利用單B細胞分選技術制備豬瘟病毒E2蛋白單克隆抗體及其在ELISA中的應用

摘 要： 本研究旨在建立一種豬瘟病毒E2單抗競爭ELISA檢測方法，用于評價豬瘟C株弱毒苗和E2亞單位疫苗的免疫效果。首先，構建豬瘟E2桿狀病毒表達載體pFastBAC，通過懸浮培養SF9細胞高效表達E2蛋白；其次，用純化的E2蛋白免疫BABL/c小鼠，通過流式分選IgM-PE-/E2-APC+型單個B細胞。然后，利用半巢式PCR分別擴增E2特異性IgG抗體的重鏈和輕鏈，測序后將抗體重鏈及輕鏈構建到pCDNA3.1載體，再將構建好的質粒共轉染至HEK-293細胞，制備豬瘟E2單克隆抗體。結果表明，本研究通過單B細胞分選技術獲得的兩株單克隆抗體，即mAb3A9（IgG1，kappa）和mAb4F7（IgG2a，lambda），分別識別豬瘟E2蛋白B細胞線性表位25GLTTTWKEYSHDLQL39 和259GNTTVKVHASDERGP273。此外，用上述兩株單克隆抗體及E2蛋白建立的單抗競爭ELISA檢測方法，在血清樣本檢測過程中，均展現出優異的診斷敏感性（97.49%，95.97%）及特異性（96.08%，94.38%），該研究為我國豬瘟的逐步凈化提供了有利的技術支撐。

關鍵詞： 豬瘟；E2；單B細胞；表位；ELISA

中圖分類號：S858.285.3

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）10-4579-11

收稿日期：2023-12-21

基金項目：國家生豬技術創新中心戰略重點研究項目（NCTIP-XD/C03）

作者簡介：馬中元（1989-），男，甘肅清水人，碩士，主要從事動物病原生物學研究，E-mail： 1203639017@qq.com

*通信作者：曾巧英，主要從事動物重要病原微生物的分子致病機理研究，E-mail：zengqy@gsau.edu.cn

Development of Monoclonal Antibodies against Classical Swine Fever Virus E2 Protein by Single B Cell Sorting

Technology and Its Application in ELISA

MA" Zhongyuan1， ZHENG" Junzuo1， LIANG" Zhibo1， PAN" Li2， ZENG" Qiaoying1*

（1.College of Veterinary Medicine， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070，" China;

2.

Lanzhou Veterinary Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou 730046，

China）

Abstract：" The purpose of this study was to develop a classical swine fever virus （CSFV） E2 monoclonal antibody-based competition ELISA （Enzyme Linked Immunosorbent Assay） for evaluating the efficiency of the live attenuated C-strain and E2 subunit vaccines. Firstly， the E2 gene of CSFV was constructed into pFast BAC vector， and the E2 protein was efficiently expressed in SF9 cells; Secondly， 6-8 weeks of BABL/c mice were immunized at intervals with purified E2 protein， and the single B cells were then sorted out at the gate of IgM-/E2+ by flow cytometry. Then， the heavy and light chains of E2 antigen-specific IgG antibodies were amplified by semi-nested PCR， after sequencing， the heavy and light chains of the antibodies were constructed into pCDNA3.1vector， and then were co-transfected into HEK293 cells to prepare the monoclonal antibodies against CSFV E2. The results showed that the two monoclonal antibodies derived from single B cells， namely mAb3A9 （IgG1， kappa） and mAb4F7 （IgG2a， lambda）， could efficiently reacted with the linear epitopes25GLTTTWKEYSHDLQL39 and259GNTTVKVHASDERGP273 of CSFV E2 protein， respectively. In addition， the competitive ELISAs developed using the monoclonal antibodies and E2 protein mentioned above exhibited an excellent diagnostic sensitivity （97.49%， 95.97%） and specificity （96.08%， 94.38%） in the process of detecting serum samples， which provides a favorable technical support for the gradual elimination of CSF in China.

