腐植酸負載納米零價鐵對鎘污染農田水稻籽粒代謝的影響

關鍵詞：鎘；腐植酸負載納米零價鐵；水稻；代謝組學；差異代謝物

水稻是我國重要的糧食作物，農田土壤重金屬污染會嚴重影響其產量及品質。據統計，我國每年因農田重金屬污染減產的糧食超過1200萬t，造成直接經濟損失200多億元。其中，鎘（Cd）作為農田土壤中主要的重金屬污染物之一，其點位超標率為7.0%。Cd在農田土壤一植物系統中的遷移、轉化行為極為活躍，不僅會嚴重影響土壤結構與功能，還可富集于水稻、小麥等糧食作物籽粒中，并經食物鏈作用于人體肝臟、腎臟及運動系統等，對人類健康造成潛在威脅。因此，改善農田土壤環境、保障糧食安全生產，不僅是環境科學發展的重要方向之一，也是提升農業生態環境安全的重要需求。

近年來，納米技術的發展為污染農田土壤的快速、綠色修復提供了新機遇。其中，納米零價鐵（Na-noscale zero-valent iron，nZVI）因具有比表面積大、表面活性高及還原活性強等優勢，在解決土壤重金屬污染問題上顯示出了良好的應用潛力。一方面，nZVI可通過鈍化作用，降低土壤中鉻（Cr）、鉛（Pb）及Cd等重金屬污染物的生物可利用性，削弱有毒物質向食物鏈遷移能力，在重金屬污染土壤的修復中起著核心作用。另一方面，nZVI可促進水稻根表鐵膜形成，限制Cd向植物內部遷移。值得注意的是，nZVI作為一種潛在的納米肥料，可促進水稻分蘗、淀粉等營養物質合成，從而提高水稻產量。盡管nZVI在重金屬污染農田土壤修復中彰顯了良好的應用前景，然而受范德華力、高表面能和磁性作用影響，添加到環境中的nZVI顆粒易發生團聚或氧化，這嚴重限制了其在現實土壤污染修復中的推廣應用。因而，nZVI的改性研究受到了國內外研究者的持續關注。

腐植酸（HA）作為一種天然有機聚合物，含有大量的活性官能團，兼具來源廣泛、環境風險低等特點，已成功應用于包括nZVI、硫化亞鐵等在內的多種鐵基納米材料的改性過程。HA改性鐵基納米材料的分散性、穩定性及其在多孔介質中的遷移能力均有顯著提升，且在污染物修復過程中展現了更高的反應活性。Tan等證明經HA包覆后納米硫化亞鐵水合粒徑減小，且該材料可通過吸附、還原及共沉淀作用，實現對含Cr（Ⅵ）廢水的高效修復。然而相關研究主要集中于HA改性鐵基納米材料對環境介質中重金屬修復及生物有效性的影響，對于其如何影響污染修復過程中水稻籽粒營養物質合成尚不得而知。

代謝組學旨在對生物細胞在特定時期內小分子代謝物質（相對分子質量小于1000）進行定量和定性分析，目前已廣泛應用于醫學、中藥學、環境毒理學等領域。代謝組學技術不僅有助于識別差異代謝物、辨別作物品種，還可通過篩選差異代謝通路揭示作物抵抗逆境的調控機制。Lan等利用代謝組學技術發現，水稻幼苗組織可通過上調氨基酸、有機酸等組分緩解Cd污染脅迫。然而，目前對于土壤Cd污染修復研究較少關注到nZVI及其改性材料對水稻籽粒代謝過程的影響，有關污染農田土壤修復過程中籽粒的分子響應機制尚不清晰。為此，本研究采用吸附絡合一液相還原法制得一種HA改性nZVI材料（nZVI@HA），結合水稻盆栽實驗，利用代謝組學技術，探明nZVI及其改性材料對于Cd污染土壤修復過程中水稻產量、籽粒中Cd賦存水平及營養物質組成結構的影響。

