基于簡化基因組測序（Super-GBS）的子午嶺黑山羊保種群遺傳結構評估

摘 要： 旨在分析子午嶺黑山羊的群體遺傳多樣性和親緣關系以及家系結構，為子午嶺黑山羊的保護和利用提供依據。本研究通過簡化基因組測序（super-genotyping by sequencing，Super-GBS）技術對99只（10公/89母）成年子午嶺黑山羊進行全基因組SNP檢測。利用Plink軟件計算觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、多態信息含量（PIC）、核苷酸多樣性（Pi）、有效等位基因數（Ne）及次要等位基因頻率（MAF）等6項遺傳多樣性指標；GCTA軟件進行主成分分析及基因組親緣關系G矩陣構建；Plink軟件構建IBS遺傳距離矩陣，R語言繪制熱圖；PHYLP構建系統發育樹；detect RUNS工具檢測ROH。結果表明，99只子午嶺黑山羊個體共檢測到996 042個SNPs。子午嶺黑山羊群體的PIC、Pi、Ne及MAF值分別是0.161、0.193、1.295、0.130，且Ho（0.167）低于He（0.192），說明子午嶺黑山羊群體遺傳多樣性較低。G矩陣和IBS遺傳距離結果均表明子午嶺黑山羊群體間大部分個體間親緣關系較遠。主成分分析結果揭示子午嶺黑山羊群體內部不存在明顯分化，系統發育樹結果說明子午嶺黑山羊群體公羊可大致分為6個家系，所有家系公羊數量較少。子午嶺黑山羊群體的近交系數FROH為0.049 6，說明子午嶺黑山羊群體內部近交程度相對較低。綜上所述，子午嶺黑山羊群體遺傳多樣性較低，大部分個體間親緣關系較遠，群體內近交程度較低，后期應注意后代的選育，避免血統流失。

關鍵詞： 子午嶺黑山羊；簡化基因組測序；群體結構；遺傳多樣性；家系結構；親緣關系

中圖分類號：S827.2

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）10-4334-12

收稿日期：2024-03-25

基金項目：甘肅省自然基金重點項目（22JR5RA759）；甘肅省重點人才項目（2023RCXM67）

作者簡介：茍想珍（1978-），女，甘肅通渭人，碩士生，正高級畜牧師，主要從事羊遺傳育種與繁殖的研究，E-mail： gxz1621@sina.com

*通信作者：王 珂，主要從事動物遺傳育種與繁殖，E-mail：592374483@qq.com；馬友記，主要從事羊生產研究，E-mail：yjma@gsau.edu.cn

Evaluation of the Population Structure of the Ziwuling Black Goat Based on Super-GBS

GOU" Xiangzhen1， YANG" Junxiang1， ZHAO" Zihui1， FENG" Lingxia1， CHEN" Wanhui1， LI" Yujie2，

ZHANG" Zhongyu2， MA" Keyan3， JIANG" Dongping4， CHANG" Rong5， WEN" Yazhou6， WANG" Ke1*， MA

Youji3*

（1.Key Laboratory of Livestock and Poultry Resources （Goat） Evaluation and Utilization of Ministry

of Agriculture and Rural Affairs， Animal Husbandry and Veterinary Research Institute of Gansu， Pingliang

744000，" China;

2.Station of Huachi County Animal Science and Veterinary， Qingyang 745000，

China;

3.College of Animal Science and Technology， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070，

China;

4.Pingchuan District Animal Husbandry and Veterinary Technical Service Center， Baiyin 730900，

China;

5.Animal Health Supervision Institute of Ganzhou District， Zhangye 734000，" China;

6.

