基于桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的豬腦心肌炎病毒樣顆粒的表達(dá)及鑒定

摘 要： 腦心肌炎（encephalomyocarditis）是由腦心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus，EMCV）引起的以豬的腦炎、心肌炎為主要特征的病毒性人畜共患病，可感染多種哺乳動(dòng)物，目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)有效疫苗。本研究旨在開(kāi)發(fā)一款安全有效的疫苗以防控該病。采用P1、3CD共表達(dá)的構(gòu)建策略，利用桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)獲得EMCV病毒樣顆粒（virus-like particals，VLPs）并將其免疫小鼠，初步評(píng)價(jià)其在小鼠體內(nèi)的免疫應(yīng)答效果。結(jié)果顯示，免疫組小鼠特異性抗體滴度達(dá)到1∶192以上，中和抗體滴度達(dá)到1∶64以上，且與ISA206佐劑混合使用可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更高的抗體水平。IL-4、IFN-γ、IL-5、TNF-α細(xì)胞因子水平均可達(dá)到20 pg·mL-1，且明顯高于PBS組。綜上，本研究獲得的EMCV病毒樣顆粒疫苗可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生良好的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，還能誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，有助于激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，增強(qiáng)疫苗的保護(hù)效果，為EMCV的防控提供了理論依據(jù)和技術(shù)儲(chǔ)備。

關(guān)鍵詞： 桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)；腦心肌炎病毒；病毒樣顆粒

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.65

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）10-4571-08

收稿日期：2023-11-20

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2022YFD1800603；2021YFD1800300）；國(guó)家自然科學(xué)基金（32072859；32072847；32002272）；科技人才與平臺(tái)計(jì)劃（202205AF150007）；所長(zhǎng)基金：《口蹄疫病毒持續(xù)性感染牛咽上皮細(xì)胞遺傳變異的機(jī)制研究》LVRI-SZJJ-202107

作者簡(jiǎn)介：王運(yùn)航（1998-），男，黑龍江佳木斯人，碩士生，主要從事新型疫苗開(kāi)發(fā)研究，E-mail：mailto：1127707200@qq.com；景 偉（ 1996-），男，甘肅靜寧人，博士生，主要從事獸醫(yī)公共衛(wèi)生研究，E-mail：2635378262@qq.com。王運(yùn)航和景偉為同等貢獻(xiàn)作者

*通信作者：白滿(mǎn)元，主要從事動(dòng)物疫苗與分子免疫學(xué)研究，E-mail：baimanyuan@cass.cn

Expression and Identification of Porcine Encephalomyocarditis Virus-like Particles

Based on Baculovirus-insect Cell Expression System

WANG" Yunhang1，2， JING" Wei1， MU" Suyu1， SUN" Shiqi1， GUO" Huichen1， BAI" Manyuan1*

（1.State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention， College of Veterinary Medicine，

Lanzhou University， Lanzhou Veterinary Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences，

Lanzhou 730000，" China;

2.School of Life Science， Yulin University， Yulin 719000，" China）

Abstract：" Porcine encephalomyocarditis is a viral zoonotic disease caused by encephalomyocarditis virus and characterized by porcine encephalitis and myocarditis， which can infect a variety of mammals. Currently， there is no effective vaccine in China， so developing a safe and effective vaccine is an effective measure to prevent and control this disease. In this study， virus-like particals of porcine encephalomyocarditis virus were assembled by using the baculovirus-insect cell expression system with P1 and 3CD co-expression strategy， and the immune response effect of the virus in mice was preliminatively evaluated. The results showed that the specific antibody titer of mice in the immune group reached more than 1∶192， the neutralizing antibody titer reached more than 1∶64， and the combination with ISA206 adjuvant can induce higher antibody levels. The levels of IL-4， IFN-γ， IL-5 and TNF-α cytokines all reached 20 pg·mL-1， and were significantly higher than those in PBS group. Therefore， the EMCV virus-like particle vaccine obtained in this study can induce the body to produce good cellular and humoral immune responses， and can also induce the production of inflammatory cytokines， which helps to stimulate the body′s immune response， enhance the protective effect of the vaccine， and provide theoretical basis and technical reserve for the prevention and control of EMCV.

