漏縫地板發酵床對育肥羊養殖氣體排放的影響及微生物學機理

關鍵詞：漏縫地板發酵床；育肥羊；氨；溫室氣體；排放

近些年，我國育肥羊養殖規模不斷擴大，給人們帶來經濟效益的同時，也帶來一系列的負面環境問題，尤其是大氣污染。育肥羊養殖糞便長期堆存會釋放氨（NH3）、氧化亞氮（N20）、甲烷（CH4）和二氧化碳（C02）等到大氣中。據統計，2020年畜禽養殖業NH3排放占總排放量的68.67%，而育肥羊養殖排放的NH3占排放總量的12.14%。糞便中NH3揮發不僅會降低糞肥中的養分含量，其擴散到大氣中還會成為細顆粒物（PM2.5）的前體物，導致霧霾頻發。此外，CH4、N20和C02等都是大氣中重要的溫室氣體，而全球約18%的溫室氣體排放源于畜禽養殖業。因此，減少包括育肥羊在內的養殖業的NH3和溫室氣體排放對于實現畜禽養殖業的綠色可持續發展至關重要。

為了降低畜禽養殖過程的NH3排放，研究者采用控制舍內溫濕度、舍內噴霧除臭等措施，取得了一定的效果，但由于投入成本高、管理方式復雜的問題，難以推廣應用。微生物發酵床主要通過有益微生物組成的復合菌群分解、消納糞便中的有機物，從而促進糞便腐熟并減少NH3等氣體排放。微生物發酵床分為原位微生物發酵床和異位微生物發酵床兩種類型。與異位發酵床相比，原位發酵床具備建設運行成本低和鋪設簡單等優點，非常適合應用于牛、羊和家禽等畜禽養殖，石志芳等發現生物發酵床豬舍內的NH3濃度均值為（6.85+0.12）mg·m-3，顯著低于水泥地面干清糞和縫隙地面水泡糞的豬舍（Plt;0.05）。為了使微生物發酵床能夠應用于不同的畜禽種類和養殖規模，在此基礎上進行改良的漏縫地板發酵床具有適應性強和易于管理的優點。高旭采用“漏糞板+發酵墊料”羊床開展試驗，與地面羊床相比，發酵床組冬、夏季的NH3濃度分別降低32.94%和18.40%。然而，漏縫地板發酵床實現NH3減排的同時，CH4、N20和C02等溫室氣體排放特征如何？這其中的微生物學機理也有待進一步探究。因此，本研究采用漏縫地板發酵床（以下簡稱發酵床）養殖育肥羊，通過對比其與地面養殖育肥羊過程NH3和溫室氣體（CH4、N20和C02）的排放特征，同時利用宏基因組測序技術進一步解析影響上述氣體排放的微生物學機制，研究結果可為漏縫地板發酵床在畜禽養殖業的應用和推廣提供理論依據和技術參考。

1材料與方法

1.1漏縫地板發酵床

本試驗采用的發酵床由木質竹板鋪設而成，漏縫間隙為2-3cm．羊糞便可以透過縫隙落人下層的發酵床中。發酵床由墊料和菌種混合而成，墊料主要由稻殼、鋸末和秸稈組成，質量比例為5：3：2，墊料的鋪設高度為20cm，發酵床墊料基本理化性質為：pH7.44，有機質含量61.13%，總氮含量0.71%，總磷含量0.37%，總鉀含量1.62%。發酵床接種菌劑為微生物菌劑M，由保定三商生物科技有限公司提供，該微生物菌劑為混合菌劑，主要由乳酸菌、黑曲霉、枯草芽孢桿菌、糞腸球菌等組成（有效活菌數CFU≥5x108個．mL-1）。

1.2試驗設計

本試驗共包括兩個試驗處理，分別是發酵床和地面對照處理，試驗于2022年9-12月在河北保定唐縣一育肥羊養殖場進行，預試驗期為7d，正式試驗期為100d。試驗選用體況、大小基本一致的育肥羊共100只，隨機分配到地面組和發酵床組。在試驗期間，兩組羊舍均自然通風、不清理糞便，發酵床不補噴菌劑、也不進行翻拋，其余統一按照育肥羊養殖場常規管理規程進行。