Gansu Sheep Breeding Technology Extension Station， Zhangye 734000，" China）

Abstract：" This study aimed to assess the genetic diversity and population structure of the Ziwuling black goat， laying the groundwork for the preservation and utilization of this breed. The whole-genome SNP analysis of a total of 99 adult Ziwuling black goats （10 males and 89 females） was performed by super-genotyping by sequencing（super-GBS）. Genetic diversity parameters including observed heterozygosity （Ho）， expected heterozygosity （He）， polymorphic information content （PIC）， nucleotide diversity （Pi）， effective allele number （Ne）， and minor allele frequency （MAF） were calculated using Plink software. Principal component analysis and construction of genetic relationship G matrix were conducted using GCTA software. IBS genetic distance matrix was built using Plink software， and a heatmap was plotted using R language. A phylogenetic tree was constructed using PHYLP， while runs of homozygosity （ROH） were detected using the detect RUNS tool. A total of 996 042 SNPs were detected in the 99 individuals of Ziwuling black goats. The PIC， Pi， Ne， and MAF values of Ziwuling black goats were 0.161， 0.193， 1.295， 0.130， respectively， indicating a relatively low genetic diversity with Ho（0.167） lower than He（0.192）. Both the G matrix and IBS genetic distance results showed that most individuals in the Ziwuling black goat population had distant genetic relationships. The principal component analysis revealed no obvious differentiation within the Ziwuling black goat population， while the phylogenetic tree indicated that the rams could be roughly divided into 6 lineages， with few rams in each lineage. The inbreeding coefficient FROH of the Ziwuling black goat population was 0.049 6， suggesting a relatively low level of inbreeding within the population. In conclusion， the genetic diversity of the Ziwuling black goat population is relatively low， with most individuals having distant kinship relations and a low level of inbreeding within the group. It is recommended to pay attention to the breeding of offspring in order to avoid loss of genetic diversity in the future.

Key words： Ziwuling black goat; Super-GBS；population structure; genetic diversity; family structure；kinship

*Corresponding authors： WANG Ke， E-mail：592374483@qq.com; MA Youji， E-mail：yjma@gsau.edu.cn

畜禽遺傳資源的多樣性是培育優良畜禽品種的物質基礎，可以提供應對未知需求的適應性［1-2］。因此，保護畜禽遺傳資源對于提升畜牧業綜合實力、可持續發展能力、種源自給率以及市場競爭力具有重要意義。

子午嶺黑山羊于1982年被列入《甘肅省畜禽品種志》，命名為隴東黑山羊。2011年收錄于《中國畜禽遺傳資源志 羊志》。在2021年公布的《國家畜禽遺傳資源名錄（2021版）》中被正式命名為子午嶺黑山羊［3］。子午嶺黑山羊原產于子午嶺兩側的甘肅省華池縣、環縣、合水縣和陜西省陜北及渭北等地，現主要集中于甘肅省東部（甘肅省寧縣、鎮原、慶城、定西等地區），截至2021年，現存欄子午嶺黑山羊126 143只。然而，由于畜牧業結構和市場結構調整等因素，為提高產絨量，當地引入遼寧絨山羊及內蒙古絨山羊與子午嶺黑山羊進行雜交，導致純種子午嶺黑山羊的數量急劇下降，面臨滅絕的威脅。子午嶺黑山羊現有一個保種場——隴東黑山羊保種育種場，其中現存欄子午嶺黑山羊1 000余只，出欄500只左右。因此，迫切需要開展保護工作。目前的文獻報道中，關于子午嶺黑山羊的遺傳多樣性和遺傳結構的研究尚屬空白，這限制了對其資源的有效保護和利用。

單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism， SNP）是廣泛應用于基因組水平的遺傳標記基因分型方法，通過對群體內的個體進行全基因組范圍內的SNPs比較分析，可以揭示群體的遺傳多樣性、個體間的親緣關系以及群體結構［4-7］?；蚍中蜏y序（genotyping by sequencing，GBS）技術是在二代測序基礎上發展的簡化基因組測序技術［8］，能夠檢測大量且準確性高的變異SNP位點信息，廣泛應用于高分辨率的遺傳圖譜構建、群體遺傳學、物種鑒定、基因組演化等研究領域［9-11］。例如，馬士龍等［12］基于GBS技術研究了3個麥洼牦牛群體的遺傳結構，為其后續保種計劃的制定提供了依據。劉海林等［13］利用GBS技術對60只湘東黑山羊進行測序，確立了湘東黑山羊的家系結構分析，為湘東黑山羊的保種和選育提供了參考依據。Super-GBS技術作為GBS技術的進階，在SNP標記的重現性、穩定性、分型準確性等特點上優于GBS，提供了更高的位點密度和更多的SNPs，已在遺傳圖譜構建、QTL定位和全基因組關聯分析等領域展現出其應用潛力［14］。