Key words： baculovirus-insect cell expression system; encephalomyocarditis virus; virus-like particles

*Corresponding author： BAI Manyuan，E-mail：baimanyuan@cass.cn

豬腦心肌炎又稱(chēng)豬病毒性腦心肌炎，是由腦心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus，EMCV）感染引起的一種對(duì)仔豬致死率極高的自然疫源性傳染病，以腦炎和心肌炎為主要特征［1］。EMCV是一種重要的人畜共患病病原，可感染豬、嚙齒動(dòng)物及其他哺乳動(dòng)物。豬是EMCV感染最廣泛和癥狀最典型的動(dòng)物，20周齡內(nèi)豬常可發(fā)生致死性感染，尤其仔豬更易感［2］。EMCV屬于微RNA病毒科心病毒屬，無(wú)囊膜，基因組為單股正鏈RNA，基因組全長(zhǎng)約7.8 kb。EMCV基因組只有一個(gè)開(kāi)放閱讀框，編碼前體蛋白P1、P2、P3，P1蛋白會(huì)進(jìn)一步裂解為結(jié)構(gòu)蛋白1A（VP4）、1B（VP2）、1C（VP3）和1D（VP1），P2和P3裂解為2A、3C、3D等非結(jié)構(gòu)蛋白。EMCV病毒粒子直徑約27 nm，呈二十面體對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)，其衣殼蛋白由VP1、VP2、VP3和VP4構(gòu)成，其中VP1、VP2和VP3位于病毒粒子的表面，VP4位于衣殼內(nèi)部，3C、3D蛋白具有蛋白酶作用，協(xié)助P1前體蛋白裂解為衣殼蛋白［3］。

1958年EMCV首次在豬體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)后，在歐洲、加拿大、南美、中國(guó)等國(guó)家相繼蔓延，感染對(duì)象包括豬、大象、嚙齒類(lèi)和非靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，甚至人類(lèi)［4］。可見(jiàn)EMCV在世界范圍內(nèi)分布極其廣泛，嚴(yán)重威脅養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展和公共衛(wèi)生安全，疫苗免疫是疫病防控最有效的措施，因此研發(fā)一款安全有效的新型疫苗至關(guān)重要［5］。

病毒樣顆粒（virus-like particals，VLPs）疫苗是近年來(lái)疫苗領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，是由病毒的一種或幾種結(jié)構(gòu)蛋白自組裝形成的蛋白顆粒，不含有病毒的遺傳物質(zhì)，具有與天然病毒粒子相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)［6］，因此相對(duì)于滅活疫苗和合成肽疫苗，VLPs具有良好的安全性和免疫原性。而且由于其生物相容性高，還可根據(jù)需求進(jìn)行精準(zhǔn)修飾，因而成為了理想的疫苗研發(fā)應(yīng)用平臺(tái)［7］。目前常用VLPs的表達(dá)系統(tǒng)分為原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)，而桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)由于具有可識(shí)別和處理信號(hào)肽，支持寡聚化，并可進(jìn)行糖基化、磷酸化等翻譯后修飾，輔助蛋白正確折疊，有助于VLPs正確組裝等優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用于VLPs的表達(dá)生產(chǎn)［8］。因此，本研究利用桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)EMCV的P1和3CD，擬對(duì)獲得的VLPs進(jìn)行初步的免疫原性評(píng)價(jià)，為后期EMCV病毒樣顆粒疫苗的研制和開(kāi)發(fā)奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

