靶向山羊痘病毒GPCR基因SYBR Green熒光定量PCR檢測方法的建立

摘 要： 基于山羊痘病毒（goat pox virus， GTPV）的基因組序列，建立靶向G蛋白偶聯趨化因子受體（G-protein-coupled chemokine receptor，GPCR）基因的熒光定量PCR檢測方法。基于GTPV全基因序列設計6對qPCR引物，并進行特異性和靈敏性的篩選和檢測，最終篩選得到1對高特異性和靈敏性的熒光定量PCR引物；根據GTPV/AV41疫苗株GPCR基因序列，設計普通PCR引物，擴增GPCR基因，構建真核表達載體，建立熒光定量PCR標準曲線。結果表明：篩選得到1對靶向于GPCR基因的特異性qPCR引物；構建pCAGGS-GPCR真核表達質粒，建立標準曲線y=-3.5289x+49.07，線性相關系數R2=0.997 2，擴增效率為92.7%；驗證性試驗結果顯示，該引物最低檢測限為2.0拷貝·μL-1，各批次內與批次間重復性結果的變異系數均小于2%，表明其具有特異性強、重復性好和靈敏度高的優點。建立了靶向山羊痘病毒GPCR基因的qPCR檢測方法，為防控山羊痘提供了高效的檢測手段。

關鍵詞： 山羊痘病毒；GPCR；熒光定量PCR

中圖分類號：S852.654

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）10-4779-06

收稿日期：2023-12-08

基金項目：國家自然科學基金（32302850）；甘肅省科技計劃資助（22JR5RA035）；甘肅省科技重大專項（22ZD6NA001）；中國農業科學院蘭州獸醫研究所基本科研業務費（1610312021008）

作者簡介：張紅強（1993-），男，甘肅漳縣人，碩士生，主要從事草食動物病毒病感染致病機制研究，E-mail：2306590936@qq.com

*通信作者：樊江峰，主要從事家畜生殖生理、動物胚胎工程研究，E-mail：fanjf@gsau.edu.cn；任善會，主要從事草食動物病毒病致病機制相關研究，E-mail：renshanhui@caas.cn

The Establishment of a SYBR Green Fluorescence Quantitative PCR Detection Method by

Targeting the G-protein Coupled Chemokine Receptor Gene of Goat Poxvirus

ZHANG Hongqiang1， REN Shanhui2*， YAO Wei3， GONG Zhenli2， YANG Xue1， MA Chunling2，

YOU Ting1， ZHANG Yuzhe1， LIU Minyi1， QIAN Wenjie1， LI Liuyang1， YU Zhipeng1， SUN Yuefeng2， CHEN Haotai2， FAN Jiangfeng1*

（1. College of Veterinary Medicine， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China;

2. Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology， Lanzhou Veterinary Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Scicences， Lanzhou 730046， China;

3. Wanzhou Center for Animal Husbandry Industry Development， Chongqing 404100， China）

Abstract：" Based on the genomic sequence of the goat pox virus （GTPV）， we have established a fluorescence quantitative PCR method targeting the G-protein-coupled chemokine receptor （GPCR） gene. Six pairs of specific qPCR primers were designed based on the whole genomic sequence of GTPV. The specificity and sensitivity of these six qPCR primers were screened and detected. A pair of qPCR primers with high specificity and sensitivity was finally screened and obtained. According to the GPCR gene sequence of the GTPV AV41 vaccine strain， we designed an ordinary PCR primer pair to amplify the GPCR gene to construct the eukaryotic expression vector， which was used to establish the standard curve. Results showed that A pair of specific qPCR primers targeting the GPCR gene was obtained. The eukaryotic expression plasmid named pCAGGS-GPCR was constructed. The standard curve of y=-3.5289x+49.07 was established， whose linear correlation coefficient is R2=0.997 2 and amplification efficiency is 92.7%. The results of the replication experiment suggested that the lowest detective limitation of this primer was 2.0 copies·μL-1， and the coefficient variation of the reproducibility results within and between batches was 2%， indicating the advantages of reasonable specificity， repeatability， and sensitivity. We have successfully established a specific fluorescence quantitative PCR method targeting the GPCR gene of GTPV， which provides adequate detecting support for the veterinary clinical diagnosis and the prevention and control of goat poxvirus.

