非人靈長類多能干細胞體外培養和誘導分化的研究進展

摘 要： 干細胞在疾病發生、細胞治療、藥物篩選和臨床應用等方面具有巨大價值。自日本科學家Shinya Yamanaka發現誘導多能干細胞以來，相關的研究立即成為研究熱點并持續至今。小鼠干細胞的研究為其它動物的相關研究開辟了道路，但在藥物篩選和疾病治療等方面有很大局限性。非人靈長類與人類具有更高的基因同源性，在生理、病理、生殖、藥理、神經等多方面與人類高度相似，是研究人類疾病和開發人用藥物的理想動物模型。非人靈長類研究也是新藥在進入臨床實驗前必須的一個環節。非人靈長類干細胞的研究在疾病的機理研究和藥物開發中越發重要，同時避免了倫理問題。本文從體外培養系統的優化和誘導分化的方法兩個方面對非人靈長類多能干細胞的相關研究進行了綜述，以期為非人靈長類干細胞進一步深入研究提供參考。

關鍵詞： 非人靈長類；多能干細胞；體外培養；誘導分化

中圖分類號：Q254

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）10-4278-12

收稿日期：2023-12-05

基金項目：國家重點研發計劃（2022YFF0710901）；江蘇高校優勢學科建設工程項目（PAPD）

作者簡介：沈可成（1999-），男，浙江紹興人，碩士， 主要從事動物生殖發育研究，E-mail： kcshen1999@163.com

*通信作者：朱家橋，主要從事動物生殖發育研究，E-mail： jqzhu1998@163.com

Research Progress on in vitro Culture and Induced Differentiation of Non-human

Primate Pluripotent Stem Cells

SHEN" Kecheng1， ZHU" Jiaqiao1，2*， LIU" Zongping1，2

（1.College of Veterinary Medicine， Yangzhou University， Yangzhou 225009， China;

2.Jiangsu

Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses，

Yangzhou 225009， China）

Abstract：" Stem cells have great value in disease occurrence， cell therapy， drug screening， and clinical applications. Since Shinya Yamanaka， a Japanese scientist， discovered induced pluripotent stem cells （iPSCs）， the relevant research has become a research hotspot and up to the present. The study of mouse stem cells has opened up a path for the related research in other animals， but there are significant limitations in drug screening and disease treatment. Non-human primates have higher genetic homology with humans and are highly similar to humans in physiology， pathology， reproduction， pharmacology， nerves， and other aspects. They are ideal animal models for studying human diseases and developing drugs for human. Research on non-human primates is also a necessary step for a new drugs before entering clinical trials. The study of non-human primate stem cells is becoming important in the mechanism of diseases and drug development， while avoiding ethical issues. This article reviews the related research on non-human primate pluripotent stem cells including optimization of in vitro culture systems and methods of inducing differentiation， aiming to provide reference for further in-depth research on non-human primate stem cells.

Key words： non-human primate; pluripotent stem cells; in vitro culture; induced differentiation

*Corresponding author：" ZHU Jiaqiao， E-mail： jqzhu1998@163.com

干細胞（stem cells，SCs）是一種具有自我更新和分化潛能的細胞，根據發育階段分為胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）和成體干細胞，依分化潛能又可分為全能干細胞、多能干細胞（pluripotent stem cells， PSCs）和專能干細胞。2006年，日本科學家Shinya Yamanaka發現了誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs），使得PSCs（主要是ESCs和iPSCs）成為了干細胞領域最主要的研究對象和研究熱點。

