B亞型禽偏肺病毒減毒株對商品肉雞免疫效果的評價

摘 要： 旨在研究B亞型禽偏肺病毒減毒株（LN16-A株）對商品肉雞的免疫效果。本研究從規模化養殖場選取3周齡的商品肉雞，將B亞型禽偏肺病毒減毒株（LN16-A株）通過滴鼻方式免疫（200 μL，病毒含量≥103 TCID50·只-1），空白對照組以同樣劑量的PBS滴鼻。免疫21 d后，翅下采集血液分離血清，利用ELISA方法及中和試驗檢測相應抗體；在6周齡時，通過滴鼻方式使用B亞型禽偏肺病毒強毒（LN16-V株）（200 μL，5 000 TCID50·只-1）進行攻毒，攻毒后連續觀察7 d，并利用RT-qPCR檢測各組雞鼻腔拭子的病毒拷貝數，攻毒后第9天各組隨機選取2只雞進行剖殺，采集鼻甲骨、氣管和肺組織，通過HE染色制作病理切片，觀察組織病理學變化。抗體檢測結果顯示，在疫苗免疫后21 d，免疫組ELISA抗體和中和抗體陽性率均為100%，平均ELISA抗體效價為1 860，平均中和抗體效價為7.44 log2；臨床癥狀觀察結果顯示，對照組商品肉雞出現混濁、黏稠、牽絲狀的鼻液等明顯臨床癥狀，發病率為100%，而免疫組肉雞無臨床癥狀；RT-qPCR結果表明，免疫組雞鼻腔拭子病毒基因組拷貝數相較于對照組降低了78%～96%；病理切片結果顯示，對照組肉雞鼻甲骨、氣管以及肺均出現不同程度的病理損傷，免疫組肉雞各組織器官未見明顯病理變化。綜上表明，B亞型禽偏肺病毒減毒株（LN16-A株）可以誘導商品肉雞產生特異性抗體，能顯著降低攻毒后的排毒水平，對商品肉雞具有良好的保護效果。本研究結果將為肉雞養殖場禽偏肺病毒病的防控提供重要理論指導和技術支撐。

關鍵詞： B亞型禽偏肺病毒；減毒株；商品肉雞；免疫效果

中圖分類號：S852.659.5

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）10-4597-08

收稿日期：2023-12-11

基金項目：國家肉雞產業技術體系（CARS-41）

作者簡介：許壯壯（1999-），男，山東菏澤人，碩士生，主要從事禽免疫抑制病研究，E-mail：xuzhuangzhuang21@163. com；王素艷（1990-），女，山東濟寧人，助理研究員，主要從事禽免疫抑制病研究，E-mail： wangsuyan@caas.cn。許壯壯和王素艷為同等貢獻作者

*通信作者：高玉龍，主要從事禽免疫抑制病防控技術研究，E-mail： gaoyulong@caas.cn

Evaluation of the Immune Efficacy of Attenuated Strain of Subtype B Avian Metapneumovirus

Disease on Commercial Broilers

XU" Zhuangzhuang1，2， WANG" Suyan1， CHEN" Yuntong1， ZHANG" Tao1， YU" Mengmeng1， MENG" Lingzhai

1， FAN" Wenrui1， QI" Xiaole1， GAO" Yulong1，2*

（1.Avian Immunosuppressive Diseases Division， State Key Laboratory for Animal Disease Control and

Prevention Harbin Veterinary Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Harbin 150069，" China;

