative and absolute quantitation，同位素標記的相對和絕對定量）是近年來蛋白質組學常用的高通量篩選技術之一，適合進行不同生理狀態的蛋白質組差異分析。例如，Shrestha 等[10] 利用ITRAQ和DGE（Digital Gene Expression Profiling， 數字基因表達）技術研究煙草Nicotiana tabacum 花粉獨特的發育過程，揭示了早期雙細胞花粉、晚期雙細胞授粉和6 h 花粉管這3 個階段的蛋白質和基因變化特點，結果表明了轉錄后調控在煙草早期和晚期花粉發育中的重要性。Robinson 等[11] 利用ITRAQ 和轉錄組相結合，對甘藍型油菜Brassicacarinata 的成熟花粉和柱頭進行了無凝膠鳥槍蛋白質組學研究，分別鑒定出5 608 個和7 703 個蛋白，發現兩者既存在許多共同的功能和發育目標，也存在與自身細胞特化有關的重要差異。Pei 等[12]利用ITRAQ 相關技術檢測雄性不育系和正常辣椒的蛋白質組差異，篩選出1 645 個明顯豐度差異的蛋白，發現主要是與葉綠體和細胞質有關的蛋白，推測可能與雄性不育辣椒的敗育有關。Robinson等[13] 利用ITRAQ 技術，從小黑麥中篩選出647個在花粉與柱頭結合時有差異變化的蛋白。上述研究說明，ITRAQ 蛋白質組在研究花粉和柱頭發育方面有著獨特的潛力。

在山核桃屬植物育種研究過程中，薄殼山核桃花粉離體萌發較為容易，而浙江山核桃花粉離體萌發較為困難。本研究基于ITRAQ 技術比較了薄殼山核桃和浙江山核桃花粉離體萌發前后蛋白質組變化的差異，篩選出顯著差異蛋白，據此信息克隆了差異最為顯著的非特異脂轉移蛋白基因（Non-specific Lipid-Transfer Protein，下簡稱LTP基因），并研究了部分基因的表達規律和初步功能。

1 材料與方法

1.1 材料

供試山核桃屬Carya 葉片與花粉材料于2020年5 月分別采自浙江省林業科學研究院的薄殼山核桃資源圃和浙江省杭州市臨安區，薄殼山核桃品種為Pawnee。從樹上取下薄殼山核桃和浙江山核桃帶有雄花序的枝條，在18 ℃空調室鋪開晾過夜，然后將散出的花粉收集混合再分裝于2mL 試管，再密閉凍存于-80 ℃備用。用于蛋白質組分析的樣品分為萌發前和萌發后兩個狀態，通過下述方法收集萌發前花粉樣品：從-80 ℃取出花粉樣品，置于常溫干燥箱中處理1 h，將處理后的花粉均勻分散在培養皿表面，然后將培養皿置于飽和硫酸銅上方，在16 ℃條件下水合4 ～ 6 h，收集水合后的花粉凍存于-80 ℃備用。收集萌發后花粉樣品的方法為：取0.01 g 水合處理后的花粉樣品，將其與50 μL 萌發液充分混合，然后將混合后的液體均勻涂布于固體萌發培養基的玻璃紙上，在25 ℃條件下使樣品萌發5 h 左右，隨后將萌發后的樣品置于顯微鏡下觀測，以確認樣品的萌發程度及狀態，最后，收集部分萌發后的花粉樣品并在-80 ℃條件下保存備用。大腸桿菌表達載體pET32a（+），Trans1-T1（DH5α）、由本實驗室保存；TransZol Up、DNase I、TransScript Two-Step RTPCRSuperMix、TransStart Taq DNA Polymerase、Amp （Ampicillin）、X-gal、IPTG、DNA Marker 購自上海生工生物工程有限公司；Hind Ⅲ和BamHI 限制性內切酶購于北京擎科生物有限公司；引物合成和測序由北京擎科生物有限公司完成。