1.3樣品采集與測定

1.3.1 NH3樣品采集與測定

本試驗NH3氣體樣品的采集參照海綿吸收法，共分為4個階段，每隔25d采集一次，每次連續采集5d。海綿吸收法浸提液中銨態氮濃度的測定采用流動分析儀，按實測濃度計算NH3的排放速率及試驗期間累積排放量。

1.3.2溫室氣體（N20、CH4、C02）樣品采集與測定

本試驗溫室氣體樣品的采集參照靜態箱法，在整個試驗周期內每隔5d采集一次，于上午9：00-11：00進行，將采集好的氣體樣品帶回實驗室，通過氣相色譜儀測定N20、CH4、C0：濃度，并計算相應的氣體的排放速率及試驗期間累積排放量。

1.3.3糞便樣品的采集與測定

為了分析糞便樣品理化性質的變化規律，分別于前期（1d）、中期（51d）和后期（101d）采集發酵床和地面0-20cm的糞便樣品，樣品采集時間為上午飼喂結束后，采用5點取樣法采集糞便樣品，混合均勻后保存樣品。其中，pH和含水率的測定采用新鮮糞便樣品，pH值使用pH計（FE28，LE501）進行測定（水土比10：1），含水率的測定采用恒質量法。糞便樣品風干后測定其中的總氮（TN）、總磷（TP）、總鉀（TK）和有機質等含量，測定方法參照國家標準《NY/T 525-2021》進行。其中TN測定采用凱氏定氮儀法，TP測定采用釩鉬黃分光光度法，TK測定采用原子吸收分光光度計法，有機質測定采用重鉻酸鉀容量法。

1.3.4微生物樣品的采集與測定

本試驗于試驗中期（51d）分別從發酵床和地面組采集100g新鮮糞便樣品進行微生物學分析。糞便樣品采集后置于-80℃冰箱中保存。宏基因組學分析委托上海美吉生物醫藥科技有限公司完成，樣品提取DNA后，使用Illumina

NovaSeq/Hiseq

Xten（ Illumi-na，美國）測序平臺進行宏基因組測序。通過Fastp對樣品原始數據進行質控，使用MEGAHIT對Cleandata進行拼接組裝，然后使用Prodigal v2.6.3c對拼接結果中的contig進行ORF預測。選擇核酸長度≥100bp的基因，并將其翻譯為氨基酸序列。然后采用CD-HIT軟件進行聚類構建非冗余基因集。同時，使用SOAPaligner軟件統計基因豐度信息。最后，使用DIAMOND軟件將非冗余基因集與NR、KEGG數據庫進行比對，以此獲得物種在各個分類水平上的物種注釋信息及基因對應的KEGG功能信息。

1.4數據統計與分析

采用Excel 2010軟件對數據進行整理與統計，采用Origin 2021軟件制圖，并用SPSS 26.0軟件進行t檢驗分析（a=0.05）。

2結果與分析

2.1漏縫地板發酵床對育肥羊養殖過程氣體排放特征的影響

2.1.1氣體排放速率

本試驗比較分析了發酵床和地面兩個處理在整個育肥羊養殖過程的NH3排放速率，由圖1可以看出漏縫地板發酵床能夠顯著降低育肥羊養殖過程的NH3排放速率（Plt;0.05）。試驗期間，地面組的NH3排放速率為40.56-136.11mg·m-2·h-1，而發酵床組的NH3排放速率為21.64-58.92mg·m-2·h-1，發酵床的NH3排放速率峰值約為地面組的43.29%。環境溫度對地面組NH3排放速率的影響較大。育肥羊養殖的第一、二階段（2022.09.18-2022.10.25）的環境溫度為15.1-23.9℃，這一時期的NH3排放速率為86.19-136.11mg·m-2·h-1。然而，在第三、四階段（2022.11.18-2022.12.25），由于環境溫度降低為-2.1-11.2℃，地面組的NH3排放速率下降至40.56-86.08mg·m-2·h-1。相比而言，發酵床組的NH3排放速率一直處于較低水平，在各個階段NH3排放速率相差較小，受環境溫度的影響較小。