ESCs的分離和培養最早是由Evans和Kaufman于1981年在小鼠上完成的［1］；隨后，其它動物（如綿羊、豬和兔等）的ESCs相繼建立。1995年，威斯康辛的Thomson團隊率先從獼猴囊胚中分離出ESCs（R278.5）［2］，這是世界上第一個非人靈長類胚胎干細胞（non-human primate embryonic stem cells，NHP-ESCs）；3年后，他們又從人的早期胚胎中分離出了ESCs［3］。ESCs來源于早期胚胎的內細胞團，具有高度的增殖能力和分化潛力，能分化成體內所有細胞類型，已被廣泛應用于發育生物學、生理學和再生醫學等方面且潛能巨大，但由于倫理和政治等因素的限制，人ESCs（human embryonic stem cells，hESCs）的研究面臨諸多限制，而其他物種與人類的系統發育存在顯著差異，因此，最接近hESCs的NHP-ESCs可以有效代替hESCs進行多方面的研究。另一方面，iPSCs具有類似于ESCs的特性［4］，且iPSCs來自患者自身的細胞，理論上可以避免移植排斥反應，適合進行個性化醫療和疾病模型的構建，在一定程度上替代ESCs成為了基礎研究和未來細胞治療的新選擇，同時避免了從囊胚分離ESCs的種種限制和倫理要求，但值得注意的是iPSCs可能保留有成體細胞的遺傳記憶和突變，存在潛在的腫瘤風險，應定期進行遺傳完整性分析［5］。2008年，中國科學家成功獲得了第一株逆轉錄病毒介導的非人靈長類誘導多能干細胞（non-human primate induced pluripotent stem cells，NHP-iPSCs）［6］。目前，通過對NHP-PSCs進行培養和誘導分化已經成功構建各類疾病模型，在研究疾病發生機制、發生發展、藥物篩選中發揮著重要作用。且隨著人類細胞移植、器官再生等個性化醫療技術的興起，在進入臨床試驗前，通過NHP-PSCs進行安全性和有效性的驗證是必須的。另外NHP-PSCs對于人PSCs（human pluripotent stem cells， hPSCs）的研究及應用具有不可替代的作用。非人靈長類多能干細胞（主要是NHP-ESCs和NHP-iPSCs）的研究起初多借鑒人和小鼠的相關研究，然而物種間的巨大差異使得非人靈長類的相關研究并不如預期的順利，還需進一步優化或重新建立適合靈長類的研究體系。

1 PSCs（ESCs和iPSCs）的培養與傳代

干細胞培養的基本要求包括，細胞增殖、干細胞特性的維持、分化能力的保持、細胞系的低溫保存等。目前已建立多種培養體系，都能成功支持干細胞的附著、生長、穩定傳代，但各有優缺。一個完整的干細胞培養體系主要有幾個部分組成，包括飼養層細胞或基質、血清或血清替代物和細胞因子。合適的傳代方式也是維持干細胞穩定傳代的重要因素，因此基于實驗目的選擇合適的培養體系和傳代方式是至關重要的。

1.1 培養體系

1.1.1 飼養層細胞或基質

干細胞的傳統培養方式是利用飼養層細胞進行培養。飼養層細胞是指一些特殊細胞經有絲分裂阻斷劑或輻射（如絲裂霉素C或γ射線）處理后的單層細胞，其保持了細胞活力但不能生長增殖分化，主要作用是促進干細胞增殖、抑制干細胞分化和維持干細胞多能性。Thomson團隊就是用γ射線處理后的小鼠胚胎成纖維細胞（mouse embryonic fibroblast，MEF）作為飼養層建立了第一個NHP-ESCs，其傳代超過一年仍然保持正常XY核型且未分化［2］。絲裂霉素C處理的小鼠成纖維細胞系（STO）也可以作為飼養層成功建立食蟹猴的ESCs［7］。至今，飼養層細胞培養仍然是最常用的PSCs培養方案且被認為是維持干細胞特性的最佳培養方案之一。

飼養層細胞主要通過分泌各種細胞因子來維持NHP-ESCs的生長；但是不同飼養層細胞所分泌細胞因子的含量和種類也有所不同［8-9］，進而影響NHP-ESCs的生長和特性的維持。例如小鼠飼養層細胞和人飼養層細胞都產生激活素A，且前者產量多于后者；但是小鼠飼養層細胞不具備分泌FGF-2的能力，而人飼養層細胞則分泌大量FGF-2。使用異種飼養層細胞培養干細胞時也存在一定的風險。有文獻報道，用MEF和動物源性血清替代物做飼養層細胞來培養hESCs時，檢測到一種具有免疫原性的非人唾液酸Neu5GC，這種異源性的產物可能會使得ESCs用于臨床時產生免疫反應，進而導致細胞死亡［10］。在NHP-ESCs的培養中，還未見此類報道。

由于飼養層細胞未被完全定義，異源飼養層細胞還有潛在風險，除了使用同物種飼養層細胞外，還開發出一種無飼養層細胞培養體系，使用基質膠代替飼養層細胞，但需加入多種細胞因子來維持干細胞的生長，這也是干細胞培養的一種理想方法。各種不同類型的基質被開發出來，例如Matrigel基質膠、Geltrex基質膠、黏連蛋白、可溶性膠原蛋白、殼聚糖和水凝膠等（表1）。與此同時，由于生物類基質有引入異源物質的風險，需要謹慎應用于人醫臨床移植，因此代替飼養層細胞的人工合成基質也已被開發出來，可用于未分化干細胞的增殖培養［11］，代替飼養層細胞的理想基質應當允許干細胞的長期培養和增殖，并能維持干細胞的干性和遺傳完整性；若能同時滿足大規模制造的要求，將加速干細胞的臨床應用。使用重組DNA技術制備非動物源的基質蛋白，或對人工合成基質進行優化，將有可能滿足這些要求。