Key words： classic swine fever; E2; single B cells; epitopes; ELISA

*Corresponding author：" ZENG Qiaoying， E-mail： zengqy@gsau.edu.cn

豬瘟（classic swine fever，CSF）是由豬瘟病毒（classic swine fever virus， CSFV）感染引起的具有高度傳染性的豬病毒性疾病，嚴重危害我國生豬產業的發展［1-2］。目前，疫苗接種仍然是我國豬瘟防控的主要措施。因此，及時評價豬瘟C株疫苗和E2亞單位疫苗免疫保護效果是有效防控CSF的關鍵［3］。CSFV是黃病毒科（Flaviviridae）瘟病毒屬 （Pestivirus）成員，病毒粒子直徑約40～60 nm，基因組長為12.3 kb的單股正鏈RNA，其開放閱讀框編碼4種結構蛋白（Core、Erns、E1、E2）和8種非結構蛋白 （Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）［4-5］。其中，E2蛋白以二聚體位于病毒囊膜表面，能夠誘導機體產生大量具有中和活性的抗體，是最主要的保護性抗原［6-7］，已廣泛應用于亞單位疫苗設計、體外診斷及單克隆抗體制備等領域。

目前，單克隆抗體制備技術主要經歷了以下發展：雜交瘤細胞技術，噬菌體展示抗體文庫技術，單個B細胞抗體技術［8-10］。其中，通過流式分選單B細胞是近年來新興的一類快速制備單克隆抗體的技術，其克服了傳統雜交瘤技術融合率低，篩選周期長及染色體丟失等缺陷，成為制備功能多樣性單克隆抗體最重要的高通量方法之一［11-12］。因此，本研究應用流式單B細胞分選技術制備了兩株高親和力的豬瘟E2單克隆抗體，并建立了豬瘟E2單抗競爭ELISA的檢測方法，可用于評估豬瘟疫苗的免疫效力。作者的數據表明：在血清樣本檢測過程中，兩株單抗均體現出優異的敏感性及特異性，該研究成果為我國豬瘟的逐步凈化提供了可靠的技術工具。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細胞

6～8周齡BABL/c小鼠，購自中國農業科學院蘭州獸醫研究所實驗動物中心；HEK293細胞、PK15細胞、SF9細胞，由作者所在課題組保存。

1.2 主要試劑

真核表達載體pCDNA 3.1，桿狀病毒表達載體pFast Bac1為本實驗室保存；Single B cell lysis kit，SuperScriptTM VILOTM MASTE MIX，EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Reagent，rat anti-mouse IgM-PE，DNase I購自Thermo公司；SMARTer? RACE 5′/3′ Kit，Peptide Coating Kit 購自TaKaRa公司；HotStar Taq DNA聚合酶購自QIAGEN公司; anti-Biotin APC購自Miltenyi公司。

1.3 引物設計與合成

抗體IgG序列5′端到3′端的結構為Signal-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-CH1-CH2-CH3-CH4；其中，Signal為分泌信號肽，引導抗體肽鏈正確折疊并修飾；FR1-4為序列保守的骨架區（framework region，FR區），位于互補決定區之間；CDR1-3為識別抗原的互補決定區（complementarity-determining region， CDR區），CH1-4為抗體序列保守的恒定區（constant region， C區）。小鼠IgG抗體重鏈及輕鏈恒定區引物通過檢索IMGT?設計，分別合成gamma、lambda、kappa鏈引物，其中outer和inner反向引物序列可結合于恒定區C1，outer引物靠近CH1區外側，用于第一輪半巢式PCR擴增，inner引物靠近CH1區內側，用于第二輪半巢式PCR擴增；gamma、lambda、kappa鏈可變區正向引物由5′Race PCR測序分析設計，正向引物序列結合于抗體FR1的5′末端。通過IMGT?檢索已公布的小鼠單克隆抗體，正向和反向引物PCR擴增抗體重鏈可變區產物的大小約500 bp，輕鏈可變區PCR產物大小約300 bp；引物序列如表1～3所示，所有引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.4 豬瘟病毒E2抗原表達純化及生物素標記

豬瘟E2全長基因根據昆蟲細胞表達系統密碼子偏好性優化后，在其5′端插入分泌信號肽（MLLVNQSHQGFNKEHTSKMVSAIVLYVLL-AAAAHSAFA），3′端插入linker序列 GSGSGS和 6×His 標簽序列，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。合成的E2序列通過EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點插入pFast Bac載體，然后將pFast Bac-E2轉入E. coli DH10 Bac細胞，挑取陽性克隆并提取Bacmid，用制備的P2代桿狀病毒感染SF9細胞，表達分泌型E2蛋白。收集細胞培養上清，用Ni2+親和層析柱純化E2蛋白，Western blot驗證其反應原性。按照說明書操作流程，用Biotin標記試劑盒標記高純度的E2蛋白，置于-20 ℃冰箱保存，用于流式分選。