試驗期間測定分析了地面和發酵床兩個試驗處理在整個育肥羊養殖期間的溫室氣體（N20、CH4和C02）排放速率。首先，漏縫地板發酵床使得育肥羊養殖過程的N20排放速率顯著升高（Plt;0.05），試驗期間發酵床組的N20排放速率為1.18-21.95mg·m-2．h-1，而地面組幾乎無N20的排放（0-0.20mg·m-2·h-1），發酵床組N20排放速率峰值約為地面組109倍。相反，微生物發酵床的CH4排放速率顯著降低（Plt;0.05），地面組的CH4排放速率為0.35-2.31mg·m-2·h-1．而發酵床組的CH4排放速率僅為0.02-1.02mg·m-2·h-1。地面組和發酵床組CH4排放速率峰值均出現在10月8日，分別為2.31mg·m-2·h-1和1.02mg·m-2·h-1，發酵床組的CH4排放峰值約為地面組的44.16%。

此外，試驗過程中兩個試驗處理的C02排放速率也顯著不同（Plt;0.05），見圖2c，地面組的C07排放速率為14.39-610.57mg·m-2·h-1，而發酵床組的CO2排放速率為163.00-1369.26mg·m-2．h-1，發酵床組的C02排放峰值是地面組的2.2倍，尤其是在10月3日一10月23日期間，發酵床的C02排放速率一直維持在1200mg·m-2·h-1左右，約為地面對照組的3.5倍，這段時間的環境溫度為14.7-21.3℃，有利于發酵床內微生物的新陳代謝。

2.1.2氣體累積排放量

本研究計算了兩個試驗處理在整個育肥羊養殖周期的NH3、N20、CH4和C02的累積排放量，如表1所示。發酵床組的NH3、C02、N20和CH4的氣體累積排放量與地面組之間存在極顯著差異（Plt;0.01）。與地面組相比，發酵床組的NH3和CH4累積排放量均極顯著降低（Plt;0.01）。地面組在整個試驗期間的NH。和CH4累積排放量分別為208.58g·m-2和74.94mg·m-2，而發酵床組NH3和CH4累積排放量僅為86.36g·m-2和26.66mg·m-2，減排率分別為58.60%和64.42%。其次，漏縫地板發酵床育肥羊養殖過程的N20和C02累積排放量顯著增加，其N20和C02累積排放量分別為994.30mg·m-2和52.13g·m-2，分別是地面組的190.84倍和3.67倍。

2.2漏縫地板發酵床對糞便樣品理化性質的影響

本研究分別于試驗的前、中、后期采集兩個試驗處理的糞便樣品，并分析其理化性質，見表2。在試驗開始的第1天，除TP外，發酵床和地面處理的糞便理化性質具有顯著差異（Plt;0.01），造成這一差異的原因有二，一是發酵床墊料中有稻殼、鋸末和秸稈等，這些物質會影響發酵床糞便的初始理化性質；二是在監測試驗開始前，進行了7d的預喂養試驗，這也會導致地面和發酵床兩個試驗處理糞便初始理化性質的不同。不過，從整體來看，試驗前、中和后期，兩個試驗處理的各理化指標呈現相同的變化規律，以含水率為例，兩個試驗處理的含水率逐漸升高，發酵床初始的含水率為24.9%，到試驗結束時為40.7%，分析含水率變化的原因主要與環境溫度相關。需要指出的是，雖然兩個試驗處理的TN含量在試驗期間逐漸降低，但發酵床的TN含量降低幅度更高，由初始的3.9%降低為2.7%，而地面對照的只降低了0.7%，推測這主要與微生物氮轉化生成N20、N2密切相關。