1.1.2 血清或血清替代物

胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）是細胞培養中最常使用的血清之一，但被認為是NHP-ESCs培養中的異源物質且未被完全識別定義，會帶來潛在風險。為了減少這種風險，使用人源或猴源的血清替換FBS來培養NHP-ESCs，但是研究發現，hESCs在人血清中傳代10代之后的分化率顯著升高［18］。于是，血清替代物的研究應運而生。Knockout Serum Replacement（KSR）于1998年被開發出來用于替代血清［19］，其可以保持小鼠ES細胞處于未分化狀態；在之后的NHP-ESCs和NHP-iPSCs的飼養層細胞培養體系或無飼養層細胞培養體系中其同樣可以作為血清替代物并沿用至今［6，20］。但是KSR僅僅是血清替代物，并沒有徹底排除動物源成分。也有研究者嘗試用完全無血清的培養基來培養猴ESCs，這種培養基含有BSA、IGF-1、TGF-a、bFGF、酸性成纖維細胞生長因子（acidic fibroblast growth factor，aFGF）、雌二醇和孕酮等；但是，在此之前，必須先將猴ESCs在含血清培養基中培養48h后，才能在這種無血清培養基中維持猴ESCs的增殖和不分化特性［21］。血清的完全替代物和動物源成分的徹底排除可能是未來干細胞應用于臨床之前需要解決的問題之一。

1.1.3 細胞因子

無論是在飼養層細胞培養體系還是無飼養層細胞培養體系中，細胞因子都是干細胞維持多能性以及大規模體外增殖培養的必要條件之一，在飼養層細胞培養體系中，細胞因子多由飼養層細胞自身分泌，根據培養的干細胞類型，無需或僅需少量添加額外的細胞因子。在無飼養層細胞培養體系中，包括使用條件培養基（conditioned medium）和化學定義培養基（chemical-defined medium）兩種方法。

條件培養基是指將培養過飼養層細胞的培養基除去飼養層細胞，取其上清液，其中含有大量來源于飼養層細胞的蛋白和細胞因子，可直接用于培養其它細胞或作為其它培養基的添加成分［22］。但是，由于條件培養基中來源于飼養層細胞的蛋白和細胞因子維系干細胞增殖和未分化狀態的機制是十分復雜的，尚不完全清楚;且條件培養基首先依賴于飼養層細胞的培養，因此會出現不穩定和可重復性不高的情況，所以仍需要對條件培養基進行深入研究和優化。

化學定義培養基是在條件培養基的基礎上進一步發展而來的。比條件培養體系具有更加明確的化學屬性，其中的各個組分都盡可能被定義或識別，使用基質膠和血清替代物來代替飼養層細胞和血清，并加入多種細胞因子，以確保減少異源性物質以此來減少干細胞臨床應用時的風險，同時提高培養系統的重復性，為實現干細胞的大規模培養提供可能。研究發現，靈長類干細胞的化學定義培養基明顯比其它細胞復雜許多，通常需要添加不同種類的細胞因子，來確保其未分化狀態。早在1988年，就有學者發現白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）可以代替飼養層細胞抑制小鼠ESCs的分化［23］。LIF是白細胞介素-6 細胞因子家族中多效性最強的成員，可以激活JAK/STAT 通路、PI3K/AKT 通路和MARK通路，在不同細胞類型中，LIF具有拮抗作用，在小鼠ESC中通常認為LIF激活JAK/STAT3信號以此維持ESCs自我更新和存活［24-25］。但是，這并不適合于靈長類ESCs的培養，因為鼠LIF無法結合人LIF受體，即便使用人LIF時，hESCs也無法在無飼養層細胞條件下維持未分化狀態［19］，NHP-ESCs也是如此［2］。這說明靈長類ESCs自我更新的要求與小鼠ESCs明顯不同。通過對靈長類ESCs自我更新機制的研究發現，未分化的ES細胞中FGF、Wnt和TGF-β信號通路處于激活狀態［26］。雖然單獨使用LIF無法維持靈長類ESCs的未分化狀態；但是LIF和FGF-2的同時使用就能使hESCs保持未分化狀態并維持數代，且同樣適用于NHP-ESCs，因為人ESC多能性的維持依賴于FGF激活的MAPK/ERK和PI3K/AKT通路［6，25，27］，缺乏FGF4或 ERK信號轉導的ESC具有嚴重的神經和中胚層分化傾向［28］。進一步研究發現，在低濃度bFGF條件下，使用特異性抑制劑抑制GSK-3功能以此激活Wnt通路就能維持小鼠和hESCs的未分化狀態［29-30］。之后，TGF-β也被證實可促進ESCs維持未分化狀態［31-32］。