1.5 流式分選E2抗原特異性B淋巴細胞

使用方法“1.4”中純化的E2蛋白免疫6～8周齡BABL/c小鼠，免疫程序：使用弗氏佐劑與純化的E2蛋白等體積劑乳化后，采用皮下注射間隔免疫3次，每只小鼠免疫25 μg抗原，待抗體效價在阻斷率大于90%以上時（使用IDEXX試劑盒檢測抗體效價），收集小鼠脾細胞。用淋巴細胞分離液離心小鼠脾細胞，制成單細胞懸液，細胞計數后用細胞分選液稀釋細胞濃度至106·mL-1，每管200 μL加入流式管。細胞染色：加入生物素標記E2抗原1 μL（濃度：1 mg·mL-1），避光靜置30 min；400×g離心5 min，用細胞分選液再清洗一次；加入2 μL anti-Biotin-APC抗體，1 μL rat-anti-mouse IgM-PE抗體，避光靜置30 min， 400×g離心5 min，用細胞分選液再清洗一次，設置FMO對照（不加抗原），準備上機。E2特異性B細胞分選：設置流式細胞分選儀參數：單細胞分選模式，100 μm噴嘴，每秒6 000個細胞的分選速度，振幅20 psi，頻率 30 kHz， 關閉Sweet，調節Accudrop液滴延遲，將IgM-PE-/E2-APC+型單個B細胞分選進含有反轉錄酶及裂解液的96孔PCR板。

1.6 E2單克隆抗體重鏈輕鏈擴增測序及抗體表達

室溫裂解96孔PCR板的單個特異性單B細胞，使用oligo-dT引物反轉錄重鏈和輕鏈可變區mRNA成cDNA模板，RT-PCR條件為：42 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min。隨后進行2輪巢式 PCR，獲得抗體重鏈和輕鏈可變區DNA模板。半巢式PCR擴增：第一輪PCR條件：94 ℃ 30 s；50～55 ℃ 30 s；72 ℃ 60 s；40個循環；電泳鑒定 PCR 產物，大小正確后，使用 2 μL第一輪PCR 產物模板進行第二輪半巢式 PCR，擴增條件：94 ℃ 30 s，55～58℃ 30 s，72 ℃ 60 s，40個循環，1%瓊脂凝膠電泳鑒定PCR 產物，膠回收后克隆至pMD19-T載體，質粒送上海生工股份有限公司測序，獲得抗體重鏈和輕鏈的可變區序列。抗體IgG的可變區DNA序列測通后，即5′端的引物序列確定后，抗體恒定區的序列在通過一代測序進一步測通，并由南京金斯瑞生物公司合成。最后在GenBank進行序列比對分析并拼接全長序列，由南京金斯瑞生物公司合成在pCDNA-3.1載體，將含有配對重鏈和輕鏈的質粒，以2∶1的質量比共轉染HEK293細胞系，制備E2蛋白特異性單克隆抗體。

1.7 肽段合成及E2蛋白B細胞線性表位篩選

將E2蛋白全長氨基酸序列按照15個氨基酸為一個線性B細胞表位截短，相鄰肽段相互重疊10個氨基酸，設計的肽段由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，按照肽段包被試劑盒（TaKaRa MK100）說明書操作流程，用“1.6”中表達的E2單克隆抗體篩選能與其反應匹配的表位序列。

1.8 豬瘟E2單抗競爭ELISA方法建立

包被：1×PBS緩沖液梯度稀釋E2蛋白，濃度為 200、100、50、25 ng·孔-1， 每孔100 μL加入96孔ELISA板，4℃靜置過夜，次日棄去孔內液體，1×PBST緩沖液洗板3次，拍干；封閉：用1×PBST配制5%脫脂奶粉作為封閉液，每孔200 μL，37 ℃溫箱封閉2 h，棄去孔內溶液，拍干，置于37 ℃溫箱烘干30 min；加樣：先在血清稀釋板上稀釋血清，用血清稀釋液稀釋標準陽性對照和陰性對照血清，稀釋比例為1∶2、1∶4、1∶8、1∶16，將稀釋好的質控血清以50 μL·孔-1轉入上述包被的ELISA板中；同時，每孔各加入50 μL HRP標記的E2單克隆抗體（1∶5 000），37℃孵育30 min后，用1×PBST緩沖液洗板3次，拍干；最后，加入100 μL TMB底物溶液，置于37℃反應10 min；TMB底物溶液反應結束后，加入50 μL終止液終止反應，并用酶標儀讀取OD450 nm數值。