2.3漏縫地板發酵床育肥羊養殖過程的微生物學群落結構分析

2.3.1微生物群落結構對比分析

基于宏基因組學測序數據對發酵床組及地面組樣品的細菌微生物群落組成進行分析，在門水平上，如圖3a，兩個試驗處理主要的微生物菌門有厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidota）和變形菌門（Proteobacteria），約占細菌總豐度的96.70%-98.89%。其中Firmicutes為地面組的第一優勢菌門，占比為77.91%；而Actinobacteria為發酵床組的第一優勢菌門，占比為46.45%，屬于該菌門的微生物大多有基內菌絲，能夠促進糞便的分解。此外，發酵床組的Bacteroidota和Proteobacteria占比分別為12.88%和5.57%，高于地面組（5.83%和0.85%）。由圖3b可知，在屬水平上，地面組的第一優勢菌屬為陌生柱狀桿菌屬（Atopo.stipes），占比為19.72%，其次為厭氧球菌屬（Anaerococcu.s）和氣球菌屬（Aerococcu.s）相對豐度分別是11.25%和5.11%。上述微生物均是典型的動物腸道微生物，因此在糞便中被普遍檢出，與地面不同的是，發酵床組的第一優勢菌屬是鹽水球菌屬（Salinicoccu.s），占比16.67%。鹽水球菌具有優異的耐鹽性能，其成為糞便中優勢菌屬主要與育肥羊養殖時添加大量的鹽導致糞便中鹽含量較高有關。此外，鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）、棒狀桿菌屬（Corlrnebacterium）、短狀桿菌屬（Brachv一bacterium）和擬諾卡氏菌屬（Nocardiop.si.s）等也是發酵床組的優勢菌屬，相對豐度分別為9.90%、9.00%、6.00%和5.38%。上述微生物中，Sphingobacterium能夠降解環境中的微生物，并且具有根際促生作用，是土壤中的有益微生物。Nocardiops屬于經典的絲狀放線菌類群，廣泛存在于高鹽堿土壤生境中，其基絲異常發達，會斷裂成桿狀或球狀，多為長或短的分枝，在試驗開展過程中，發酵床糞便能夠形成大量的白色菌絲體，由此可以看出微生物發酵床的應用能夠促進糞便中有益菌群的大量繁殖。

2.3.2物種差異比較分析

發酵床組和地面組糞便樣品的微生物組成差異如圖4所示，在門水平上（圖4a），發酵床組糞便樣品的Actinobacteria、Bacteroidota和Proteobacteria的相對豐度分別為46.45%、12.88%和5.57%，極顯著高于地面組（6.65%、5.83%和0.85%）（Plt;0.001），而Fir-micutes則主要分布在地面組，相對豐度為77.91%。上述結果與兩個試驗處理的微生物群落結構對比分析結果一致。在屬水平上（圖4b），發酵床組中Salini-COCCMs、Sphingobacterium、Corynebacterium、BrachVbac-terium和Nocardiop.sis的相對豐度分別為16.67%、9.90%、8.95%、5.8%和5.38%，極顯著高于地面組（0.43%、0.0008%、0.69%、0.48%和0.04%）（Plt;0.001），而Atopo.stipe.s、Anaerococcu.s、Aerococcu.s則主要分布在地面組，相對豐度分別是19.72%、11.25%和5.11%。

2.4漏縫地板發酵床育肥羊養殖過程的碳氮轉化關鍵功能基因分析

2.4.1氮轉化功能基因分析

在微生物發酵床育肥羊養殖過程中，糞便堆存會排放大量的NH3和N20，這些氣體的排放均涉及氮轉化且與微生物代謝活動密切相關。本研究繪制了微生物發酵床的氮代謝通路（圖Sa），并對比分析了兩個試驗處理中與NH3和N20排放相關的差異基因，見圖Sb。結果表明，發酵床組編碼甲酰胺酶基因fmdA相對豐度高于地面組，表明發酵床組的氨化作用較活躍。此外，在發酵床組中，編碼羥胺還原酶基因hcp、編碼硝酸鹽還原酶基因narG、編碼亞硝酸鹽還原酶基因nirK、編碼一氧化氮還原酶基因norB、編碼一氧化二氮還原酶基因no.sZ等與硝化、反硝化相關基因均顯著高于地面組（Plt;0.001），這說明發酵床組硝化、反硝化作用較為活躍。此外，在谷氨酰胺合成過程中，谷氨酸脫氫酶GDH2、谷氨酸合酶gltB等在發酵床組的相對豐度均顯著高于地面組（Plt;0.001）。由此可以看出，發酵床組的硝化、反硝化、谷氨酸合成等氮轉化過程較為活躍，使得向大氣中排放的NH3減少，但同時導致了大量N20的生成。