隨之而來的是更多的細胞因子被同時使用。在培養基中添加LIF、FGF、TGF-β、IWR-1和CHIR99021等多種組合的細胞因子開啟不同的信號通路組合，同時用血清替代物和Matrigel等基質代替FBS和飼養層細胞，這種成分明確的無血清無飼養層培養系統成功實現了hESCs和多種來源的NHP-iPSCs的長期未分化培養，而且細胞表現正常的核型和多能性［32-34］。這種添加多細胞因子的無血清無飼養層系統對于NHP-ESCs和NHP-iPSCs的長期培養仍待研究［35］。

1.2 傳代方式

NHP-PSCs的傳代方式，通常為集落的酶消化法或機械分割法。使用酶消化法時，NHP-PSCs在飼養層細胞上以集落培養，以細胞團方式進行傳代，因此很難精確控制NHP-PSCs集落的解離，傳代效率較低，同時酶的處理可能會影響NHP-PSCs的狀態，繼而干擾后續試驗。而機械分割法是人工精確篩選所需細胞，剔除狀態異常或已分化的細胞，傳代效果優于酶消化法，但是NHP-PSCs的質量和傳代效率受限于操作人員的實驗技能和熟練程度，重復性較差。

目前，已經有NHP-PSCs單細胞傳代方法的報道。通過研究hPSCs細胞團塊解離后的凋亡途徑發現，ROCK抑制劑Y-27632不僅可以減少細胞傳代過程中的應激和凋亡風險，而且可以促進干細胞的生長和增殖［36］，所以被廣泛應用于人和NHP-PSCs的單細胞傳代培養［37-38］。另一種ROCK抑制劑thiazovivin能更好地維持ESCs的未分化狀態，并提高單細胞傳代效率［39］，并且在NHP-PSCs復蘇時加入ROCK抑制劑也可以提升細胞的存活率。而這種抑制劑對干細胞后續分化的影響，尚不明確。因此，仍需要進一步研究開發一種簡便可復制的NHP-PSCs傳代方式。

1.3 培養體系和傳代方式的選擇

根據干細胞培養目的的不同，決定選擇哪種培養體系和傳代方式并進行適當調整。例如，在研究胚胎的早期發育時，飼養層細胞培養體系既能保證細胞的增殖又能維持胚胎細胞的多向分化潛能。當干細胞被用于動物臨床移植時，無外源性物質和低免疫原性是對培養體系的要求，此時干細胞的增殖能力往往會下降。而當干細胞被用于制藥時，穩定傳代和易于大規模生產可能是選擇培養體系時的標準之一。以及，若需要對NHP-PSCs進行轉染編輯時，單細胞狀態下的NHP-PSCs往往比團塊集落狀態的NHP-PSCs擁有更高的轉染效率。因此，最理想的干細胞培養體系應當是在滿足培養目的的前提下，使用“三無”（無異源飼養層細胞、無異源血清和無動物源性）的培養系統。

從飼養層細胞培養，到使用條件培養基的無飼養層細胞培養體系，最終發展為完全定義的化學定義培養基，干細胞的培養方式在不停地發展和優化，每種培養方式都有其優缺點。然而令人遺憾的是，在目前建立的任何一種培養體系中，NHP-PSCs依舊無法通過四倍體補償試驗這一檢驗干細胞多能性的黃金標準［40］，簡而言之，將NHP-PSCs注入四倍體囊胚中，無法獲得一個完整的個體，這也就意味著，現有的培養體系無法真正保全NHP-PSCs的多能性。繼續深入分析NHP-PSCs的自我更新機制，發現新的關鍵通路，或許是突破四倍體補償試驗的關鍵，也是優化NHP-PSCs培養體系的方向之一。