腦心肌炎病毒、BHK-21細(xì)胞、sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞、表達(dá)載體pFastBac Dual、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α及DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞由蘭州獸醫(yī)研究所口蹄疫防控技術(shù)團(tuán)隊(duì)保存。限制性?xún)?nèi)切酶NheI-HF、Kpn I（3CD）和BamHI、Hind Ⅲ（P1）購(gòu)自NEB公司，PrimeSTAR? GXL DNA Polymerase、Premix TaqTM及連接酶Solution I購(gòu)自TaKaRa公司，Plasmid Mini Kit I（200）及Gel Extract Kit（200）購(gòu)自O(shè)MEGA公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI中GenBank（登錄號(hào)：X74312.1）公布的EMCV-P1和EMCV-3CD的基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物P1-F：5′-GGGATCCATGGGTAATAGCACTAGCAGCGATAAGAA-3′；P1-R：5′-GAAG-CTTTTACTCCAGCATCAGCACTCCAGCTCTG-3′；3CD-F：5′-ATCTCGAGCCATGGTGCTAGCA-TGGGACCGAACCCTGTGA-3′；3CD-R：5′-CCTC-CCCCATCTCCCGGTACCTTACTGTGGCTCAA-AGGCATTCAC-3′；由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 重組質(zhì)粒載體pFBD-P1-3CD的構(gòu)建

以病毒cDNA為模板，分別利用上述P1和3CD的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：25 μL PrimeSTAR HS（premix），1 μL引物1，1 μL引物2，1 μL cDNA模板，22 μL ddH2O；反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s，64℃退火5 s，72℃延伸2.5 min，30個(gè)循環(huán)。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并純化PCR產(chǎn)物。將回收的P1目的基因片段和pFastBac Dual（pFBD）利用限制性?xún)?nèi)切酶BamHI和HindⅢ進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，利用Solution I連接體系將P1目的片段連接到pFBD載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至 DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單菌落，通過(guò)菌液PCR鑒定，將鑒定正確的陽(yáng)性表達(dá)菌提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為pFBD-P1；然后將3CD目的基因片段和pFBD-P1重組質(zhì)粒分別用限制性?xún)?nèi)切酶NheI和KpnI進(jìn)行雙酶切，連接后鑒定測(cè)序，將正確的重組質(zhì)粒命名為pFBD-P1-3CD。

1.4 重組桿粒rBacmid-P1-3CD的構(gòu)建

將鑒定正確的重組質(zhì)粒pFBD-P1-3CD轉(zhuǎn)化E.coli DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，在含有50 mg·mL-1卡那霉素、7 mg·L-1慶大霉素、10 mg·L-1四環(huán)素、100 mg·L-1 X-Gal與40 mg·L-1IPTG的LB固體培養(yǎng)基上37℃恒溫培養(yǎng)進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取白色菌落，接種于5 mL含有50 mg·L-1卡那霉素、7 mg·L-1慶大霉素、10 mg·L-1四環(huán)素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r·min-1培養(yǎng)12 h。提取重組桿粒rBacmid-P1-3CD，并使用M13-F與M13-R通用引物進(jìn)行PCR鑒定，驗(yàn)證正確的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。

1.5 重組桿狀病毒的制備

使用Cellfectin轉(zhuǎn)染試劑將重組桿粒rBacmid-P1-3CD轉(zhuǎn)染至sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，27℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變，收集培養(yǎng)液，離心除去細(xì)胞碎片，獲得上清為P1代毒株，存于-80℃?zhèn)溆谩1代毒株感染sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞后經(jīng)2次傳代擴(kuò)增，為P3代毒株，并進(jìn)行PCR和IFA鑒定。

1.6 EMCV-VLPs的表達(dá)、純化及電鏡觀察

使用終點(diǎn)稀釋法測(cè)定桿狀病毒滴度，將P3代桿狀病毒以MOI=1感染sf9細(xì)胞（細(xì)胞密度為3～3.5×106個(gè)·mL-1），27℃、150 r·min-1，培養(yǎng)72 h，凍融使細(xì)胞破碎，4℃，8 000 r·min-1離心30 min去除細(xì)胞碎片收集上清。通過(guò)Vivaflow?切向流過(guò)濾膜包進(jìn)行濃縮，4℃，40 000 r·min-1離心2 h，棄上清，沉淀用PBS重懸，使用乳化管使其充分分散，4℃條件下，10 000 r·min-1離心30 min，收集上清液，進(jìn)行蔗糖密度梯度純化。取獲得的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)至NC膜，兔抗EMCV多克隆抗體1∶1 000稀釋作為一抗，4℃過(guò)夜孵育后，使用1∶3 000稀釋的HRP-兔抗IgG作為二抗，ECL避光反應(yīng)1 min，利用Tanon 5 200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)顯示結(jié)果。取10 μLVLPs樣品滴到銅網(wǎng)正面，吸附2 min后用濾紙吸干，20 μL PBS洗兩遍，3%磷鎢酸負(fù)染1 min，濾紙吸干，室溫下晾干后利用透射電鏡觀察、照相并分析。