2.College of Animal Science and Technology， Heilongjiang Bayi

Agricultural University， Daqing 163000，" China）

Abstract：" In order to study the immune effect of attenuated strain of subtype B avian metapneumovirus （LN16-A strain） on commercial broilers， 3-week-old commercial broilers were selected from large-scale farms and immunized with attenuated strain of subtype B avian metapneumovirus （LN16-A strain） by dropping nose （200 μL， virus content≥103 TCID50/piece）， and the blank control group was given the same dose of PBS. Twenty-one days after immunization， blood serum was collected under the wings and corresponding antibodies were detected using ELISA and neutralization tests. At 6-week-old， the B subtype avian metapneumonia virus （LN16-V strain） was administered via nasal drip （200 μL， 5000 TCID50 per chicken） to chickens for virus challenge. After the challenge， the virus copy number of nasal swabs from each group of chickens was continuously observed for 7 days. RT-qPCR was used to detect the virus copy number. On the 9th day after the challenge， 2 chickens from each group were randomly selected for dissection. Nasal turbinate， tracheal， and lung tissues were collected， and pathological sections were made using HE staining to observe the histopathological changes of the tissues. The results of antibody showed that 21 days after immunization， the positive rate of ELISA antibody and neutralizing antibody in the immunization group was 100%， with an average ELISA antibody titer of 1 860 and an average neutralizing antibody titer of 7.44 log2. The results of clinical symptoms showed that the commercial broilers in the control group had obvious clinical symptoms， such as cloudy， viscous， and filamentous nasal juice， and the incidence rate was 100%. While the broilers in the immunization group had no clinical symptoms. In addition， the results of RT-qPCR showed that the virus copy number of nasal swab in the immunization group decreased by 78% to 96%， compared to the control group. The results of pathological sections showed that the turbinate bone， trachea and lung of broilers in the control group had different degrees of pathological damage， while no obvious pathological changes were observed in the organs of broilers in the immunization group. The above results indicate that the attenuated strain of subtype B avian metapneumovirus （LN16-A strain） could induce the production of specific antibodies in commercial broilers， which could significantly reduce the virus shedding level of broilers after challenge， and had a good protective effect on commercial broilers. This study may provide important theoretical guidance and technical support for the prevention and control of avian metapneumovirus disease in large-scale broiler farms.

Key words： subtype B avian metapneumovirus; attenuated strain; commercial broilers; immune effect

*Corresponding author：" GAO Yulong， E-mail： gaoyulong@caas.cn

禽偏肺病毒（avian metapneumovirus，aMPV）屬于副黏病毒科、肺病毒亞科、偏肺病毒屬，其基因組為單股負鏈RNA，根據其編碼的G蛋白可將aMPV分為A、B、C和D四個基因亞型，遺傳進化樹分析顯示，A、B和D亞型同源性相近，而C亞型與人偏肺病毒同源性較高［1］。

aMPV主要感染雞和火雞，其次還可感染鴿、麻雀等鳥類，但這些鳥類并不易感，主要是攜帶和傳播病毒。aMPV感染雞后主要引起流鼻液、咳嗽、下頜與面部腫脹、歪頭斜頸、角弓反張等臨床癥狀，是肉雞腫頭綜合征和蛋雞產蛋下降的重要誘因［2］。火雞單一感染aMPV時，大約在感染14 d后即可恢復正常，但該病原極易引起其他呼吸道病原（包括細菌和病毒）的繼發感染，可顯著加劇臨床癥狀，并延長病程，死亡率高達40%［3］。

商品肉雞作為全球第一大肉類來源，因其生產頻率高，大大增加了各類病毒的感染概率。近年來，在世界各地發現，

B亞型偏肺病毒（subtype B avian metapneumovirus，aMPV/B）在商品肉雞中廣泛傳播。例如，2014—2016年，Tucciarone等［4］發現意大利北部的商品肉雞場普遍流行aMPV/B，陽性率達到58.7%。2016年，Franzo等［5］在羅馬尼亞商品肉雞中檢測到aMPV/B。2016—2018年，Hosseini等［6］發現伊朗不同省份商品肉雞群中，aMPV/B的陽性率逐年提高。2017—2018年，Lupini 等［7］發現位于法國西部的肉雞群中存在aMPV/B的感染。2017—2019年，研究人員在土耳其以及伊拉克的肉雞群中也均檢測到aMPV/B的存在［8-9］。

1998年，我國首次檢測到aMPV以來，研究人員對2009—2021年國內不同地區的雞場持續進行了血清學和病原學檢測，并對部分樣品中分離到的病毒進行序列分析，血清學檢測結果顯示，國內雞場普遍感染aMPV，部分雞場抗體陽性率甚至高達100%；病原學檢測和序列分析結果顯示，國內雞群主要感染aMPV/B，部分地區陽性率高達50.7%［10-12］，表明該病毒在我國流行地區廣泛，且其主要流行株為aMPV/B。2022年，我國從發病肉雞場的鼻甲骨樣品中分離到aMPV/B，經證明對SPF雞具有致病性［13］。另外本團隊前期分離的aMPV/B（LN16-V株）強毒感染對肉雞具有較強的致病性，可引起上呼吸道組織器官發生不同程度的炎癥反應和損傷［14］。目前國內外商品肉雞aMPV/B感染嚴重，可導致其生產性能下降，易感性增高，對生產造成嚴重的損失。