1.9 敏感性及特異性評價

豬瘟標準陽性血清及陰性血清（質控血清），臨床陰性血清樣本（80份），豬瘟E2亞單位疫苗免疫血清樣本（160份），豬瘟C株活疫苗免疫血清樣本（30份），由蘭州獸醫研究所制備并保存。按照“1.8”所述ELISA方法檢測臨床樣本，評估單克隆抗體的敏感性及特異性，臨床血清樣本OD450 nm值均以阻斷率（PI）計算，計算公式為：PI=（OD450 nm 陰性-OD450 nm樣本）×100% / OD450 nm 陰性。

1.10 臨床樣本檢測及符合率評估

豬瘟E2 Ab ELISA試劑盒（IDEXX）購自愛德士公司，臨床血清樣本（100份）由作者所在課題組收集。分別用進口商品化試劑盒及“1.8”中所述單抗競爭ELISA同時檢測臨床血清樣本，比較整體符合率及評估該方法的臨床實用性。

2 結 果

2．1 E2蛋白表達鑒定及生物素標記

收集SF9細胞上清，如圖1 A 所示，豬瘟E2蛋白大量表達于培養基上清液，每升含量約為6～8 mg，12% SDS-PAGE電泳檢測，其分子量大小約為43 ku；其次，用his單抗及E2特異性抗體檢測純化的E2蛋白，驗證其反應原性，如圖1 B 和1D所示，E2蛋白具有良好的反應活性，能被標簽抗體和E2蛋白特異性抗體識別；同時，作者使用生物素標記試劑盒標記高純度E2蛋白用于流式分選，如圖1C所示，蛋白標記成功，生物素標記的E2蛋白能被鏈霉素親和素-HRP識別。

2.2 流式分選試驗方案設計

單B細胞分選試驗流程如圖2所示：首先，收集免疫小鼠脾細胞，用淋巴細胞分離液分離小鼠脾細胞；其次，用Biotin標記的抗原，anti-Biotin-APC及anti-mouse-IgM-PE抗體進行細胞染色。染色結束后，使用BD FACS Aira Ⅱ流式分選儀分選抗原特異性細胞，分選獲得的單B細胞用單細胞裂解液裂解后，經過RT-PCR和半巢式PCR擴增抗體可變區DNA序列，然后構建到真核表達載體，序列比對正確的IgG抗體重鏈質粒和輕鏈質粒，共轉染到HEK293細胞，用于抗體表達及功能分析。

2.3 E2抗原特異性單B細胞分選

細胞染色完成后，使用BD FACS Aira Ⅱ流式分選儀分選E2抗原特異性B細胞。首先，P1門圈出淋巴細胞群；其次，P2門圈出單一細胞，排除黏連細胞體，盡量保證分入孔中的細胞為單個B細胞；同時，P3門圈出IgM-PE陰性細胞群，即篩選出能夠分泌表達IgG的B細胞群；最后，用生物素標記的E2特異性抗原及anti-biotin-APC，在P4門圈出E2抗原特異性單個B細胞，調節Accudrop液滴延遲及96孔PCR板的位置，所有參數設置完成后，在單細胞模式下，分選P4門B細胞到96孔PCR板（圖3）。

2.4 單克隆抗體PCR擴增及表達

使用表1～3中所示引物擴增抗體重鏈及輕鏈，RT-PCR及Semi-PCR擴增程序按照方法“1.6”中所述進行。PCR產物通過1%瓊脂凝膠電泳檢測，如圖4 A所示，在特定位置均有清晰的條帶，抗體重鏈可變區大小約為500 bp左右，輕鏈可變區大小約為300 bp左右。PCR擴增產物膠回收后，TA克隆至測序載體，送上海生工股份有限公司測序，測序結果在BLAST網站進行比對，然后將正確匹配的重鏈和輕鏈分別構建到pCDNA-3.1真核表達載體。質粒構建完成后，將質粒共轉染至HEK293細胞表達抗體。如圖4B所示，基于流式單B細胞分選技術，作者成功表達了兩株E2抗原特異性單克隆抗體，即mAb3A9及mAb4F7。此外，進一步使用抗體亞型鑒定ELISA試劑盒鑒定兩株單抗的亞型，如圖4C所示，mAb3A9亞型為IgG1、kappa，mAb4F7為IgG2a、lambda亞型。