2 NHP-PSCs誘導分化

理論上，NHP-PSCs可分化為任意細胞，用于各種退行性疾病的干細胞治療或藥物開發［41-42］。如何在體外將NHP-PSCs定向誘導分化為其它細胞一直是研究前沿和熱點之一。目前主要的誘導方法有擬胚體分化法、分步誘導法、轉基因誘導法、基質細胞共培養法等。擬胚體分化法是較為常用的方法，先用外源生長因子在無飼養層細胞培養系統中使NHP-PSCs形成擬胚體（embryoid body，EB），再用不同的措施誘導分化為特定的細胞。分步誘導法首先通過添加特定的細胞因子誘導干細胞分化成三個主要的胚層細胞：內胚層、中胚層或外胚層，在成功分化成特定胚層細胞后，繼續添加更加特定的信號分子和細胞因子，以進一步誘導這些胚層細胞向更特化的細胞類型分化。轉基因誘導法通過過表達特定基因使NHP-PSCs定向分化為目的細胞，但是該方法較為繁瑣，且存在整合外源基因的風險?；|細胞共培養法是將NHP-PSCs與其它成熟細胞一起培養，通過成熟細胞分泌的生長因子來誘導NHP-PSCs向目標細胞分化，該方法比擬胚體分化法更為高效。目前已使用上述方法將干細胞成功誘導分化為神經細胞、造血細胞、脂肪細胞、角質形成細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞和胰島素分泌細胞等［43-44］。

2.1 NHP-PSCs向心血管系統細胞的誘導分化

非人靈長類動物心血管系統與人類心血管系統非常類似，且能自然地發展成多種心血管疾?。?5］；因此，如何將NHP-PSCs誘導分化為心血管系統的細胞一直是研究熱點。目前，借鑒hPSCs誘導分化經驗［46-48］，已可將NHP-PSCs誘導分化為多種心血管系統的細胞，例如：血管母細胞、血管內皮細胞、造血細胞和心肌細胞等［49-51］（表2）。

2.2 NHP-PSCs向神經細胞的誘導分化

NHP-PSCs也是研究神經細胞誘導分化的理想模型。1995年Thomson團隊將ES細胞注射到免疫缺陷小鼠體內，在形成的畸胎瘤中出現了類似神經管的結構［2］，這是ES細胞在體內自然分化的結果。現在，已有多種方法能將NHP-PSCs在體外定向誘導分化為多種神經細胞［37，52-61］（表3）。

2.3 NHP-PSCs向視網膜組織細胞的誘導分化

目前，視網膜色素上皮移植已達到人醫臨床試驗階段，也有報道稱已經將視網膜色素上皮細胞及其組織的移植用于人類眼部疾病的治療［62］。但是，視網膜是一個神經元復合體，由各種不同功能的細胞組成，其中的視網膜神經節細胞和感光細胞等視網膜神經元的研究仍然集中在動物模型上［63］。

參考端腦神經細胞的誘導方法，小鼠ESCs和hESCs可以成功分化為視網膜細胞［64］；在長達90 d的培養過程中，ESCs先后被誘導分化為視網膜祖細胞、色素細胞和視網膜色素上皮細胞［65］。使用端腦神經細胞的誘導方案誘導30 d后，再用維甲酸（retinoic acid）和?；撬幔╰aurine）進一步誘導至90 d，能使猴ESCs誘導分化為兩類感光細胞（視桿細胞和視錐細胞）［66］。與以前的誘導方法相比，這種方法的誘導效率更高，且不含動物源性成分；但是，過長的培養時間是否會影響后續試驗和未來臨床應用需要進一步驗證。

2.4 NHP-PSCs向生殖細胞的誘導分化

在過去的十年里，體外配子生成（in vitro gametogenesis， IVG）的研究取得了巨大的進步，這為生殖醫學和動物繁育科學開辟了新的道路。嚙齒類種系發育已經在體外完全重建，即將PSCs分別誘導分化為卵母細胞和精子，成功受精后獲得健康的后代［67-69］。這是由于小鼠原始生殖細胞（primordial germ cells，PGCs）分化的動力學、信號轉導、遺傳和表觀遺傳的機制已較為清楚［70-72］ ；但是靈長類和小鼠的生殖細胞起源和分化仍有很大不同，將NHP-PSCs誘導為生殖細胞的研究目前已經取得了一些進展。