疫苗免疫是目前防控禽偏肺病毒病的主要措施。在國外利用弱毒活疫苗預防aMPV感染已被廣泛應用［15］，但我國還沒有商品化的弱毒疫苗用于禽偏肺病毒病的防控。本實驗室前期研制的B亞型禽偏肺病毒減毒株（LN16-A株）填補了我國aMPV弱毒活疫苗的空白，并且已經被證明可以完全保護SPF雞抵御aMPV/B強毒株的感染。商品肉雞中aMPV/B感染嚴重且危害較大，因此，本研究系統評價了B亞型禽偏肺病毒減毒株（LN16-A株）對商品肉雞的保護效果，對商品化肉雞養殖場禽偏肺病毒病的防控有重要參考價值。

1 材料與方法

1.1 病毒、細胞及實驗動物

B亞型禽偏肺病毒強毒株（LN16-V株）由本實驗室分離、鑒定并保存［16］；B亞型禽偏肺病毒減毒株（LN16-A株）為LN16-V株體外傳代致弱株（傳代30次）；Vero細胞由本實驗室保存；3周齡商品肉雞由哈爾濱益農禽業有限公司提供。

1.2 實驗試劑

DMEM細胞培養液購自Hyclone試劑公司（DMEM;C11995500BT）；胎牛血清購自ExCell Bio試劑公司（FBS;10091-148）；aMPV ELISA抗體檢測試劑盒購自美國IDEXX公司（99-44300）；反轉錄試劑盒HiScript Ⅱ QRT SuperMix for qPCR購自南京諾唯贊有限公司（R223）；THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix購自東洋紡生物科技有限公司（QPS-201）。

1.3 試驗設計

選取3周齡商品肉雞，隨機分成兩組：免疫組（n=10）和空白對照組（n=10），飼養于負壓隔離器中。免疫組雞采用滴鼻的方式接種（200 μL病毒含量≥103 TCID50·只-1）減毒株，空白對照組雞滴鼻200 μL無菌PBS。免疫后21 d，采血分離血清檢測ELISA抗體以及中和抗體。免疫后21 d，以滴鼻方式使用aMPV/B（LN16-V株）（200 μL，5 000 TCID50·只-1）對商品肉雞進行攻毒，攻毒后1～7 d觀察癥狀統計發病率，采集鼻腔拭子檢測排毒情況，攻毒后9 d隨機剖殺2只雞，采集鼻甲骨、氣管和肺臟組織觀察組織病理變化。

1.4 ELISA檢測各組雞血清抗體

免疫后21 d翅下采血，分離血清后經1∶500稀釋后，利用aMPV ELISA抗體檢測試劑盒檢測各組雞血清抗體水平。

1.5 各組雞血清中和抗體效價的測定

將“1.4”中分離的各組雞血清樣品于56 ℃滅活30 min，0.22 μm濾器過濾，2倍倍比稀釋（22～29）后，與aMPV/B（LN16-V株）（4 000 TCID50·mL-1）等體積混合，同時設置病毒對照和正常細胞對照，病毒對照使用無血清DMEM與病毒等體積混合。混合后于37 ℃孵育1 h。將100 μL的混合物加入96孔板中的Vero細胞中，每個樣品6個重復，37 ℃孵育1 h后更換為含1%血清的DMEM培養基，繼續培養并觀察細胞病變效應，連續記錄7 d。以陽性對照孔出現細胞病變，陰性對照細胞無異常變化，判定為結果有效，按照Reed-Muench方法計算中和抗體效價（效價gt;4 log2為陽性）。

1.6 各組雞排毒的熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測

采集“1.3”中各組雞攻毒后1～7 d的鼻腔拭子，溶于800 μL PBS中，渦旋振蕩混勻后300×g離心5 min，取上清（200 μL）用TRIzol試劑提取總RNA，根據制造商的說明書，使用反轉錄試劑盒HiScriptⅡQ RT SuperMix for qPCR，反轉錄為cDNA后作為模板，采用文獻［17］的熒光定量PCR方法檢測aMPV/B，使用文獻［18］設計引物及探針，引物由哈爾濱睿博興科公司合成，探針由金斯瑞生物科技股份有限公司合成（表1）。

1.7 攻毒后各組臟器組織病理學觀察

攻毒后9 d，各組隨機取2只雞進行剖殺，采集鼻甲骨、氣管和肺組織樣品，置于4%甲醛中固定，脫水后常規包埋，制作石蠟切片，HE染色后經顯微鏡觀察各組雞各臟器組織的病變情況。