1材料與方法

1.1土壤采集與分析

受試土壤采自浙江省紹興市柯橋區任家畈村稻田0～20cm表層土（29°57' 40\"N，120°30' 34\"E）。土樣經風干過篩后備用。受試土壤pH為6.35、有機質含量為65.93g·kg-1，堿解氮、有效磷和有效鉀含量分別為211.77．31.03mg·kg-1和150.63mg·kg-1。

1.2試劑及儀器

硫酸亞鐵（FeS04，AR，上海凌峰化學試劑有限公司）、硼氫化鈉（NaBH4，含量≥96%，國藥集團化學試劑有限公司）、氯化鎘（CdCl2，AR，國藥集團化學試劑有限公司）、硝酸（HN03，GR，晶瑞電子材料股份有限公司）、過氧化氫（H202，GR，永華化學股份有限公司），代謝組分析所用有機溶劑均為色譜級。

火焰原子吸收光譜（VARIAN公司）、有機元素分析儀艾力蒙塔貿易（上海）有限公司、電感耦合等離子體質譜（ICP-MS，賽默飛）、超高效液相色譜串聯傅里葉變換質譜（UHPLC-Q Exactive HF-X，賽默飛）、掃描電鏡（SEM，荷蘭FEI公司）。

1.3材料的合成與表征

以商品化腐植酸鉀為原料，通過酸析法獲得HA，采用液相還原法制得nZVI，并在此基礎上通過改進合成nZVI@HA。具體操作方法如下：配制FeS04與HA混合溶液，攪拌12h后，在氮氣條件下泵入NaBH4溶液，經攪拌、離心、真空干燥獲得nZVI@HA。利用SEM對HA、nZVI及nZVI@HA進行形貌結構表征。所得材料經微波消解后，總鐵含量以火焰原子吸收光譜測定。利用有機元素分析儀測定各材料中C、N、H和S的含量。

1.4盆栽實驗

以浙粳100為受試生物，利用水稻盆栽實驗，比較研究Cd污染土壤中，nZVI、HA單一／聯合處理以及nZVI@HA作用下水稻產量及籽粒代謝物組成結構。各組Cd含量為20mg·kg-1，考慮到nZVI@HA中鐵含量為58.5%，各處理設置如下：空白組、nZVI@HA處理組（1000mg·kg-1）、單一nZVI處理組（585mg·kg-1）、單一HA處理組（415mg·kg-1）、nZVI和HA聯合處理組（585mg·kg-1 nZVI+415mg·kg-1 HA），分別記為CK、nZVI@HA、nZVI、HA、nZVI+HA。nZVI等修復材料通過與潔凈土壤逐級稀釋均勻分散于土壤中，以達到實驗設置的含量；Cd2+以CdC12溶液的形式注入到土壤中后攪拌均勻。老化處理參照王萌等的方法，土壤靜置平衡兩周后再種植水稻，各處理含干土質量為3.5kg，實驗設置3個平行，每個平行包含3株水稻作物。實驗期間保持盆栽液面高于土壤1-3cm。于灌漿期收集水稻籽粒，籽粒經液氮速凍后保存于-80℃冰箱，用于代謝組學分析；于140d收割水稻記錄籽粒質量后進行籽粒Cd含量測定。

1.5水稻籽粒Cd含量測定

水稻籽粒中Cd含量的測定方法參考《食品安全國家標準食品中鎘的測定》（GB 5009.15_2014）。成熟期籽粒冷凍干燥之后脫殼、研磨，稱取0.5g于消解管中，增設兩個空白試劑以及標準Cd大米[GBW（E）100358]進行質量控制，加入5mL HN03以及2mLH202，利用微波消解儀進行消解，經趕酸、定容后使用ICP-MS測定Cd含量，質控樣品平均回收率為92.9%。

1.6水稻籽粒代謝組學分析

稱?。?0+5）mg灌漿期籽粒，加入400uL含有0.02mg·mL-1 L-2-氯苯丙氨酸的甲醇提取液。樣品經研磨、超聲30min（5℃，40 kHz）、靜置30min（-20℃）、離心15min（4℃，13000g）后，移取上清液至棕色液相小瓶中，待測。