因此，本研究采用Super-GBS技術，目的是深入探究子午嶺黑山羊保種群體的遺傳多樣性、群體結構和親緣關系，旨在為該品種的保護和有效利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及樣品采集

本研究選擇來自隴東黑山羊保種育種場的99只（10公/89母）無親緣關系子午嶺黑山羊為研究對象，所有個體的飼養標準與環境條件一致。其中HC001、HC016、HC036、HC068、HC071、HC072、HC076、HC077、HC087和HC093為公羊，其余均為母羊。

頸靜脈采血5 mL，用含抗凝劑的采血管收集，顛倒混勻8～10次，油性記號筆標記樣品信息并編號，24 h內帶回實驗室-20 ℃～-80 ℃冷凍后，干冰運輸。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA提取與質量鑒定

按照血液基因組DNA提取試劑盒的說明書提取99個血液樣本的基因組DNA，利用NanoDrop 2000檢測DNA的純度，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，使用Qubit 測定每個樣品的最終濃度。

1.2.2 簡化基因組測序

所有樣品委托上海歐易生物科技有限公司進行建庫測序。選擇GCF_001704415.2作為參考基因組進行酶切預測，最終使用PstI-HF/MspI對DNA進行酶切，長度為300～700 bp 的片段被回收進行PCR擴增后，使用Qubit測定PCR產物濃度，文庫質檢合格后使用Illumina Novaseq PE150測序平臺進行測序。

1.3 數據處理

1.3.1 數據質控與基因組比對及SNP變異鑒定

對Raw Reads進行質控后得到 Clean Reads（質控標準：去除接頭序列；去除 N（非AGCT）堿基大于等于5的Reads；去除 5＇端和 3＇端低質量堿基；去除長度小于75 bp 的 Reads；去除質量低于15的堿基數超過整條Reads堿基數40%的低質量Reads）。利用bwa［15］軟件將Clean Reads比對到參考基因組上并使用GATK［16］軟件進行SNP檢測。為了降低SNP檢測的錯誤率，選用QD≥2.0的標準進行過濾，只保留同時滿足該條件的突變位點。使用SnpEff［17］軟件對得到的SNP進行注釋，以確定SNP在基因元件的位置、對氨基酸的變化影響等。

1.3.2 遺傳多樣性及群體結構分析

利用Plink（V1.90）軟件計算觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、多態信息含量（PIC）、核苷酸多樣性（Pi）、有效等位基因數（Ne）及次要等位基因頻率（MAF）等遺傳多樣性指標。

本研究采用鄰接法（neighbor-joining method）［18］構建所有個體的進化樹。通過treebest［19］軟件計算距離矩陣，進化樹的可靠性通過bootstrap法進行檢驗（重復1 000 次）。鑒于公羊對保種群的重要性，采用PHYLIP中的neighbor對10只公羊個體單獨進行了系統進化樹的構建。使用GCTA（V1.92.1）軟件［20］對獲得的SNPs標記進行PCA分析，得到影響最大的兩個特征向量。

1.3.3 親緣關系分析

利用Plink（V1.90）軟件計算群體個體間的狀態同源（identical by state， IBS）和個體間的遺傳距離。通過GCTA（V1.92.1）軟件分析群體親緣關系，通過R軟件繪制G矩陣和IBS距離矩陣熱圖。

1.3.4 ROH分析

通過ROH分析可以用于評估個體的近交程度，ROH越長，近交程度越高。本研究使用R包（detectRUNS）［21］工具，在window-free的情況下統計子午嶺黑山羊群體的ROH分布。通過Plink（V1.90）軟件計算得到每個樣本的ROH長度（參數：minSNP=20，ROHet=FALSE，maxGap=106，minLengthBps=250 000，maxOppRun=1，maxMissRun=1），進而分析得到子午嶺黑山羊的近交系數［22］。

2 結 果

2.1 DNA提取和質量檢測

共提取99份血液DNA，質檢合格，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果條帶清晰明亮（圖1），可用于后續基因組測序。