2.5 E2蛋白線性B細胞表位鑒定

單抗mAb3A9及mAb4F7純化及HRP標記后，用合成的overlap肽段檢測單克隆抗體的反應活性，如圖5A所示，單抗mAb3A9識別線性表位25GLTTTWKEYSHDLQL39，而mAb4F7識別線性表位259GNTTVKVHASDERGP273。同時，用BVDV及BDV陽性血清，進一步鑒定了線性B細胞表位的特異性，ELISA結果顯示，兩株單抗識別的線性表位不與BVDV及BDV發生交叉反應；然后，作者使用PyMOL 2.5軟件模擬了E2蛋白的3D立體結構，發現單抗mAb3A9及mAb4F7所識別的B細胞線性表位暴露于E2蛋白表面，與單抗時反應具有良好的可及性（圖5B）。

2.6 構建豬瘟E2單抗競爭ELISA

按照方法“1.8”中所述，構建豬瘟E2蛋白單抗競爭ELISA反應體系。采用棋盤滴定法梯度稀釋抗原，豬瘟標準陽性血清及陰性血清，如圖6A所示，以mAb3A9-HRP為指示抗體的競爭ELISA體系，即mAb3A9-bELISA，在血清稀釋度為1∶2，肽段包被濃度為50 ng·孔-1的條件下，具有較高的信噪比（N/P值=14.9）；同樣地，如圖6B所示，以mAb3A9-HRP為指示抗體的競爭ELISA體系，即mAb4F7-bELISA，在血清稀釋度為1∶2，肽段包被濃度為100 ng·孔-1的條件下，具有較高的信噪比（N/P值=16.5）。

2.7 評估單抗的診斷敏感性和特異性

為了進一步驗證mAb3A9及mAb4F7的特異性和敏感性，選取免疫背景清晰的血清樣本進行評價。其中，陰性血清樣本80份，部分樣本為口蹄疫陽性、豬圓環病毒陽性及豬流行性腹瀉病毒陽性，這些血清樣本用于評估單抗的特異性；E2亞單位疫苗免疫14、28、35和42 d的豬血清樣本160份；C株疫苗免疫14、28、35和42 d的豬血清樣本30份，這些具有不同的抗體滴度血清樣本，用于評估單抗的敏感性。如圖7A所示，在最佳檢測條件下，ROC曲線分析結果顯示，當臨界值為37.67%時，mAb3A9-bELISA的敏感性為97.49%，特異性為96.08%；同樣地，如圖7B所示，當臨界值為36.05%時，mAb4F7-bELISA的敏感性為95.97%，特異性為94.38%。上述結果表明，基于單B細胞分選技術制備的單抗mAb3A9和mAb4F7均具有優異的敏感性及特異性，完全可應用于豬瘟的臨床診斷。

2.8 臨床血清樣本檢測效果評價

首先，使用愛德士ELISA試劑盒檢測100份臨床血清樣本，根據商品化試劑盒的判定標準，其中36分血清樣本（阻斷率均lt;30%）為陰性血清，60份血清樣本（阻斷率gt; 40%）為陽性血清，另外4份血清樣本阻斷率介于30%～40%，不計入符合率統計；其次，使用mAb3A9-ELISA及mAb4F7-ELISA檢測96份血清樣本，結果顯示：mAb3A9-bELISA及mAb4F7-bELISA的總符合率分別為93.75%、90.62%，結果表明：與愛德士試劑盒比較，基于兩株單抗分別建立的ELISA檢測方法具有良好的整體符合率（見表4）。

3 討 論

豬瘟主要是通過口鼻直接接觸，間接接觸污染的飼料等傳播，或經胎盤垂直傳播［13-14］，根據其發病特點，可將豬瘟分為急性豬瘟、慢性豬瘟以及持續性感染豬瘟。根據CSFV 5′UTR、E2、NS5B部分序列的差異分析，CSFV毒株可分為3個基因型及11個亞基因型［15］。流行病學調查數據顯示，基因1、2和3型 CSFV毒株均在世界范圍內廣泛流行；其中，基因2型毒株因其較高的遺傳多樣性，成為豬瘟流行毒株。由于豬瘟病毒具有高度的傳染性和致病性，豬群感染后可見系統性病理特征，嚴重危害我國養殖業的健康發展［16-17］。因此，建立一種快速簡便的免疫學檢測方法來評估豬瘟E2亞單位疫苗和C株疫苗的免疫效果，能夠促進我國部分地區豬瘟疫情的防控。首先，作者構建了豬瘟E2抗原桿狀病毒表達載體，通過昆蟲表達系統懸浮表達了分泌型E2蛋白，每升培養基可高效表達6～8 mg蛋白；其次，12% SDS-PAGE電泳結果顯示（圖1），桿狀表達系統表達的E2抗原蛋白分子量大小約43 ku，不僅具有完整的糖基化修飾，且該抗原的反應原性及免疫原性均優于原核表達系統。