2.4.2碳轉化關鍵功能基因分析

微生物發酵床在育肥羊養殖糞便堆存也會排放一定濃度的CH4和C02，這些氣體的排放與碳轉化過程密切相關。首先，糞便中的有機物在厭氧環境中會被厭氧微生物分解生成一定濃度的CH4，厭氧產CH4過程如圖6a所示，根據底物類型的不同，CH4的厭氧生物合成主要有3種途徑：C02還原（Hydrogenotro-phic）、乙酸裂解（Acetoclastic）和甲基營養（Methylo-trophic），基于宏基因組學數據對參與CH4代謝途徑的關鍵酶的基因進行分析，如圖6b所示，在發酵床糞便樣品中，涉及上述3種CH4生成途徑關鍵酶的基因的相對豐度均顯著低于地面組（Plt;0.001）。例如，乙酸裂解途徑中的編碼乙酰激酶的基因ackA、編碼磷酸乙酰轉移酶的基因pta、編碼乙酰輔酶A脫羰基酶的基因cdhE、編碼四氫甲蝶呤S-甲基轉移酶的基因mtrH、編碼甲基輔酶M還原酶的基因mcrA在發酵床組相對豐度分別為1.03%、0.47%、0.01%、0.02%和0.01%，顯著低于地面組（1.58%、1.22%、0.02%、0.07%和0.10%）（Plt;0.001）。此外，發酵床組及地面組有關甲烷氧化關鍵酶的基因（pmoA、mmoX）均未表達。這說明傳統地面養殖由于育肥羊的不斷踩實，容易形成厭氧環境，導致了地面組厭氧產CH4過程的發生，相反，漏縫地板發酵床的糞便在地板以下，保持通風能夠保證微生物所需的好氧環境，避免了厭氧產CH4相關微生物的增殖。

由于發酵床中微生物的代謝活動，會使得糞便堆體中的有機物轉化為無機物并釋放C02，其中，碳水化合物代謝是微生物分解糞便中有機物的主要途徑。本研究基于KEGG數據庫進行碳代謝模塊注釋分析，對編碼各代謝通路關鍵酶的基因進行差異性分析，結果如圖7所示，首先，在有機物分解方面，其中主要參與促進丙酮酸代謝、三羧酸循環的關鍵基因aceE、IDH1等在發酵床組的相對豐度均顯著高于地面組（Plt;0.001）。在C02生成方面，發酵床組編碼甲酸脫氫酶的基因fdoC相對豐度也顯著高于地面組（Plt;0.001），甲酸經甲酸脫氫酶作用也會產生大量的C02。編碼琥珀酰輔酶A合成酶基因sucD、編碼3-羥酰輔酶A脫氫酶基因fadN、編碼丙二酸半醛脫氫酶基因mm.sA等基因在發酵床組的相對豐度顯著高于地面組，表明發酵床組丙酸代謝、丁酸代謝和磷酸肌醇代謝較活躍，這也與發酵床較高的C02排放密切相關。

3討論

漏縫地板發酵床能夠有效降低育肥羊養殖過程的NH3排放，可以使得育肥羊養殖過程的NH3減排率高達58%以上。微生物發酵床能夠實現NH3減排的原因主要是由于發酵床中的微生物代謝活動促進了氮轉化，使得糞便中的有機氮轉化為銨態氮后，能夠進一步的發生硝化和反硝化作用，削弱了NH3向大氣的揮發過程。糞便樣品的宏基因組學分析結果也證實了這一推斷，發酵床糞便樣品中的Salinicoccus、Co-rynebacterium和Brachybacterium相對豐度均顯著高于地面組，這些微生物不僅耐鹽，而且與硝化過程有關，實現了銨態氮向硝態氮的轉化。此外，基因組學分析同樣能夠得出相同的結論，與地面組相比，發酵床組hcp、CDH2、gltB相對豐度顯著高于地面組（Plt;0.001），說明發酵床組硝化及谷氨酸合成過程較活躍，促進NH4+-N/NH3的轉化。