1.7 EMCV-VLPs免疫電鏡觀察

將純化的VLPs樣品與4%多聚甲醛（PFA）按1∶1混合，滴在電鏡銅網(wǎng)正面，室溫吸附20 min，PBS洗滌兩次，每次3 min，再用50 mmol·L-1甘氨酸洗滌銅網(wǎng)3次，每次3 min。將20 μL封閉液（含5% BSA的PBS）滴在銅網(wǎng)正面，封閉10 min。兔抗EMCV多克隆抗體1∶1 000稀釋作為一抗，取20 μL滴在銅網(wǎng)上，孵育1 h。用20 μL Wash buffer（含0.1% BSA的PBS）洗滌銅網(wǎng)6次，每次3 min。用二抗稀釋液（含0.5% BSA的PBS）對(duì)山羊抗兔膠體金顆粒進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)?0 μL于銅網(wǎng)上，孵育1 h。用20 μL Wash buffer洗滌銅網(wǎng)六次，每次2 min，再用PBS洗滌銅網(wǎng)6次，每次2 min。將20 μL 1%戊二醛滴在銅網(wǎng)上，靜置2 min，然后用20 μL去離子水洗滌銅網(wǎng)6次，每次2 min。最后用3%磷鎢酸染液負(fù)染1 min，用濾紙吸干殘留染色液，在室溫下晾干后利用透射電鏡觀察、照相并分析。

1.8 EMCV-VLPs小鼠免疫試驗(yàn)

選取20只6周齡的SPF級(jí)BALB/c雌性小鼠隨機(jī)分為4組，每組5只，采用皮下多點(diǎn)注射方式免疫。第一組為PBS對(duì)照組，第二組為VLPs+ ISA206佐劑組，每只免疫抗原50 μg，第三組為1/2VLPs+ ISA206佐劑組，每只免疫抗原25 μg，第四組為VLPs組，每只免疫抗原50 μg。2周后第二次加強(qiáng)免疫，4周后小鼠采血并檢測(cè)抗體及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒pFBD-P1的構(gòu)建及鑒定

使用P1、3CD的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到2 500 bp的P1目的條帶和2 000 bp的3CD目的條帶（圖1A），與預(yù)期結(jié)果相符。對(duì)P1目的片段和載體pFastBac Dual同時(shí)用BamHI和Hind Ⅲ進(jìn)行雙酶切處理，連接后進(jìn)行雙酶切和PCR鑒定，酶切片段與P1目的片段大小一致，測(cè)序正確（圖1B），命名為重組質(zhì)粒pFBD-P1。將3CD目的片段和重組質(zhì)粒pFBD-P1用NheI和KpnI雙酶切處理，連接產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切和PCR鑒定，酶切片段與3CD目的片段大小一致（圖1C），測(cè)序正確后重組質(zhì)粒命名為pFBD-P1-3CD。將重組質(zhì)粒pFBD-P1-3CD轉(zhuǎn)化E.coli DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，提取重組桿粒后利用P1上游引物和M13下游引物擴(kuò)增獲得大小約6.7 kb的片段（圖1D），與預(yù)期結(jié)果相符。

2.2 重組桿粒rBacmid-P1-3CD轉(zhuǎn)染sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞及鑒定