Key words： goat pox virus; GPCR; fluorescence quantitative PCR

*Corresponding authors：" FAN Jiangfeng， E-mail： fanjf@gsau.edu.cn;REN Shanhui， E-mail： renshanhui@caas.cn

羊痘（Capripox）是影響山羊和綿羊養殖的二類動物疫病，包括山羊痘（goat pox）和綿羊痘（sheep pox）［1］。山羊痘是由山羊痘病毒（goat pox virus， GTPV）傳播感染引起的一種高度致死性的惡性病毒性疫病［2］。

GTPV基因組與綿羊痘病毒（SPPV）和牛結節性皮膚病病毒（lump skin disease virus， LSDV）的基因組序列相似性可達96%以上［3］，一般普通的分子生物學檢查很難區分，常規的檢測方法誤診率高，檢測速度慢、以及對樣本要求極高，尤其難以對隱性帶毒羊及早期發病動物作出有效的診斷，易于造成疫病的流行［4］。王憲軍等［5］建立的羊口瘡病毒、小反芻獸疫病毒和羊痘病毒三重TaqMan 熒光定量RT-PCR方法，該方法對GTPV的最低檢測限為6.68拷貝·μL-1；岳帥等［6］建立了羊傳染性膿皰病毒及羊痘病毒雙重熒光PCR方法，對GTPV的最低檢測限為10拷貝·μL-1。為了能夠更加準確、高效和快速的檢測出GTPV，本研究基于GenBank數據庫中的GTPV毒株全基因組序列，綜合qPCR引物設計的各項原則，最終篩選到一對靶向于GPCR基因熒光定量PCR引物（F：ACCAACACTACTTGTGCTATGA；R：GTATGGCATTAAGATTTGTCAACCT）。且GPCR基因測序和系統發育研究，證明可以用GPCR基因來區分LSDV、GTPV和SPPV。另外GPCR基因在山羊痘病毒中高度保守，可以檢測不同變異株［7］。

1 材料與方法

1.1 主要病毒和試劑

GTPV疫苗毒株（AV41毒株）、GTPV野毒株（GTPV-WT）、羊口瘡病毒（OrfV）、牛結節性皮膚病毒（LSDV）、改造的牛痘病病毒（MVA）和綿羊痘病毒（SPPV）由中國農業科學院蘭州獸醫研究所草食動物病毒病創新團隊分離與保存。

TIANamp Virus DNA/RNA Kit病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒購自天跟生化科技有限公司（DP315）；Hieff? qPCR SYBR Green Master Mix （No Rox） qPCR購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司（貨號：11201ES03）；Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase購自南京諾唯贊生物科技有限公司（貨號：P505d1）；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自OMEGA（D2500-02）。

1.2 qPCR引物的設計與合成

基于GTPV/AV41毒株全基因序列（GenBank登錄號：MH381810），借助引物設計網站（IDT）設計6對熒光定量PCR引物。與GenBank數據庫中其它代表性GTPV毒株全基因序列比對分析，結合試驗對引物的要求，既特異性和靈敏性等特點，選擇了最符合要求的2號qPCR引物對（#2）進行后續試驗（表1）。并且設計了擴增qPCR引物靶向基因（GPCR）的普通PCR引物7（表2）。構建標準重組質粒。

1.3 GPCR真核表達質粒的構建

以GTPVAV41 cDNA為模板進行普通PCR擴增，反應體系：GTPV（AV41）cDNA 2 μL，上下游引物各2 μL，2×phanta Max Buffer 25 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA 1 μL，dNTP Mix 1 μL，ddH2O 17 μL，總反應體積50 μL。反應條件：95℃預變性3 min；95℃變性15 s，58℃退火15 s，72 ℃延伸1.5 min，34個循環；72℃延伸5 min。PCR產物經1％瓊脂糖凝膠電泳，將與預期大小符合的條帶，按照膠回收試劑盒（omega gel extration kit）操作步驟回收，產物置于-20 ℃保存備用。