1.2 蛋白質組分析

蛋白質的提取、iTRAQ 標記和液質聯用分析按文獻要求處理[14-15]，反相柱為C18 column （1.8 mm，0.15×100 mm），色譜儀器為Thermo Fisher EasynLC1000，質譜儀器為Thermo Fisher LTQ ObitrapETD， 流動相A 為0.1% 的甲酸水溶液， 流動相B 為100% 乙腈溶液，流速為300 nL/min，掃描質荷比的范圍為350 ～ 1 600。數據處理采用Maxquant1.5.8.3 軟件，胡桃juglans 屬數據庫，差異蛋白篩選基于倍數變化，大于2.0 倍的變化判定為上調，小于0.5 倍的被定義為下調。

1.3 LTP基因的克隆

取適量薄殼山核桃葉片或雄花序， 液氮冷凍研磨粉碎后， 采用參照RNA 提取試劑盒操作方法提取總RNA。用反轉錄試劑盒（ 大連TaKaRa 公司） 將提取的總RNA 反轉錄成cDNA。基于本研究薄殼山核桃轉錄組數據中的LTP 基因序列設計引物： 上游引物F：5′-ATGGCTGGCTCCTTGGTCCTTAARC-3′；下游引物R：5′-TCATTTCACAGTTTTGCAGTTAGTG-3，以薄殼山核桃cDNA 為模板進行PCR 擴增，總反應體系為20 μL：其中包括1 μL cDNA，上下游引物各1 μL （ 濃度1.0 μmol/L），10 μL Taq mixture，ddH2O 補足20 μL。PCR 擴增參數為95 ℃預變性5 min；94℃ 30 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，32 個循環，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增產物經電泳回收，連接TA 載體，進行測序。

1.4 LTP基因表達分析

實時定量PCR 按照SYBR Premix Ex Taq 試劑盒（大連TaKaRa 公司）說明書進行，相對定量的計算參照常用的2-ΔΔCT 法。采用Excel2010 軟件處理數據，萌發后相對于萌發前的基因表達（即以萌發前相對表達量為1），采用雙樣本異方差假設的t 檢驗（雙尾）。qRT-PCR 采用SYBR Green法在BIO-RAD IQ5 上完成。為增加相對定量的客觀性，GAPDH 和EF1 2 個看家基因為內參，內參基因引物如表1 所示。根據LTP 基因序列對LTP1和LTP2 各設計一對表達檢測引物：P-LTP1F7：CCTTAAACTCTCAGGCATGGTTCTG，P-LTP1R7：TTGAGTAACCGTACCCTTGAGGTAGC；P-LTP2F8：TTAAGCTCTCAGGCATGGTGCTTC，P-LTP2R8：ATTGCAGCAGTTTGGAGGGACTT。

1.5 LTP 基因分析和蛋白空間結構預測

LTP基因的序列分析采用vector NTI 10.0（Invitrogen）軟件，蛋白質分子量和等電點等采用ProtParam 軟件計算，蛋白信號肽采用Signal P6.0 軟件分析，跨膜區域預測采用TMHMM2.0 軟件，蛋白的疏水性和親水性采用ProtScale 軟件。預測蛋白質二級結構采用PSIPRED 4.0 軟件。空間結構預測在xCREATOR 工作臺（https：//xcreator.tianrang.com/）上進行，采用alphafold2 算法。

1.6 花粉離體萌發體系和LTP基因功能驗證

薄殼山核桃花粉離體萌發體系見參考文獻[16-17]。利用大腸桿菌體系進行LTP 蛋白的表達，對LTP 基因根據大腸桿菌密碼子的偏好和酶切位點的特點進行優化，采用酶切位點BamH Ⅰ、Hind Ⅲ將LTP 基因通過克隆載體pMD19-T 轉移到表達載體pET-32a（+）中，該載體在感受態細胞OrigamiB（DE）pLySs 中通過IPTG 誘導表達LTP，表達后的LTP 蛋白為包含His-Tag 的融合蛋白，可以通過親和柱進行純化。選取IPTG（1.0 mmol/L）誘導表達后6 h 提取的LTP 蛋白，提取后加入萌發體系探究其對花粉萌發的影響。

