穩定表達豬 BRD4-BD1/2 蛋白的豬肺泡巨噬細胞傳代細胞系的構建及其用于 ASFV 增殖的效果觀察

摘 要： 前期研究發現宿主表觀遺傳調控蛋白——含溴結構域蛋白質4（bromodomain-containing protein 4， BRD4）有助于非洲豬瘟病毒 （African swine fever virus， ASFV） 的復制，為了深入研究 BRD4 對 ASFV 復制的影響，通過篩選出顯著促進 ASFV 復制的 BRD4-BD1/2 結構域，利用慢病毒表達系統成功構建穩定表達 BRD4-BD1/2 結構域的 3D4/21 細胞系，分析 ASFV 在 3D4/21-BRD4-BD1/2 細胞系與 WT 細胞系之間的復制差異。首先，以家豬基因 BRD4-BD1/2 為靶標，構建了含有 3x Flag 標簽的重組質粒 pLVX-IRES-puro-3x Flag-BRD4-BD1/2，并將其與質粒 pMD2.G 和 pSPAX2 共同轉染至 HEK-293T 細胞進行慢病毒包裝，獲得具有感染能力的慢病毒。使用慢病毒感染 3D4/21 細胞后通過嘌呤霉素藥物篩選，成功獲得了穩定表達 BRD4-BD1/2 結構域的 3D4/21 細胞系。利用 RT-qPCR 和 Western blot 技術分別檢測了 ASFV 感染 3D4/21-BRD4-BD1/2 細胞后 CP204L 和 B602L 基因的轉錄水平以及相應蛋白表達水平，并通過 HAD50 測定評價 ASFV 的復制能力。研究結果表明：成功構建了穩定表達 BRD4-BD1/2 結構域的 3D4/21 細胞系。與 3D4/21-WT 細胞系相比，BRD4-BD1/2 穩定表達細胞系能夠顯著促進 ASFV 復制。本研究提供了深入研究 BRD4 蛋白在 ASFV 復制中功能的生物材料，并為 ASFV 疫苗候選株的開發提供了理論基礎。

關鍵詞： 非洲豬瘟病毒；BRD4；BD1/2；3D4/21 細胞；穩定表達細胞系

中圖分類號：S852.65

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）10-4646-14

收稿日期：2023-11-29

基金項目：國家自然基金面上項目（32072830）; 國家重點研發計劃（2021YFD1800101）;甘肅省重大專項計劃項目（22ZD6NA001）; 中央級公益性科研院所基本科研業務費專項（CAAS-ZDRW202409）; 甘肅省基礎研究創新群體項目（22JR5RA024）和特派團項目（22CX8NA011）; 中國農業科學院科技創新工程（CAAS-ASTIP-2021-LVRI）

作者簡介：吳夢麗（1999-），女，河南鄭州人，碩士，主要從事動物病毒學研究， E-mail：15238649312@163.com

*通信作者：牛慶麗，主要從事預防獸醫學研究，E-mail： niuqingli@caas.cn

Construction of a Passaged Porcine Alveolar Macrophage Cell Line Stably Expressing the

Porcine BRD4-BD1/2 Protein and Its Effects on ASFV Proliferation

WU Mengli1，2， SUN" Hualin1，2， YANG" Jifei1，2， ZHAO" Yaru1，2， GUAN" Guiquan1，2， YIN" Hong1，2， 3，

NIU" Qingli1，2*

（1.State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention， College of Veterinary Medicine，

Lanzhou University， Lanzhou Veterinary Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences，

Lanzhou" 730000，" China;

2.African Swine Fever Regional Laboratory of China （Lanzhou）

， Gansu Province Research Center for Basic Disciplines of Pathogen Biology， Lanzhou" 730046，

China;

3.Jiangsu Co-Innovation Center for the Prevention and Control of Important Animal Infectious