1.8 數據的統計與分析

采用GraphPad軟件8.0.2進行數據統計分析，采用雙向方差分析各組間的差異性。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組雞免疫后血清抗體水平檢測

經B亞型禽偏肺病毒減毒株（LN16-A株）免疫后21 d，進行翅下采血并分離血清，利用ELISA試劑盒檢測血清中aMPV的抗體水平。結果表明，免疫后21 d，免疫組雞血清抗體全為陽性，陽性率為100%，平均抗體效價為1 860，最大值為2 472；而對照組血清抗體檢測結果全為陰性（圖1）。表明B亞型禽偏肺病毒減毒株（LN16-A株）能夠有效誘導商品肉雞產生aMPV的特異性抗體。

2.2 各組雞血清中和抗體效價的測定

采集并分離免疫21 d后的雞血清，使用固定病毒稀釋血清的方法檢測血清中和抗體效價，檢測結果顯示，免疫后21 d，雞血清中和抗體陽性率為100%，平均中和抗體效價為7.44 log2（表2）。結果表明，B亞型禽偏肺病毒減毒株（LN16-A株）可以誘導機體產生aMPV/B的特異性中和抗體。

2.3 各組雞攻毒后臨床癥狀觀察及發病率統計

在免疫后21 d，使用aMPV/B（LN16-V株）強毒進行攻毒，攻毒后連續觀察7 d。結果顯示，對照組雞在攻毒后第3天，開始出現混濁狀、牽絲狀鼻液，在攻毒后第6天，全部發病，累計發病率達到100%；而免疫組雞在攻毒后1～7 d均沒有出現臨床癥狀。表明，B亞型禽偏肺病毒減毒株（LN16-A株）能夠有效保護商品肉雞抵御aMPV/B強毒株的攻擊（圖2）。

2.4 各組雞攻毒后排毒檢測

攻毒后1～7 d，每天采集各組雞的鼻腔拭子，使用特異性引物，通過RT-qPCR法檢測各組雞只鼻腔拭子中的病毒拷貝數。結果顯示，對照組雞的鼻腔拭子病毒拷貝數在攻毒后1～4 d逐漸上升，且在第4天達到峰值，隨后5～7 d逐漸降低；而免疫組雞的鼻腔拭子中病毒拷貝數在攻毒后1～7 d均維持較低水平。在攻毒后2～6 d，免疫組雞鼻腔拭子中病毒拷貝數為526～5 336，而對照組雞鼻腔拭子中病毒拷貝數為7 997～47 872，免疫組相較于對照組雞鼻腔拭子病毒拷貝數降低了78%～96%（圖3）。結果表明，B亞型禽偏肺病毒減毒株（LN16-A株）能夠有效降低商品肉雞感染aMPV/B強毒后的排毒水平。

2.5 各組雞攻毒后臟器組織病理學觀察

在aMPV/B（LN16-V株）強毒攻毒后第9天，各組隨機剖殺2只雞，取鼻甲骨、氣管和肺組織，置于4%甲醛溶液中，浸泡24 h，制作病理組織切片。結果顯示，免疫雞攻毒后的病理切片未見明顯變化，鼻甲的鼻黏膜層未觀察到炎性細胞的浸潤和組織細胞的變性（圖4A），氣管和肺組織也無炎癥變化（圖4 B、C），免疫雞攻毒后病理切片顯示各組織狀態良好，無異常變化。對照組鼻甲骨黏膜層被破壞（箭頭a標記），大量炎性細胞浸潤（箭頭b標記）（圖4D）；氣管黏膜固有層被破壞，充血、出血，黏膜層內有炎性細胞浸潤（箭頭b標記）（圖4E）；肺間質增寬，毛細血管充血，肺泡內充滿嗜酸性滲出液，內含大量炎性細胞浸潤（箭頭b標記）（圖4G）。這些結果表明，B亞型禽偏肺病毒減毒株（LN16-A株）可以有效保護商品肉雞免受aMPV/B強毒株攻擊后引起的病理損傷。