2 結果與分析

2.1 薄殼山核桃和浙江山核桃花粉離體萌發前后蛋白譜比較分析

薄殼山核桃的萌發體系較為完善，萌發率較高，而浙江山核桃只有少量萌發，比較兩個體系的蛋白差異，共鑒定出蛋白375 個，經同源比對，發現其中只有20 個屬于山核桃屬植物，其余均是微生物的蛋白。從萌發后相對于萌發前的變化來看，兩種植物均未有明顯下調的蛋白出現，表明其蛋白變化規律在一定范圍內存在一致性，而且萌發后兩種植物多數蛋白差異也不十分明顯（表2）。就上調的規律而言，在薄殼山核桃中，這20 個蛋白都是上調的，在浙江山核桃中，只有AP1、Putativeextensin、Glutamine synthetase、Protein Ycf2、9-cisepoxycarotenoiddioxygenase 和ATP synthase subunitbeta 這6 個是上調的。對兩種植物萌發前后蛋白比值的比較發現，有部分蛋白在兩種植物中花粉萌發前后的變化規律是相反的，如Non-specific lipidtransferprotein 和60S acidic ribosomal protein P2。兩種植物萌發前后的蛋白變化揭示這些蛋白在兩種植物中的活躍程度，如非特異脂蛋白（Non-specificlipid-transfer protein）比值達18.6 倍，表明其在薄殼山核桃中比在浙江山核桃中活躍很多，此篩選結果為后續分離薄殼山核桃花粉萌發有關基因并開展功能研究提供了依據。

2.2 薄殼山核桃LTP 同源基因的克隆和表達分析

通過蛋白質譜得到的多肽序列為AAATTADR，從Genbank 搜索現有的薄殼山核桃預測蛋白，發現存在兩個比較相似的基因位點，針對其編碼區設計薄殼山核桃LTP 同源基因的引物，以薄殼山核桃cDNA 為模板，經PCR 擴增后得到兩個360 bp的片段，分別命名為LTP1 和LTP2（圖1）。為了增加相對定量的客觀性和可靠性，本研究同時以Gapdh 和EF1-α 分別為內參基因，通過熒光定量PCR 檢測LTP 基因在薄殼山核桃花粉萌發前后相對表達情況，可以發現薄殼山核桃LTP1 和LTP2 基因的總體表達規律相似。CiLTP1 基因在以Gapdh 為內參基因時，花粉萌發后基因表達是萌發前（即相對表達量）4.4 倍（P=0.035 ＜ 0.05），以EF1 為內參基因時， 其相對表達量為4.3 倍（P=0.016 ＜ 0.05），兩者結果一致，均為顯著上調。而CiLTP2 雖然分別以Gapdh 和EF1 為內參時，相對表達量分別達到2.6（P=0.075 ＜ 0.05）和2.9（P=0.176 ＜ 0.05），但統計表明萌發前后無顯著差異（圖2）。因此，推測CiLTP1 與花粉萌發有更高的相關性。