將重組桿粒rBacmid-P1-3CD轉(zhuǎn)染至sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，培養(yǎng)72 h后，細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變，收獲病毒液即為P1代桿狀病毒。將所得的第一代病毒液連續(xù)接種獲得P3代桿狀病毒，提取病毒液的質(zhì)粒，利用VP1特異性引物和IFA技術(shù)鑒定病毒轉(zhuǎn)染和擴(kuò)增情況，結(jié)果顯示，850 bp處有明顯條帶與VP1大小一致（圖2A），IFA結(jié)果也證明重組桿粒rBacmid-P1-3CD成功轉(zhuǎn)染sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞（圖2C）。將P3代桿狀病毒接種sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞并懸浮培養(yǎng)，表達(dá)目的蛋白，利用Western blot鑒定結(jié)果表明，三條特異性條帶分子量大小分別為36、30、26 ku左右，與EMCV病毒液對(duì)照組條帶一致，分別對(duì)應(yīng)EMCV的VP0、VP1、VP3蛋白（圖2B）。

2.3 EMCV-VLPs的純化及鑒定

將收獲的桿狀病毒表達(dá)上清液濃縮，經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化分離，通過(guò)透射電子顯微鏡、動(dòng)態(tài)光散射儀及免疫電鏡技術(shù)對(duì)獲得的EMCV-VLPs進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖3所示，動(dòng)態(tài)光散射儀在25 nm左右顯示明顯吸收峰，透射電子顯微鏡下能夠觀察到大小約為25 nm的病毒樣顆粒，與EMCV全病毒粒子形態(tài)大小一致。利用膠體金標(biāo)記抗體免疫電鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)大小約為25 nm的病毒樣顆粒，且其周?chē)心z體金附著，從而進(jìn)一步證實(shí)獲得的病毒樣顆粒為EMCV-VLPs。

2.4 動(dòng)物免疫試驗(yàn)及鑒定

小鼠免疫結(jié)果顯示，本研究制備的EMCV-VLPs疫苗具有良好的安全性和免疫原性，和對(duì)照組相比，免疫組小鼠未出現(xiàn)明顯的體重變化，也無(wú)死亡，且免疫部位無(wú)紅腫等不良反應(yīng)。利用間接ELISA和病毒中和試驗(yàn)測(cè)定小鼠二免后14 d血清的特異性抗體及中和抗體水平。結(jié)果如圖4所示，免疫組小鼠特異性抗體、中和抗體水平顯著高于PBS組，特異性抗體稀釋度均達(dá)到1∶192以上，中和抗體稀釋度均達(dá)到1∶64以上，且與ISA206佐劑混合使用可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更高的抗體水平。

為進(jìn)一步揭示EMCV-VLPs疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的機(jī)制，利用ELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定小鼠二免后14 d血清中IL-4、IFN-γ、IL-5、TNF-α的水平。結(jié)果如圖5所示，與PBS對(duì)照組相比，免疫" 組均能產(chǎn)生較高水平的IL-4、IFN-γ、IL-5、TNF-α，表明MCV-VLPs疫苗不僅可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生良好的體液免疫應(yīng)答，也能誘導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫應(yīng)答。

3 討 論

腦心肌炎病毒是一種廣泛傳播于哺乳動(dòng)物中的病毒，對(duì)豬的影響最為嚴(yán)重，尤其是仔豬［9］。疫苗接種仍然是控制和預(yù)防傳染病的最具成本效益和最成功的干預(yù)措施［10］。傳統(tǒng)的疫苗策略主要是基于減毒或滅活病毒，雖然其可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生良好的B細(xì)胞和T細(xì)胞反應(yīng)以及可維持長(zhǎng)效免疫反應(yīng)的優(yōu)勢(shì)［11］，但也存在生產(chǎn)成本高、生產(chǎn)工藝復(fù)雜、毒力反強(qiáng)等問(wèn)題。因此，人們正在尋找新型替代疫苗開(kāi)發(fā)的方法。