3 討 論

自1980年aMPV首次被發現以來，目前已在世界范圍內廣泛流行，對家禽養殖業造成了巨大的損失。我國自1998年首次檢測到aMPV以來，陸續在不同地區檢測到該病毒的存在，部分雞群的抗體陽性率高達100%，表明我國雞群中aMPV感染嚴重。疫苗免疫是防控aMPV的重要手段，本團隊前期利用國內分離的aMPV/B毒株研制了B亞型禽偏肺病毒減毒株（LN16-A株），已證實其對SPF雞具有良好的保護效果。由于國內外的商品肉雞群均有aMPV/B感染的報道，且危害嚴重，因此本研究系統評估了該疫苗對商品肉雞的保護效果，為商品化肉雞養殖場禽偏肺病毒病的防控提供理論指導。

aMPV主要存在于雞的鼻甲骨、氣管等上呼吸道組織器官中［19］，可通過直接接觸或空氣進行傳播。研究表明，aMPV是引起肉雞腫頭綜合征和蛋雞產蛋下降的重要誘因，當繼發其他病原時，感染雞病情加重，雞群死亡率升高［5］。本研究發現，B亞型禽偏肺病毒減毒株（LN16-A株）免疫后21 d，免疫組商品肉雞的ELISA抗體和中和抗體陽性率均為100%，且平均中和抗體水平達到了7.44 log2，表明該疫苗在一次免疫后21 d，可誘導產生較高水平的中和抗體，能誘導機體產生較好的體液免疫反應。另外，攻毒后免疫組雞相較于對照組雞的鼻腔拭子病毒拷貝數降低了78%～96%，說明該疫苗免疫后顯著降低了雞群的排毒水平，大大減少了免疫后雞群之間病毒傳播的風險。組織病理學結果表明，對照組雞上呼吸道黏膜出現不同程度的損傷，并伴有炎性細胞浸潤，而免疫組未見明顯病理變化。aMPV單獨感染一般不會引起雞群死亡，但繼發其他病原時，雞群死亡率明顯升高，這與aMPV感染引起的呼吸道組織損傷以及造成繼發感染密切相關［5］，因而該疫苗免疫能有效保護野毒對雞群呼吸道黏膜的損傷，減少繼發感染的可能。

疫苗接種是防控aMPV的主要手段，國外已有批準上市的禽偏肺病毒病弱毒疫苗，并在家禽養殖企業得到了廣泛應用，而我國目前還沒有商品化的禽偏肺病毒病弱毒疫苗。前期作者評價了B亞型禽偏肺病毒病滅活疫苗（LN16-I株）對商品肉雞的免疫保護效果，發現加強免疫后，攻毒保護率為88.9%［18］。本研究中B亞型禽偏肺病毒減毒株（LN16-A株）單次免疫后，對商品肉雞的攻毒保護率為100%，且能誘導機體產生高水平的中和抗體，能顯著降低雞群的排毒率和組織病理損傷，表明該疫苗單次免疫就能對商品肉雞群提供良好的保護。

4 結 論

本研究表明，B亞型禽偏肺病毒減毒株（LN16-A株）免疫后可誘導商品肉雞產生較高水平的中和抗體，能完全抵抗aMPV/B強毒株的攻擊，顯著降低攻毒后的排毒水平，保護鼻甲骨、氣管和肺臟組織免受病理損傷。這些結果表明B亞型禽偏肺病毒減毒株（LN16-A株）對商品肉雞具有良好的保護效果，為養殖場商品肉雞群aMPV的有效防控提供了重要技術支撐。

參考文獻（References）：

［1］ TOQUIN D， B?YON-AUBOYER M H， SENNE D A， et al. Lack of antigenic relationship between French and recent North American non-A/non-B turkey rhinotracheitis viruses［J］. Avian Dis， 2000， 44（4）：977-982.

［2］ TANAKA M， TAKUMA H， KOKUMAI N， et al. Turkey rhinotracheitis virus isolated from broiler chicken with swollen head syndrome in Japan［J］. J Vet Med Sci， 1995， 57（5）：939-941.

［3］ COOK J K A， ELLIS M M， HUGGINS M B. The pathogenesis of turkey rhinotracheitis virus in turkey poults inoculated with the virus alone or together with two strains of bacteria［J］. Avian Pathol， 1991， 20（1）：155-166.

［4］ TUCCIARONE C M， FRANZO G， LUPINI C， et al. Avian metapneumovirus circulation in Italian broiler farms［J］. Poult Sci， 2018， 97（2）：503-509.

［5］ FRANZO G， TUCCIARONE C M， ENACHE M， et al. First report of avian metapneumovirus subtype B field strain in a Romanian broiler flock during an outbreak of respiratory disease［J］. Avian Dis， 2017， 61（2）：250-254.