雖然微生物發酵床使得育肥羊養殖過程的NH3排放降低，但也造成育肥羊養殖過程較高的N20排放。N20生成主要與硝化和反硝化過程有關。發酵床中的優勢菌屬有Nocardiopsis，其主要參與反硝化作用，會導致N20的生成。宏基因組分析結果表明發酵床糞便中narG、nirK、norB、nosZ等基因相對豐度顯著高于地面組（Plt;0.001），同樣表明發酵床糞便中反硝化過程較活躍。因此推斷微生物發酵床育肥羊養殖過程中的N20主要來自于反硝化過程，未來可進一步采取措施控制微生物發酵床N20的排放。為實現微生物發酵床養殖育肥羊過程中N20減排，可以考慮在微生物發酵床墊料中添加如硝化、反硝化抑制劑等進一步驗證N20減排效果。

漏縫地板微生物發酵床養殖育肥羊還能夠顯著降低養殖過程中的CH4排放。傳統的地面養殖過程中，育肥羊的不斷踩實會導致厭氧環境的生成，從而造成一定濃度的CH4排放，而微生物發酵床中糞便在地板以下，具有較好的通風環境，因此不易產生厭氧環境，進而會抑制CH4的生成。宏基因組學結果顯示，地面組Atopo.stipe.s相對豐度顯著高于發酵床組（Plt;0.05），有研究指出Atopo.stipes通過葡萄糖和纖維二糖等碳水化合物提供能量會促進乙酸鹽生成。此外作為地面組優勢菌屬的Anaerococcus在厭氧環境下可以促進CH4的生成。基于KEGG數據庫對兩組中涉及產甲烷途徑基因進行顯著性分析，結果顯示地面組產甲烷過程較活躍。

由于微生物發酵床中活躍的微生物活動，使得微生物發酵床中的C02累積排放量顯著高于地面組（Plt;0.01）。王國華等研究表明發酵床豬舍C02的排放通量高于實心地面豬舍（約1.4倍），與本試驗得出相同的試驗結論。基于KEGG數據庫分析結果表明，涉及到有機物代謝中的丙酮酸代謝、三羧酸循環、乙醛酸和二羧酸代謝相關酶的功能基因在發酵床組顯著表達。丙酮酸經過脫羧生成乙酰輔酶A，再進入三羧酸循環被徹底氧化成水和C02，這從微生物學角度證實了微生物發酵床中較高的C02排放。

綜上所述，漏縫地板發酵床可以實現育肥羊養殖過程NH3和CH4減排，但會促進N20和C02的排放，未來應探究硝化、反硝化抑制劑應用于發酵床的氣體協同減排潛力，進一步推動微生物發酵床在育肥羊養殖行業的推廣應用。

4結論

（1）采用漏縫地板發酵床顯著降低育肥羊養殖過程中NH3排放。微生物發酵床中與氮轉化相關的微生物Salinicoccu.s、CorVnebacterium、Brachybacterium為優勢菌屬，活躍的氮轉化過程削弱了NH3向大氣中揮發，降低了NH3排放。

（2）漏縫地板微生物發酵床中的N20累積排放量顯著高于地面組。宏基因組分析結果表明，發酵床中編碼硝酸還原酶基因narG、亞硝酸鹽還原酶基因nirK、編碼一氧化氮還原酶基因norB、編碼一氧化二氮還原酶基因nosZ等基因的相對豐度均顯著高于地面組，活躍的硝化和反硝化過程導致了N20的大量排放。

（3）采用漏縫地板發酵床降低了育肥羊養殖過程中CH4的排放，這主要是因為發酵床良好的通風環境抑制了與CH4厭氧生成相關的C02還原、乙酸裂解和甲基營養相關的微生物活動。

（4）漏縫地板微生物的C02累積排放量要遠高于地面，KEGG數據庫碳代謝模塊注釋結果表明，發酵床中的丙酮酸代謝、三羧酸循環等過程，會使得發酵床組C02排放量顯著增加。