利用UHPLC-Q Exactive HF-X平臺進行代謝物質分析。詳細儀器條件如下：色譜柱為AcoUITYUPLC HSS T3（100mmx2.1mm i.d.， 1.8um; Waters.美國）；流動相A為95%水+5%乙腈（含0.1%甲酸），流動相B為47.5%乙腈+47.5%異丙醇+5%水（含0.1%甲酸），進樣量為3uL．柱溫為40℃。利用正負離子掃描模式采集質譜信號，其中正模式及負模式噴霧電壓均為3500V，掃描范圍為70～1050m/z，鞘氣及輔助氣流速分別為50arb和13arb，鞘氣和輔助氣均為氮氣，毛細管溫度為425℃，S-Lens電壓為50V，碰撞能為20、40、60 eV，Full MS及MS2分辨率分別為60000和7500。

1.7數據處理與統計分析

利用SPSS 27.0軟件對數據進行統計分析，數據正態性以q-q plot和Shapiro-Wilk檢驗，方差齊性以Levene檢驗，并對非正態、非齊性數據進行對數轉換。對滿足正態分布及方差齊性的數據采用單因素方差分析（ANOVA）和LSD進行檢驗。利用ProgenesisQI（WatersCorporation，Milford，美國）軟件進行代謝組學數據分析，以HMDB Version 5.0（https：//www．hmdb．ca/）、METLIN（https：//metlin．scnpps．edu/）數據庫及美吉自建數據庫進行代謝物鑒定匹配。

2結果與討論

2.1材料的表征

對HA、nZVI及改性后的nZVI@HA進行形貌結構分析、有機元素分析及總鐵含量測定。如圖1所示，HA在掃描電鏡下呈不規則塊狀結構，nZVI為球形且高度聚合的鏈條狀，nZVI@HA的電鏡照片顯示球形的nZVI分散于塊狀的HA表面。元素分析及總鐵含量測定結果顯示，HA中C、Fe、N、H、S的含量分別為50.9%、0.8%、1.1%、3.2%、2.1%，nZVI中上述元素含量分別為0.3%、84.4%、0、0.3%、0.1%，nZVI@HA中各元素含量分別為16.4%、58.5%、0.4%、1.1%、0.2%。上述結果表明nZVI@HA材料制備成功。

2.2不同修復材料對Cd污染土壤上水稻生產的影響

不同處理條件下水稻產量及籽粒Cd含量如圖2所示，CK組水稻產量為4.24g·株-1，nZVI、HA和nZVI+HA組水稻產量分別為5.29、6.67g·株-1和7.57g·株-1。Guha等的研究證實，nZVI可通過改善根系代謝、提升水稻光合速率、增加水稻葉片光合色素含量等途徑，促進Cd污染土壤上水稻產量的提升。張洪江等也發現Cd污染土壤中施加含HA的肥料有助于水稻產量的提升。值得注意的是，nZVI@HA組水稻產量最高，達到7.95g·株-1；且nZVI@HA處理組水稻籽粒Cd含量為0.155mg·kg-1，顯著低于CK（0.776mg·kg-1）、nZVI（0.442mg·kg-1）、HA（0.596mg·kg-1）及nZVI+HA處理組（0.392mg·kg-1）。該結果表明，nZVI@HA在顯著抑制水稻籽粒中Cd累積的同時還可以促進水稻籽粒產量的提升。然而，現有研究主要報道了nZVI等修復材料對農田土壤中重金屬遷移、轉化機制及生物有效性的影響，對于nZVI及其改性材料如何影響污染修復過程中水稻籽粒營養物質合成尚不得而知。闡明nZVI及其改性材料對農田Cd污染土壤修復過程中水稻籽粒營養物質組成結構的影響，有助于揭示農田Cd污染土壤修復過程中修復材料對水稻籽粒代謝物質的種類、含量及代謝通路的影響。