病毒樣顆粒（virus-like particles， VLPs）是由病毒的一種或幾種結(jié)構(gòu)蛋白在體外以自主裝配方式形成的蛋白粒子［12］，具有形態(tài)和結(jié)構(gòu)上模擬天然病毒、不含遺傳物質(zhì)、無(wú)感染和復(fù)制能力的優(yōu)勢(shì)［13］。VLPs以正確構(gòu)象和高度重復(fù)的形式展示抗原表位，能夠同時(shí)誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫［14］。雖然VLPs主要是針對(duì)B細(xì)胞，通過(guò)激活T輔助細(xì)胞和APC呈遞MHC Ⅱ類(lèi)分子后誘導(dǎo)產(chǎn)生較強(qiáng)的抗體反應(yīng)。但VLPs的抗原提呈并不局限于MHC Ⅱ類(lèi)分子，還可以延伸到MHC Ⅰ類(lèi)分子，以有效地提呈和啟動(dòng)CD8+T細(xì)胞。并且中性粒細(xì)胞也有助于將VLPs衍生的肽交叉呈現(xiàn)在MHC I類(lèi)分子上［15-16］。這一現(xiàn)象構(gòu)成了基于VLPs的疫苗的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)，并已被廣泛用于設(shè)計(jì)基于VLPs的治療性疫苗，用于治療癌癥和慢性病［17-20］。

桿狀病毒-昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)具有能夠容納多個(gè)外源基因，可對(duì)表達(dá)的外源蛋白進(jìn)行自主修飾加工的優(yōu)勢(shì)［21］。因此本次研究采用將EMCV的P1基因和3CD基因插入pFastBac Dual昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)載體中同時(shí)表達(dá)表的策略獲得VLPs，并通過(guò)PCR、Western blot、電鏡、膠體金免疫電子顯微鏡等鑒定。結(jié)果顯示，本研究成功獲得了與全病毒顆粒形態(tài)大小相似，粒徑約為25 nm的EMCV病毒樣顆粒。隨后將EMCV-VLPs與ISA206佐劑混合制備疫苗免疫小鼠，通過(guò)檢測(cè)血清中抗體水平和細(xì)胞因子水平，結(jié)果顯示免疫組的血清中特異性抗體水平大于1∶192，中和抗體水平大于1∶64，遠(yuǎn)高于PBS對(duì)照組，且ISA206佐劑可明顯更高VLPs疫苗的抗體水平。IL-4、IFN-γ、IL-5、TNF-α檢測(cè)結(jié)果顯示，二免14 d后，免疫組的細(xì)胞因子的水平均大于20 pg·mL-1，且遠(yuǎn)高于PBS對(duì)照組。以上結(jié)果表明本研究制備的EMCV-VLPs疫苗不僅能夠產(chǎn)生針對(duì)豬腦心肌炎病毒的中和抗體和特異性T細(xì)胞反應(yīng)，從而有效抵御病毒的入侵，病毒樣顆粒疫苗還能誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，有助于激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，增強(qiáng)疫苗的保護(hù)效果。雖然病毒樣顆粒疫苗在豬腦心肌炎的防控中具有巨大的潛力，但仍存在一些需要解決的問(wèn)題，如疫苗的穩(wěn)定性、大規(guī)模生產(chǎn)工藝的優(yōu)化等。此外，病毒樣顆粒疫苗與其他疫苗技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用以及新疫苗抗原的篩選和設(shè)計(jì)，也有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

豬腦心肌炎是一種對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成重大損失的病毒性疾病，本研究利用高效的桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，成功制備了豬腦心肌炎病毒樣顆粒。這些VLPs作為疫苗免疫原，能夠有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答。體液免疫應(yīng)答的產(chǎn)生，使豬只體內(nèi)形成了特異性的抗體，這些抗體能夠與病毒結(jié)合，阻止其侵入宿主細(xì)胞。VLPs疫苗還能刺激細(xì)胞免疫，激活T細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞毒性反應(yīng)，直接殺傷感染病毒的細(xì)胞。這項(xiàng)研究成功地為豬腦心肌炎的防控提供了新的策略，也為我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展提供了有力的技術(shù)支撐。

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（編輯 范子娟）