采用同源重組的方法將雙酶切空載體pCAGGS與插入片段連接，推薦插入片段與空載比例為3∶1，連接體系10 μL。各組分加入體積：5×CE Multis Buffer 2 μL，Exnase Multis 1 μL，目的片段3 μL，空載vector 1 μL，ddH2O 3 μL，PCR反應條件為37 ℃ 持續1 h。轉化至DH5α感受態細胞中，搖床培養1 h，離心濃縮菌液后涂布于含氨芐的瓊脂培養基上，37 ℃恒溫培養箱培養12 h后挑取單個菌落，接至液體培養基（含氨芐）置于37 ℃搖床培養12 h。提取質粒并測量濃度。送測符合要求的質粒，正確質粒粒命名為pCAGGS-GTPV-GPCR。標準陽性質粒構建完成。根據文獻中的公式［8］：質粒拷貝數（拷貝·μL-1）=（質粒濃度×10-9×稀釋倍數×6.02×1023）/（660道爾頓/堿基×堿基數）。將質粒濃度轉化為拷貝數。

1.4 熒光定量PCR方法的建立及條件的優化

多次試驗確定體系中的模板和引物使用量：cDNA加入量分別為0.25、0.50、0.75、1.00 μL，引物使用量分別為0.2、0.4、0.6、0.8 μL。依次進行優化處理，確定最終qPCR體系：cDNA 0.5 μL，上下游引物各0.4 μL，SYBR GreenⅡ PCR mix 5 μL，ddH2O 3.7 μL，并設計退火溫度梯度（分別是56、58、60和62 ℃），qPCR最佳反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性10 s，58 ℃退火15 s，40個循環，熔解曲線為95 ℃預變性15 s，58℃退火1 min。退火延伸后收集熒光信號。

1.5 熒光定量PCR標準曲線的繪制

將已構建的重組質粒進行連續的10倍梯度稀釋，選擇的拷貝數為2.0×101～2.0×1011。 拷貝數每微升之間的質粒為模板，ddH2O為模板作為陰性對照，進行qPCR，每個拷貝數重復3次。以3個重復試驗組Ct值平均值為縱坐標，以質粒標準品拷貝數對數值為橫坐標，繪制標準曲線并計算相關系數。

1.6 熒光定量PCR引物特異性試驗

利用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒提取綿羊痘（SPPV）、羊口瘡病毒（OrfV）、牛結節皮膚病病毒（LSDV）和改造痘苗病毒（MVA）基因組DNA。以2×1011拷貝·μL-1標準陽性質粒、SPPV、OrfV、LSDV、MVA DNA為模板，進行qPCR，驗證該方法的特異性。對照組模板為ddH2O。

1.7 熒光定量PCR敏感性試驗

將構建的pCAGGS-GTPV-GPCR標準品陽性質粒進行連續的10倍梯度稀釋，2.0×10-0～2.0×10-8拷貝·μL-1作為模板，進行qPCR，每個濃度重復3次，ddH2O為陰性對照。檢測qPCR的敏感性。

1.8 熒光定量PCR重復性試驗

將陽性重組質粒稀釋為2.0×108、2.0×107和2.0×106拷貝·μL-1。組內檢測以2.0×108、2.0×107和2.0×106拷貝·μL-1作為模板，各濃度重復3次。以2.0×108、2.0×107和2.0×106拷貝·μL-1在不同組次稀釋的樣品進行組間檢測，各濃度重復3次。計算變異系數（CV）評價方法重復性和穩定性。

1.9 臨床樣品的檢測

隨機選取20份由中國農業科學院蘭州獸醫研究所草食動物病毒病創新團隊實驗室采集的疑似GTPV陽性樣品，其中皮膚痘疹樣品10份、EDTA抗凝血清樣品6份和鼻咽拭子樣品4份，利用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒提取該30份臨床樣品基因組DNA并測量其濃度大小，利用已優化建立的qPCR方法檢測，同時采用《綿羊痘和山羊痘熒光PCR檢測方法》（T/SAIA 005—2021）推薦通用GTPV熒光PCR檢測方法作為對照來評估建立的檢測方法。