2.3代謝物多元統計分析

主成分分析（PCA）是一種無監督分析，通過對復雜數據進行降維處理，將復雜數據簡單化并揭示其結構關系。如圖3a所示，第一主成分解釋率為31.0%，第二主成分解釋率為14.7%，第三主成分解釋率為11.2%，主成分累計解釋率為56.9%，能在一定程度上反映各組水稻籽粒代謝物存在的差異。CK、HA與nZVI@HA、nZVI、nZVI+HA組在第一主成分上發生分離，其原因可能是CK組與HA組未添加Feo，導致CK和HA處理組水稻籽粒代謝物組成結構與nZVI@HA、nZVI和nZVI+HA處理組差異較大。偏最小二乘法回歸分析（PIS-DA）是一種有監督分析，可通過忽略組內誤差，突出組間誤差。圖3b顯示組內樣品更加緊密，組間樣本呈明顯分離，未出現重疊現象，說明模型適用性好。nZVI@HA、nZVI和nZVI+HA組在第二主成分發生明顯分離，其原因可能在于3組含Feo處理對于水稻籽粒代謝物組成及含量的影響差異較大。累計解釋率R2X及R2Y分別為0.699和0.983，Q2為0.797，置換檢驗結果均低于原始數據點（圖3c），且回歸線呈現向上的趨勢，說明模型具有良好的解釋度以及預測度。置換檢驗的結果顯示回歸線截距小于0.05，說明模型未發生過擬合，模型擬合結果可靠。

2.4差異代謝物篩選

為探究不同修復材料對Cd污染土壤上水稻籽粒代謝物組成的影響，以VIPgt;1、Plt;0.05為篩選標準，將nZVI@HA、nZVI、HA、nZVI+HA組分別與CK組作比較，篩選差異代謝物。如圖4a所示，nZVI@HACK組差異代謝物最多（高達436個，其中218個上調、218個下調），表明nZVI@HA對Cd土壤修復過程中水稻籽粒代謝物組成的影響最大；nZVI CK組差異代謝物次之（344個），其中265個上調，79個下調；nZVI+HA CK組差異代謝物較少（278個），其中131個上調，147個下調；HA CK組差異代謝物最少（120個），其中92個上調，28個下調。差異代謝物分類如圖4b所示，這些差異代謝物主要分為脂質和類脂分子、有機酸及其衍生物、有機雜環化合物、有機氧化合物、苯丙烷類和聚酮、苯環型化合物等。其中脂類不僅可作為水稻籽粒的營養成分，且對抵抗逆境脅迫起到積極作用。同時，有機酸是植物體內重要的金屬配體，可與進入水稻體內的重金屬發生絡合或螯合作用，從而降低重金屬的毒害作用。

2.5共有及HA處理特有差異代謝物分析

以各處理組CK組的差異代謝物組成代謝集，各代謝集共有及特有差異代謝物如圖5所示。研究結果表明，4組代謝集中含有9種共有差異代謝物，其中酵母氨酸（糖精）等6種化合物在nZVI@HA、nZVI、HA及nZVI+HA處理組中均顯著上調，癸烯酰基肉堿（HMDB0241069）等3種化合物顯著下調。經KEGG數據庫匹配，共得到賴氨酸降解（map00310）、賴氨酸生物合成（map00300）及核苷酸代謝（map01232）等11條代謝途徑。然而，以Plt;0.05且影響因子gt;0.1為篩選條件，無法富集到關鍵代謝通路。該現象說明，Cd污染土壤修復過程中，nZVI@HA、nZVI、HA及nZVI+HA處理對水稻籽粒營養物質合成及代謝的影響存在差異，無法通過相同的分子響應機制闡釋不同處理條件下水稻產量及品質提升的原因。這一結果與PCA分析一致，可能是由于含Feo處理組（即nZVI@HA、nZVI及nZVI+HA處理組）與HA處理組水稻籽粒營養物質組成結構差異較大，無法富集到共有的關鍵代謝路徑。HA CK、nZVI+HA CK及nZVI@HACK代謝集（即含HA處理）共有10個差異代謝物，其中1個為HA處理特有差異代謝物。該代謝物無法富集到代謝通路，表明HA處理對水稻籽粒代謝物種類及含量影響較小。