2.3 薄殼山核桃LTP 基因的功能分析

序列分析表明， 薄殼山核桃LTP1 和LTP2基因均編碼119 個氨基酸，相同氨基酸比例達84%，相似氨基酸高達89.9%（如圖3），且其疏水腔所在區域氨基酸位點基本上是相同或相似。總的來說，ProtParam 預測的蛋白質特征差異，主要在穩定性方面LTP1 明顯更好一些（表3）。對CiLTP1 深入分析表明，其N 端存在一個27 氨基酸左右的信號肽，具有顯著的疏水性，具有跨膜的結構特點（圖4）。對LTP 進行空間結構的預測，結果顯示薄殼山核桃CiLTP1 主要由α- 螺旋和不規則卷曲組成且該蛋白二級結構不含β- 轉角。三級結構通過alphafold2 進行預測，結果顯示，LTP 基因編碼的蛋白由4 個α- 螺旋和1 個C 末端構成，其中1 個類似口袋狀的疏水結構位于中間，以便結合和容納脂肪酸分子相關[18]。植物LTP 的主要特征是在高度保守的區域（C-Xn-CXn-CCXn-CXC-Xn-C-Xn-C）[19] 中存在8 個半胱氨酸殘基，形成4 個穩定的二硫鍵。山核桃屬植物也具備此特征，由此確定此蛋白屬于Non-specificlipid-transfer protein type I 類蛋白，不過在第16 位的氨基酸也是半胱氨酸，因此山核桃屬植物LTP蛋白中存在9 個半胱氨酸殘基。此外，植物LTP的晶體結構由4 個或5 個α 螺旋組成，并在中央疏水腔中發生脂質結合。對LTP 結構域分析表明其存在由保守的脂質結合基序構成的AAL-LTSS超家族保守結構域，此結構域是胰蛋白酶、α– 淀粉酶抑制劑和脂質轉移蛋白所共有的特征。

2.4 CiLTP1 蛋白對花粉離體萌發的影響

利用已經建立的薄殼山核桃離體萌發體系來初步驗證LTP 在花粉萌發中的功能。在大腸桿菌DE3 菌株中用IPTG（1.0mmol/L）誘導6 小時后，由于LTP 在95 ℃加熱仍具有脂質轉移特性，在80 ℃加熱進一步純化后，將LTP1 加入花粉萌發體系后發現LTP1 對薄殼山核桃花粉萌發率和花粉管長度無顯著影響（表4）。

3 結論與討論

3.1 結論

通過比較薄殼山核桃和浙江山核桃兩者花粉萌發前后的蛋白質譜的差異，篩選出在兩種山核桃屬植物花粉萌發中表達差異最大的非特異性脂質轉移蛋白LTP，克隆了薄殼山核桃CiLTP1 和CiLTP2基因，并分析了其生物學特性和基因表達特點，但在薄殼山核桃花粉離體萌發體系中未發現體外表達的CiLTP1 蛋白有影響花粉萌發的功能。

3.2 討論

3.2.1 蛋白質組學方法研究花粉萌發的生物學意義

花粉萌發早期的研究結果表明，植物的成熟花粉與萌發花粉蛋白質組成大體相似。例如，將玉米Zea mays L. 的成熟花粉和離體萌發花粉進行蛋白質組學分析表明，花粉萌發前后中高豐度蛋白質表達譜的差異并不明顯，萌發過程中花粉結構和代謝的顯著變化并沒有在蛋白質表達譜上表現出來[20]。本試驗中檢測到的山核桃屬植物的蛋白不多，但在薄殼山核桃中檢測到的20 個蛋白均是上調的，表明萌發前后的差異較大，這些蛋白中主要包括參與運輸、防御反應、能量代謝、脅迫反應、基因調控、信號轉導和細胞壁形成有關的蛋白質，這與以往的研究結果較為相似[21-22]。本研究萌發前后使用質譜數據搜庫搜索出的總蛋白數目不多，可能與可供參考的山核桃屬蛋白數據庫有關。因為，蛋白質組學的定性、定量結果是數據庫依賴型的，數據庫質量越高，結果越準確。山核桃屬目前雖然有部分種類完成了全基因組測序，但是由于存在較多重復序列，得到準確注釋的蛋白質數據比較少。另一方面，本研究所用的花粉樣品來自野外，攜帶微生物的蛋白是正常的，但是在結果中發現高達94.7% 的微生物蛋白是令人驚訝的，而這些微生物蛋白絕大多數是來自黃單孢菌Xanthomonas campestris，我們推測該菌可能在核桃屬的花粉中廣泛存在，且影響萌發。然而，最近對該菌的分離和影響萌發試驗并未發現有顯著影響，可能其存在其他一些相關性，值得進一步探討。