［6］ HOSSEINI H， KAFI Z Z， MALEKAN M， et al. Molecular characterization of circulating avian metapneumovirus， subgroup B， in broiler chickens， Iran， 2016-2018［J］. Iran J Vet Res， 2021， 22（3）：217-221.

［7］ LUPINI C， TUCCIARONE C M， MESCOLINI G， et al. Longitudinal survey on aMPV circulation in French broiler flocks following different vaccination strategies［J］. Animals （Basel）， 2022， 13（1）：57.

［8］ BAYRAKTAR E， UMAR S， YILMAZ A， et al. First molecular characterization of avian metapneumovirus （aMPV） in Turkish broiler flocks［J］. Avian Dis， 2018， 62（4）：425-430.

［9］ AL-HASAN B A， ALHATAMI A O， ABDULWAHAB H M， et al. First report of Avian metapneumovirus type B in Iraqi broiler flocks with swollen head syndrome［J］. Vet World， 2022， 15（1）：16-21.

［10］ 沈瑞忠， 曲立新， 于康震， 等. 禽肺病毒的分離鑒定［J］. 中國預防獸醫學報， 1999， 21（1）：79-80.

SHEN R Z， QU L X， YU K Z， et al. Isolation and characterization of an avian pneumovirus from chickens in China［J］. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine， 1999， 21（1）：79-80. （in Chinese）

［11］ 朱艷梅， 宮 曉， 郭偉偉， 等. 2012年—2015年我國部分地區禽偏肺病毒的分子流行病學分析［J］. 動物醫學進展， 2016， 37（10）：30-33.

ZHU Y M， GONG X， GUO W W， et al. Molecular epidemiology analysis of aMPV in some regions in China during 2012 to 2015［J］. Progress in Veterinary Medicine， 2016， 37（10）：30-33. （in Chinese）

［12］ 贠炳嶺， 劉在斯， 吳 關， 等. 我國部分地區種雞禽肺病毒感染的血清學調查［J］. 中國家禽， 2012， 34（12）：64-65.

YUN B L， LIU Z S， WU G， et al. Serological investigation of pneumo virus infection in breeding chickens and poultry in some areas of China［J］. China Poultry， 2012， 34（12）：64-65. （in Chinese）

［13］ 于蒙蒙， 包媛玲， 王素艷， 等. B亞型禽偏肺病毒的分離鑒定及致病性研究［J］. 畜牧獸醫學報， 2022， 53（10）：3540-3549.

YU M M， BAO Y L， WANG S Y， et al. Isolation， identification and pathogenicity of Subtype B avian metapneumovirus［J］. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica， 2022， 53（10）：3540-3549. （in Chinese）

［14］ 馮笑艷， 包媛玲， 于蒙蒙， 等. B亞型禽偏肺病毒對商品肉雞的致病性研究［J］. 中國預防獸醫學報， 2022， 44（10）：1034-1038.

FENG X Y， BAO Y L， YU M M， et al. Study on pathogenicity of B subtype avian metapneumovirus to commercial broilers［J］. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine， 2022， 44（10）：1034-1038. （in Chinese）

［15］ PATNAYAK D P， GOYAL S M. Cold-adapted strain of avian pneumovirus as a vaccine in one-day-old turkeys and the effect of inoculation routes［J］. Avian Dis， 2004， 48（1）：155-159.

［16］ YU M M， XING L X， CHANG F F， et al. Genomic sequence and pathogenicity of the first avian metapneumovirus subtype B isolated from chicken in China［J］. Vet Microbiol， 2019， 228：32-38.

［17］ CECCHINATO M， LUPINI C， POGORELTSEVA O S M， et al. Development of a real-time RT-PCR assay for the simultaneous identification， quantitation and differentiation of avian metapneumovirus subtypes A and B［J］. Avian Pathol， 2013， 42（3）：283-289.

［18］ 包媛玲， 何錫棟， 于蒙蒙， 等. B亞型禽偏肺病毒滅活疫苗對商品肉雞免疫效果的研究［J］. 中國預防獸醫學報， 2022， 44（10）：1071-1075.

BAO Y L， HE X D， YU M M， et al. Study on immune effect of inactivated vaccine of avian metapneumovirus （subtype B） on commercial broiler chickens［J］. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine， 2022， 44（10）：1071-1075. （in Chinese）

［19］ SALLES G B C， PILATI G V T， MUNIZ E C， et al. Trends and challenges in the surveillance and control of avian metapneumovirus［J］. Viruses， 2023， 15（9）：1960.

（編輯 白永平）