2.2 數據產出、質控及SNPs分布

本試驗共獲得1 795 029 254個raw reads，過濾后得到1 762 002 636個clean reads。由表1可知，樣本比對率范圍為99.66%～99.94%，平均測序深度為6.7×，測序平均Q30為90.98%，平均GC含量為51.18%，數據質量達到后續分析要求。經過突變位點檢測并過濾，共獲得996 042個SNPs位點，根據其在染色體上的位置，繪制染色體分布圖，發現SNPs非均勻分布在各染色體上，其中Chr1 SNPs數量最多，為51 223個，Chr27 SNPs數量最少，為19 145個（圖2）。由圖3可知，大部分SNPs位于基因間區（55.79%）和內含子區域（38.81%）。

2.3 遺傳多樣性分析

根據表2可知，子午嶺黑山羊群體SNP位點的多態信息含量（PIC）平均值為0.161。平均觀測雜合度（Ho）為0.167，低于期望雜合度（He）0.192。值得注意的是，子午嶺黑山羊群體內部部分個體發生了純合突變，則該位點觀測雜合度為0。有效等位基因數（Ne）平均值為1.295。核苷酸多樣性（Pi）平均值為0.193，次要等位基因頻率（MAF）平均值為0.130。

2.4 遺傳距離和親緣關系分析

通過G矩陣分析子午嶺黑山羊個體之間的親緣關系，根據其可視化結果（圖4）可知，子午嶺黑山羊群體大部分個體間親緣關系較遠（藍色部分），少數個體親緣關系較近（偏紅部分）。

IBS遺傳距離矩陣（圖5）結果表明，子午嶺黑山羊群體IBS遺傳距離為0.817 0～0.9862，平均遺傳距離為0.831 3。其中10只公羊之間的平均遺傳距離為0.833 6。IBS遺傳距離矩陣與G矩陣結果一致，大部分個體親緣關系較遠（藍色小格），少部分個體間親緣關系較近（偏黃及偏紅的方格）。

2.5 群體結構分析

2.5.1 主成分分析

由PCA（圖6）可知，第一主成分和第二主成分分別解釋了2%和1%的遺傳變異。主成分分析結果顯示，子午嶺黑山羊大部分個體緊密聚集在一起，無明顯分層，但仍然存在一定程度的遺傳異質性，表現為部分個體的分散分布。特別值得注意的是，10只公羊樣本中HC001與其他9只公羊樣本在遺傳上并未形成明顯的聚集，這一發現表明子午嶺黑山羊的保種群體可能由至少兩個不同的家系組成。

2.5.2 系統發育樹分析

系統發育樹（圖7A）結果表明，子午嶺黑山羊群體分布在兩個主要分支上。鑒于公羊對整個子午嶺黑山羊保種群體的重要性，本研究對10只公羊進行了基于IBS遺傳距離的聚類分析。分析結果（圖7B）揭示了這些公羊分屬于6個不同的家系，其中家系4和家系6各包含了3只公羊，而其他4個家系各由1只公羊單獨構成。

2.6 ROH分析

99個子午嶺黑山羊個體共檢測到34 246個ROHs，其中33 960個（99.17%）ROHs長度位于0.25～1 Mb之間，284個（0.83%）ROHs長度＞1 Mb。由圖8A可知，個體水平上，個體ROH數量最多為1 023個，累計長度423.33 Mb，最少的僅有28個，累計長度8.31 Mb。基于ROH計算子午嶺黑山羊群體近交系數FROH，由圖8B可知，子午嶺黑山羊個體近交系數范圍為0.003 3～0.171 7，平均FROH值為0.049 6，其中公羊近交系數FROH值為0.051 1。

3 討 論

動物遺傳多樣性對整個物種的適應性和生存能力至關重要，它增強了物種對環境變化的適應力和抗壓能力［23-25］。其中，雜合度是衡量群體遺傳多樣性的一個重要參數。隨著群體雜合度的提高，表示該群體所包含的遺傳信息也更豐富［26］。期望雜合度（He）是指群體中任意個體在特定位點上呈現雜合狀態的概率，而觀測雜合度（Ho）則是指群體中在某位點上呈現雜合狀態的個體數量占總數量的比例［27］。當He＞Ho時，說明群體內部可能發生近交或受到了人工選擇的影響；當He＜Ho時則可能意味著新遺傳變異的引入［28］。本研究顯示，子午嶺黑山羊群體的觀測雜合度為0.167，低于期望雜合度（0.192），說明群體內部發生了近交。此外，該群體的多態信息含量平均值為0.161，屬于低度多態性［29-30］，反映出較低的遺傳變異水平，低于濟寧青山羊（0.283）［31］、永登七山羊（0.221）［27］、隴南山羊（0.236）［32］及柯爾克孜羊（0.737）［33］，說明不同群體的變異與生存環境及受選擇程度相關。這揭示了遺傳變異與群體所處環境及選擇壓力的緊密聯系。研究結果突出了子午嶺黑山羊群體遺傳多樣性的降低可能與群體內部的近交現象密切相關。