隨著單克隆抗體技術不斷發展，以抗體為關鍵生物活性分子的研究普遍應用于人類傳染病、腫瘤等疾病的治療等相關研究［18-20］。在動物疾病預防控制領域，單克隆抗體也有重要的應用價值。例如，在監測中和抗體消長規律，評價疫苗免疫效果，優化免疫接種程序及抗原檢測等方面，單克隆抗體發揮了不可或缺的作用［21］。從免疫系統角度出發，機體在接受抗原刺激后，能夠分化出大量特異性針對不同抗原的B細胞。基于克隆選擇理論，每一個B淋巴細胞只產生一種特異性的抗體。基于單個 B 細胞制備單克隆抗體的技術，能夠有效避免復雜的亞克隆篩選，克隆細胞系染色體丟失等問題。然而，該方法也存在一些固有的缺陷；值得注意的是，在進行半巢式PCR分別擴增IgG重鏈和輕鏈時，首先要通過RACE擴增分析E2抗原特異性抗體的可變區引物序列；其次，B細胞分選到96孔PCR板后，應立即進行RT-PCR反應，防止B細胞離體后抗體mRNA降解。

基于流式單B細胞分選技術，本研究成功制備了兩株不同亞型的E2單克隆抗體，并通過大量實驗，確定了該技術路線在單克隆抗體制備方法中的可行性。其次，通過表位鑒定及E2蛋白3D結構解析發現，單抗mAb3A9（IgG1，kappa）識別線性表位25GLTTTWK-EYSHDLQL39，而mAb4F7（IgG2a，lambda）識別線性表位259GNTTVKVHASDERGP273，單抗鑒定的B細胞線性表位均暴露于E2抗原結構表面，與單抗體識別時均展現出良好的可及性和反應活性。此外，基于上述單克隆抗體，作者構建了mAb3A9-bELISA及mAb4F7-bELISA，用于評估單抗的診斷性能。通過檢測豬瘟E2亞單位疫苗、C株免疫及陰性血清樣本，并結合ROC曲線統計分析（圖7），發現單抗mAb3A9和mAb4F7具有優異的敏感性及特異性，完全可應用于體外診斷。

為了驗證該檢測方法的可靠性，作者進一步分析了臨床樣本檢測數據，結果顯示：與豬瘟IDEXX試劑盒相比，mAb3A9-bELISA及mAb4F7-bELISA的整體符合率分別為93.75%、90.62%，表明基于單克隆抗體建立的競爭ELISA檢測方法不僅在操作上更加簡便，而且在臨床應用中具有更高的性價比。綜上所述，本研究新篩選的E2線性表位及基于單B細胞分選技術制備的單抗隆抗體，為豬瘟疫苗設計及臨床診斷提供了新的視角。

4 結 論

本研究應用流式單B細胞分選技術成功制備了兩株針對豬瘟病毒E2蛋白的不同亞型的單克隆抗體，并建立了相應的單抗競爭ELISA方法，用于評估豬瘟E2亞單位疫苗及C株弱毒疫苗的免疫效力，結果顯示，兩株單抗均體現出優異的敏感性和特異性，完全可應用于臨床診斷，該技術成果為我國豬瘟的逐步凈化提供了有利的技術支撐。

參考文獻（References）：

［1］ BLOME S， STAUBACH C， HENKE J， et al. Classical swine fever-an updated review［J］. Viruses， 2017， 9（4）：86.

［2］ MOENNIG V， FLOEGEL-NIESMANN G， GREISER-WILKE I. Clinical signs and epidemiology of classical swine fever：a review of new knowledge［J］. Vet J， 2003， 165（1）：11-20.