2 結 果

2.1 重組質粒標準品的構建

使用本研究中設計的普通PCR引物（GPCR-F/R）對GPCR基因進行PCR擴增后，GPCR基因與雙酶切的pCAGGS空載體同源重組連接，構建重組質粒標準品（2.0×1011拷貝·μL-1）。

2.2 熒光定量PCR標準曲線建立

熒光定量PCR標準曲線及結果顯示，在濃度2.0×1010～2.0×102拷貝·μL-1標準品平均Ct值呈現出良好的線性關系，線性相關系數R2 = 0.997 2，標準曲線y=-3.5289x+49.07，而且溶解曲線峰單一，溫度為77.5 ℃±1.5 ℃，證明引物具有良好的特異性，根據公式E=10-1/斜率-1計算，計算得出擴增效率為92.7%（圖1）。

2.3 熒光定量PCR引物特異性試驗

結果顯示，該方法對GTPV陽性標準品有特異性的擴增曲線，而對于羊口瘡病毒、綿羊痘病毒、牛結節性皮膚病病毒、小反芻獸疫病毒和改造后的牛痘病病毒基因組和陰性對照無擴增信號（圖2）。

2.4 熒光定量PCR引物敏感性試驗

熒光定量PCR擴增結果顯示（圖3），重組質粒標準品均有典型的擴增曲線，所有梯度均可檢測到熒光信號，并且最低有效檢測量為2.0×100 拷貝·μL-1，表明建立的方法敏感性高。

2.5 熒光定量PCR引物重復性試驗

以2.0×108、2.0×107、2.0×106拷貝·μL-1及弱陽性樣品（2.0×100拷貝·μL-1）在不同批次稀釋的樣品進行3次重復檢測，結果所示，批次內與批次間重復性試驗結果的變異系數均小于2%。

2.6 臨床樣品檢測

建立的熒光定量PCR檢出率平均為80%。相比下，推薦通用方法檢出率平均為70%。兩種檢測方法結果不一致樣品有2份，經測序鑒定為GTPV陽性樣品，以上結果表明，本研究建立的檢測方法特異性強、敏感性高，適用于GTP的臨床樣品鑒別檢測。

3 討 論

本研究所設計的qPCR引物靶向的GTPV GPCR基因為GTPV基因組中非常保守的序列，該方法可以準確的檢測出GTPV其他變異毒株的感染。結果表明，所建立的方法與這4種病毒不發生交叉反應，且與GTPV親緣性較高的SPPV和LSDV三者之間無交叉反應，能夠特異性地區分SPPV和LSDV。

常規檢測GTPV的方法如病毒中和試驗，普通PCR，多重PCR等靈敏度低，耗費大量時間，檢出率低，不能滿足臨床上診斷山羊痘病毒的要求［9-11］。該病在我國及周邊國家和地區流行［12］，其易感動物的肉產品及動物源性產品特別是乳產品出口會受到世界各貿易國的嚴格限制，對當地畜牧養殖業發展影響巨大［13］，嚴重制約全球以山羊為主的畜牧業經濟發展［14］。本研究建立的熒光定量PCR檢測方法敏感性試驗結果顯示，該qPCR引物最低檢測限為2.0拷貝·μL-1。該引物能夠高效地擴增GTPV基因組，同時臨床樣品重復性試驗中批次內與批次間重復性結果的變異系數均小于2%。

4 結 論

本研究中，根據GTPV全基因組序列，與GTPV疫苗毒株（AV41毒株）、GTPV野毒株（GTPV-WT）、羊口瘡病毒（OrfV）、牛結節性皮膚病毒（LSDV）、改造的牛痘病毒（MVA）和綿羊痘病毒（SPPV）進行序列比對，參考qPCR引物設計原則優化評估，最終建立了一種特異性靶向GTPV基因組中GPCR基因的熒光定量PCR檢測方法，該方法具有靈敏性高、重復性好和特異性強等優點，為山羊痘疫情的早期診斷及疫情防控提供一種有效的檢測技術手段。

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（編輯 白永平）