3.2.2 研究植物LTP基因的生物學意義

脂質轉移蛋白lipid transfer proteins， LTPs 廣泛分布于動植物和微生物中，是一類小分子量堿性單體蛋白質。在植物體中由于作用范圍廣且無專一性又被稱為非特異性脂質轉移蛋白non-specific lipidtransfer proteins， nsLTPs，占可溶性蛋白的4%，能夠轉運多種疏水性分子，一般分布于植物器官的皮細胞和外周細胞及器官脫離區[23]，該蛋白質熱穩定性較高，這與它的獨特結構有關[24]。nsLTPs 可分為3 類：nsLTPs Ⅰ、nsLTPs Ⅱ和nsLTPs Ⅲ，是依據其一級結構及分子量的大小進行分類的。本研究發現的CiLTP1 和CiLTP2 都屬于Ⅰ類。

對于脂質轉移蛋白的功能研究已有大量進展，植物中的非特異LTP（nsLTP）在很多生物過程如角質的合成、胚胎形成、脅迫防御、抑制半胱氨酸蛋白酶與α淀粉酶活性等方面都發揮著十分重要的作用[25]，有些甚至具有抗菌、抗真菌、抗病毒和體外抗增殖的作用[26]。脂質轉移蛋白對植物的花藥生長也有重要影響，主要是涉及花藥生長發育階段脂類的運輸過程[27-29]。比如，已經發現了部分Ⅰ類和Ⅲ類nsLTPs 都可在花粉發育過程中（花粉母細胞到小孢子時期）有著高度選擇性地表達于絨氈層內[30]。有對脂質轉移蛋白信號肽信息的研究，證實了nsLTPs 轉運方式為細胞分泌，進入花藥室并參與花藥壁的發育過程[31]。但對小麥的研究結果表明，一些Ⅲ類nsLTPs 發揮作用的階段僅在種苗發育環節[32]。黃岳等[30] 研究擬南芥和水稻花藥發育發現，脂質轉移蛋白在花藥發育各個時期大量表現，同時在細胞凋亡途徑中也有高水平的表現，細胞凋亡的脂類產物可被運送到其他細胞中去再次利用。裴徐梨等[33] 研究青花菜LTP 基因時發現，LTP 基因特異表達于花蕾中，并且表達量與花蕾發育程度呈負相關。唐征等[34] 研究板栗的脂質轉運蛋白發現，短雄花序突變體比正常雄花序中的脂質轉移蛋白表達率更高，推斷LTP 可以參與胚乳中的脂質再利用或者是充當蛋白酶抑制劑來保護正常生長的子葉。脂質轉移蛋白與花粉發育形成具有高度相關性且影響著花粉萌發，因此本試驗開展山核桃屬植物脂質轉移蛋白與花粉萌發關系的研究，對于探明其生殖機理特別是山核桃育種問題顯得尤為重要。

為探討上述重要問題，下一步還需要在多方面改進并進行深入研究。例如，本試驗未發現LTP 基因的體外表達產物能影響薄殼山核桃花粉萌發，這可能有多方面的原因。首先，這可能與其未能正確進行細胞定位有關，因為LTP 蛋白通常需要在細胞內發揮作用，充當第二信使提供信號通路[35]，而現有體外表達的蛋白很難滲透進入細胞。其次，原核表達的脂質轉移蛋白，可能存在與真核生物不同的修飾，導致其難以參與花粉萌發有關的信號通路。還有，花粉自身的狀態可能也是影響LTP 作用的因素之一，因為試驗重復性的要求，往往采用冷凍保存的花粉，隨著冷凍時間的延長，花粉萌發率明顯下降，如本試驗所用的Pawnee 花粉在剛剛采集時測得萌發率達60%以上，冷凍半年以后下降到20%。另外，未來克隆山核桃屬植物其他種的LTP 同源基因也是重要的方向，這樣有助于從進化角度分析脂質轉移蛋白在山核桃屬內不同物種中功能的保守性。