2.6 Feo處理特有差異代謝物及路徑分析

為探明nZVI及其改性材料對Cd污染農田土壤上水稻籽粒分子調控機制的影響，詳細考察了nZVI@HA、nZVI及nZVI+HA處理組（即含Feo處理）的差異代謝物組成。代謝集分析結果顯示，nZVI@HA CK、nZVICK及nZVI+HA CK組代謝集共有93個差異代謝物，其中84個為Fe0處理特有差異代謝物（39種上調、45種下調）。KEGG通路富集顯示，3種Feo處理特有差異代謝物共參與20條代謝路徑，其中僅有倍他林生物合成（map00965）、精氨酸和脯氨酸代謝（map00330）2條顯著富集代謝通路（Plt;0.05且影響因子gt;0.1）（圖6a）；同時注釋到的4種關鍵差異代謝物（脯氨酸、亞精胺、多巴胺、亞茶堿）均在nZVI@HA、nZVI及nZVI+HA處理下顯著上調。該結果表明，3種Feo處理均可通過促進其他次生代謝物合成及氨基酸代謝等方式，提升Cd污染土壤上水稻的產量及品質。已有研究證實脯氨酸、亞精胺及多巴胺等化合物在植物抗逆反應中發揮重要作用。如脯氨酸不僅具有滲透壓調節及重金屬螯合能力，還可以顯著降低Cd、Zn等重金屬污染對植物體內葡萄糖-6-磷酸脫氫酶及硝酸還原酶的脅迫。此外，亞精胺在緩解重金屬氧化脅迫的同時，還作為一種關鍵的植物生長促進因子，促進植物細胞分裂和營養物質合成。

2.7 nZVI@HA處理特有差異代謝物及路徑分析

各代謝集特有差異代謝物顯示：nZVI@HA CK組（166個）gt;nZVI CK組（87個）gt;nZVI+HA CK組（66個）=HA CK組（66個）。該結果與差異代謝物鑒定結果趨勢類似，表明nZVI@HA對于水稻產量及品質的提升作用不只是nZVI和HA的相加作用，而且nZVI@HA材料還可通過獨有方式作用于Cd污染土壤修復過程中水稻籽粒營養物質合成及代謝。nZVI@HACK組代謝集中166種特有差異代謝物共參與了水稻籽粒43條代謝途徑，其中包含丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝（map00250），核苷酸代謝（map01232），甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝（map00260）．甘油磷脂代謝（map00564）4條關鍵代謝通路（Plt;0.05且影響因子gt;0.1）（圖6b）。如表1所示，4條關鍵代謝通路中分別屬于氨基酸代謝、核苷酸代謝及脂質代謝過程。拓撲分析結果表明，nZVI@HA可通過顯著上調L-天門冬氨酸、L-絲氨酸、腺苷琥珀酸、腺苷酸基丁二酸、5’-單磷酸腺苷以及尿苷-5’-單磷酸6種特有差異代謝物，參與水稻籽粒關鍵代謝路徑。其中，L-天門冬氨酸及L-絲氨酸作為水稻籽粒發育過程中的關鍵代謝物，與稻米品質息息相關。研究結果表明，nZ-VI@HA通過這4條代謝通路促進關鍵代謝物的合成，是Cd污染土壤修復過程中水稻產量及品質提升的關鍵生物過程。

3結論

（1）nZVI及nZVI@HA材料均可顯著降低水稻籽粒中Cd含量，并明顯提升水稻產量。尤其是在nZVI@HA作用下，水稻產量顯著提升至空白組的188%、籽粒Cd含量降至0.155mg·kg-1，低于國家大米Cd限量標準（0.2mg·kg-1， GB2762-2022）.

（2）KEGG富集結果顯示，nZVI及nZVI@HA材料均可顯著上調倍他林生物合成及精氨酸和脯氨酸代謝途徑。

（3）nZVI@HA可特異性地作用于水稻籽粒丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，核苷酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝及甘油磷脂代謝途徑，進而實現Cd污染農田土壤上水稻產量及品質的提升。