體外配子生成的過程大致分為兩個階段，首先是原始生殖細胞樣細胞（primordial germ cell-like cell， PGCLC）的誘導分化，其次是卵子和精子的誘導分化。有團隊先將人的iPSC分化為初期中胚層樣細胞（incipient mesoderm-like cells， iMeLCs），再間接誘導為PGCLC［73-74］。研究表明，人PSC無法直接誘導為PGCLC是由于相較于小鼠ESC，靈長類PSC處于一種更加“成熟”（primed）的狀態［75-76］，有較強的自主分化性，于是Hanna團隊構建出相對“幼稚”（naive）的胚胎干細胞并成功誘導為PGCLC。與之類似的，使用含有BMP4、LIF、SCF、EGF和Y-27632的直接分化培養基誘導猴PSC進行分化，細胞在第6天開始表達PGC標志分子SOX17、TFAP2C和BLIMP1［77］。而另一種誘導猴PSC分化為PGCLC的直接方法是，過表達兩種PGC特異性轉錄因子（BLIMP1和SOX17）后再聯合用4種細胞因子（BMP4、SCF、EGF和LIF）進行誘導，但是這種方法的誘導效率不高［78-79］。最近的一項研究比較了來源于不同培養條件的猴PSC誘導分化為PGCLC的差異；結果顯示，在相同的誘導條件下，來源于無飼養層培養體系的猴PSC不能分化為PGCLC，但是來源于飼養層培養體系的猴PSC則可以，而且在飼養層培養體系中添加WNT抑制劑（IWR1）可以顯著提高誘導效率；IWR1通過泛素依賴性蛋白質降解相關基因的上調使猴PSC進入允許狀態（permissive state），以利于向PGCLC的誘導分化［79］。另一研究組進一步優化的結果顯示，同時抑制WNT通路和視黃酸信號通路可以阻止猴ESC向中胚層和神經的分化，以此來進一步提高猴ESC誘導分化為PGCLC的效率［80］。

另一種誘導猴PSC分化為PGCLC的方法是兩步間接誘導法。猴PSC在LIF、CHIR99021、PD0325901、SP600125和SB203580的共同作用下先轉變為原始態（naive）；然后用PGCLC分化培養基進一步誘導為PGCLC，此分化培養基比直接分化培養基多了BMP2［81-82］；誘導2 d后，細胞開始表達PGC標志分子，如PRDM1、TFAP2C、KIT、DDX4和SOX17等［74，83-84］。

體外配子生產的第二階段是向精子和卵子的進一步誘導分化。猴PGCLC的細胞表型和分子特征均與PGC相近；將其移植到體內或與體細胞共培養時表現出生殖細胞的部分特性，可以重啟表觀遺傳重編程，但是沒有完全誘導為單倍體的精子或卵子［79-80，85］。但是也有報道稱，直接使用人的iPSCs誘導為單倍體生精細胞的方法［86］，猴PSC可以直接被誘導為單倍體圓形精細胞，采用胞質內單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）方法將其注射到卵子中后可以發育到囊胚階段［87］。然而，這一研究中對誘導分化來的圓形精細胞與體內精子的比較似乎不夠，可能仍需要進一步的驗證和研究。

2.5 NHP-PSCs向其他組織細胞的誘導分化

參考小鼠和人PSC向各類細胞分化方法［88-95］，NHP-PSCs也可以分化為除上述細胞類型以外其他細胞，例如肝細胞樣細胞、胰島素分泌細胞、肌源性祖細胞等（表4） ，可用于細胞治療或模型構建。

3 小結與展望

非人靈長類動物（猴）在藥代動力學和毒理學篩選等多方面比嚙齒動物更接近于人類，且不攜帶對人類有害的內源性病毒，表現出更少的人畜共患病［104-105］。NHP-PSCs的研究更有利于相關疾病的診斷和治療以及藥物開發。雖然NHP-PSCs的研究起步較晚，而且多參考小鼠PSCs和hPSCs的研究，但作為目前的干細胞研究熱點之一，已進入高速發展時期。NHP-PSCs的誘導不僅與細胞因子有關，還與NHP-PSCs的培養體系和培養質量有關。由于干細胞種系和批次的不同，可能導致相同的誘導方法產生不同誘導結果和誘導效率，培養和誘導時間過長也會因為人為因素干擾誘導效率。對誘導結果的判斷和驗證，多是在誘導結束后進行，使得對結果產生爭議。因此，各種新的培養體系、誘導方法和誘導結果的判定方法也在逐步產生，例如水凝膠、基質膠，以及人工智能檢測誘導過程等［106］。這些新技術和新方法多在小鼠和人的細胞上建立，當其應用于非人靈長類動物細胞時，將會加快干細胞相關產品的產生和臨床的應用。盡管仍有許多需要克服的困難和挑戰，但是NHP-PSCs的相關研究令人充滿期待。

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（編輯 白永平）