本研究基于測序獲得的大量SNPs分別進行了基因組親緣關系G矩陣和IBS遺傳距離矩陣分析，旨在評估子午嶺黑山羊群體的親緣關系。G矩陣能更真實的反映個體間的親緣關系，它比單純根據系譜信息計算的親緣關系更加準確且接近實際情況［34］。IBS只考慮個體之間的遺傳標記或等位基因的相似性，因此在不清楚群體系譜或沒有祖代樣本的情況下，仍能對群體的親緣關系進行分析［35］。本研究中，親緣關系G矩陣及IBS遺傳距離矩陣分析均表明子午嶺黑山羊大部分個體間親緣關系較遠，但仍有少部分個體親緣關系較近。劉彬等［36］指出，在實際的育種實踐中，由于1頭種公畜可能與多頭母畜交配，對種公畜的選擇標準通常較為嚴格。這一現象導致不同種公畜間的親緣關系相對較遠，從而使得種公畜群體的IBS遺傳距離略高于群體平均水平。本研究結果與此觀點相吻合，子午嶺黑山羊公羊的平均IBS遺傳距離（0.833 6）略高于整個群體的平均遺傳距離（0.831 3）。動物群體結構研究在遺傳學領域占據著舉足輕重的地位。深入探究物種的群體結構和親緣關系對于物種的有效保護、資源的可持續利用以及生物多樣性的維護具有重大意義［37］。本研究通過主成分分析發現子午嶺黑山羊群體內部并未表現出明顯的層次分化。盡管如此，子午嶺黑山羊部分個體間仍存在顯著的遺傳背景差異，這與子午嶺黑山羊的種群動態相契合（引入外血與部分個體雜交）。系統發育樹的構建進一步證實了這一點，發現子午嶺黑山羊群體主要分布在兩個顯著的分支上。此外，對10只公羊的系統發育分析揭示了它們被劃分為6個不同的家系，兩個家系各包括3只公羊，其余家系均只有1只公羊，后期應注意后代的選育，避免血統流失。

傳統的近交系數計算依賴于詳盡的家族譜系信息，其精確度和可信度很大程度上取決于譜系數據的質量和完整性［34］。隨著測序技術的發展，基于全基因組SNPs數據直接計算近交系數的方法層出不窮，其中FROH可以在不依賴系譜數據的條件下準確地計算每個個體基因組中同源的百分比，從而對群體的近交程度進行量化分析［21］。Liu等［38］對我國5個本地綿羊品種進行了ROH分析，發現大尾寒羊近交程度最高（FROH=0.080 8），而呼倫貝爾羊近交系數最低（FROH=0.014 8）。張任豹等［31］利用SNP芯片對我國濟寧青山羊進行基因分型，通過ROH分析發現濟寧青山羊群體的FROH是0.047 9。本研究中，子午嶺黑山羊群體的近交系數FROH為0.049 6，其中公羊近交系數FROH值為0.051 1，這一數值高于柯爾克孜羊（0.008）［33］，低于川中黑山羊（0.12）［39］，接近于濟寧青山羊（0.047 9）［31］，這表明子午嶺黑山羊的近交程度相對較低。但是后期隨著保種時間延長，加上群體規模局限性及相對封閉的管理模式，近交系數存在上升的趨勢。因此，在以后的的育種工作中應持續加強譜系檔案的管理，以避免近親繁殖的發生。

4 結 論

本研究通過Super-GBS測序技術分析了子午嶺黑山羊群體遺傳多樣性、親緣關系及群體結構，發現子午嶺黑山羊群體遺傳多樣性較低；大部分個體間親緣關系較遠，但仍有部分個體間親緣關系較近。子午嶺黑山羊群體未出現明顯分層，群體整體近交水平相對較低。為保種場進一步提純選育和優化配種提供了理論依據。

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（編輯 郭云雁）