［3］ XIA S L， DU M L， LEI J L， et al. Piglets with maternally derived antibodies from sows immunized with rAdV-SFV-E2 were completely protected against lethal CSFV challenge［J］. Vet Microbiol， 2016， 190：38-42.

［4］ FAN S Q， WU K K， LUO C W， et al. Dual NDP52 function in persistent CSFV infection［J］. Front Microbiol， 2019， 10：2962.

［5］ ROSSI S， STAUBACH C， BLOME S， et al. Controlling of CSFV in European wild boar using oral vaccination：a review［J］. Front Microbiol， 2015， 6：1141.

［6］ TOLEDO J R， SNCHEZ O， MONTESINO R， et al. Highly protective E2-CSFV vaccine candidate produced in the mammary gland of adenoviral transduced goats［J］. J Biotechnol， 2008， 133（3）：370-376.

［7］ MAURER R， STETTLER P， RUGGLI N， et al. Oronasal vaccination with classical swine fever virus （CSFV） replicon particles with either partial or complete deletion of the E2 gene induces partial protection against lethal challenge with highly virulent CSFV［J］. Vaccine， 2005， 23（25）：3318-3328.

［8］ DESSAIN S K， ADEKAR S P， STEVENS J B， et al. High efficiency creation of human monoclonal antibody-producing hybridomas［J］. J Immunol Methods， 2004， 291（1/2）：109-122.

［9］ HOOGENBOOM H R. Selecting and screening recombinant antibody libraries［J］. Nat Biotechnol， 2005， 23（9）：1105-1116.

［10］ CORONELLA J A， TELLEMAN P， TRUONG T D， et al. Amplification of IgG VH and VL （Fab） from single human plasma cells and B cells［J］. Nucleic Acids Res， 2000， 28（20）：e85.

［11］ CORSIERO E， BOMBARDIERI M， CARLOTTI E， et al. Single cell cloning and recombinant monoclonal antibodies generation from RA synovial B cells reveal frequent targeting of citrullinated histones of NETs［J］. Ann Rheum Dis， 2016， 75（10）：1866-1875.

［12］ LI K， WANG S， CAO Y M， et al. Development of foot-and-mouth disease virus-neutralizing monoclonal antibodies derived from plasmablasts of infected cattle and their germline gene usage［J］. Front Immunol， 2019， 10：2870.

［13］ VAN RIJN P A， BOSSERS A， WENSVOORT G， et al. Classical swine fever virus （CSFV） envelope glycoprotein E2 containing one structural antigenic unit protects pigs from lethal CSFV challenge［J］. J Gen Virol， 1996， 77（Pt 11）：2737-2745.

［14］ WANG L H， MADERA R， LI Y Z， et al. Recent advances in the diagnosis of classical swine fever and future perspectives［J］. Pathogens， 2020， 9（8）：658.

［15］ DONG X N， CHEN Y H. Candidate peptide-vaccines induced immunity against CSFV and identified sequential neutralizing determinants in antigenic domain A of glycoprotein E2［J］. Vaccine， 2006， 24（11）：1906-1913.

［16］ ZHANG Y M， ZHANG W J， CHENG J， et al. Designing a novel E2-IFN-γ fusion protein against CSFV by immunoinformatics and structural vaccinology approaches［J］. Appl Microbiol Biotechnol， 2022， 106（9/10）：3611-3623.

［17］ ZHANG H W， WEN W， ZHAO Z K， et al. Enhanced protective immunity to CSFV E2 subunit vaccine by using IFN-γ as immunoadjuvant in weaning piglets［J］. Vaccine， 2018， 36（48）：7353-7360.

［18］ KIVI G， TEESALU K， PARIK J， et al. HybriFree：a robust and rapid method for the development of monoclonal antibodies from different host species［J］. BMC Biotechnol， 2016， 16：2.

［19］ LIAO X F， MAKRIS M， LUO X M. Fluorescence-activated cell sorting for purification of plasmacytoid dendritic cells from the mouse bone marrow［J］. J Vis Exp， 2016（117）：54641.

［20］ MENG W X， LI L K， XIONG W， et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single rhesus macaque antibody secreting cells［J］. mAbs， 2015， 7（4）：707-718.

［21］ CHANG C Y， HUANG C C， LIN Y J， et al. Antigenic domains analysis of classical swine fever virus E2 glycoprotein by mutagenesis and conformation-dependent monoclonal antibodies［J］. Virus Res， 2010， 149（2）：183-189.

（編輯 白永平）