Disease and Zoonosis， Yangzhou University， Yangzhou" 225009，" China）

Abstract：" Previous studies have identified that the host epigenetic regulator， bromodomain-containing protein 4 （BRD4） facilitates the replication of the African swine fever virus （ASFV）. To further investigate the impact of BRD4 on ASFV replication， the BRD4-BD1/2 domain， which significantly enhances ASFV replication， was identified. Using a lentiviral expression system， a stably expressing 3D4/21 cell line of the BRD4-BD1/2 domain was successfully constructed to analyze replication differences between the 3D4/21-BRD4-BD1/2 cell line and the wild-type （WT） cell line. Initially， a recombinant plasmid， pLVX-IRES-puro-3x Flag-BRD4-BD1/2， targeting the porcine gene BRD4-BD1/2 and containing a 3x Flag tag， was constructed. This plasmid， along with plasmids pMD2.G and pSPAX2， was transfected into HEK-293T cells for lentiviral packaging to obtain infectious lentiviruses. Following lentiviral infection of 3D4/21 cells and selection with puromycin， a cell line stably expressing the BRD4-BD1/2 domain was established. The transcription levels of ASFV genes CP204L and B602L， and the expression levels of their corresponding proteins in ASFV-infected 3D4/21-BRD4-/BD1/2 cells， were detected using RT-qPCR and Western blot techniques， respectively. ASFV replication capacity was assessed using the HAD50 assay. The results showed that the stably expressing BRD4-BD1/2 domain in the 3D4/21 cell line significantly enhanced ASFV replication compared to the 3D4/21-WT cell line. This study provides biological material for in-depth research on the function of the BRD4 protein in ASFV replication and lays a theoretical foundation for the development of ASFV vaccine candidates.

Key words： African swine fever virus; BRD4; BD1/2; 3D4/21 cells; stable expression cell lines

*Corresponding author：" NIU Qingli， E-mail： niuqingli@caas.cn

非洲豬瘟 （African swine fever） 是一種能引起豬嚴重高熱的出血性疾病，病原為非洲豬瘟病毒 （African swine fever virus， ASFV）［1］。ASF 的臨床癥狀根據感染病毒毒株的毒力可以分為最急性型、急性型、亞急性型和慢性型。一般潛伏期約為 15 d，而重癥感染的個體可能在感染后 2～10 d 內死亡［2-3］。ASF 能夠感染家豬和野豬，致死率可達 100%，對全球豬業和農業經濟產生嚴重影響［4-5］。

ASFV 是非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬的唯一成員，是一種復雜的大型二十面體雙鏈 DNA 病毒。其結構包括病毒基因組、內核、內膜、衣殼和囊膜［6］。病毒復制主要發生在宿主細胞質內，涉及四個不同的轉錄階段，包括即刻早期、早期、中期和晚期［7］。感染的主要細胞類型包括單核細胞和巨噬細胞，它們通過吞噬作用和抗原呈遞等機制在免疫反應中發揮關鍵作用［8-9］。

盡管原代肺泡巨噬細胞 （pulmonary alveolar macrophage，PAMs） 是目前用于研究 ASFV 感染機制和病毒復制動力學的首選細胞，但受個體差異限制以及其缺乏商業化性能，使其在某些情況下不夠理想。3D4/21 （ATCC CRL-2843）細胞是用 pSV3neo 質粒轉染原代豬肺泡巨噬細胞培養物后，建立了豬單髓細胞系3D4，通過 G-418 篩選建立。盡管其感染后病毒復制能力有限，但其作為一種宿主源性的體外連續傳代細胞系，可用于病毒感染后的免疫反應和病毒與宿主之間相互作用的機制研究［10］。

含溴結構域蛋白質4（bromodomain-containing protein 4， BRD4） 作為一種關鍵的表觀遺傳調節蛋白和轉錄調節因子，在多個生物學過程中發揮重要作用，包括轉錄調控、細胞周期控制、癌癥和病毒感染等［11-12］。BRD4 包括兩個高度保守的 N 端溴結構域（BD1和BD2），可識別組蛋白和非組蛋白上的乙酰賴氨酸殘基，同時還包含一個參與蛋白質互作的 ET 結構域。研究表明，BRD4 在人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）、人乳頭瘤病毒（human papillomaviruses，HPV）、單純皰疹病毒（herpes simplex virus，HSV）等多種病毒感染中發揮關鍵作用［13-15］。Wang等［16］還發現通過抑制 BRD4 蛋白的表達，可以激活 DNA 損傷相關的 cGAS-STING 通路，從而激發抗病毒天然免疫反應。

BRD4 是 BET 家族中的一種關鍵蛋白質，由兩個溴結構域（BD1 和 BD2）和一個額外的末端域（ET）組成。它的兩個溴結構域（BD1 和 BD2）對于 BRD4 發揮功能至關重要，通過識別并結合到乙?；M蛋白和一系列非組蛋白質上，從而影響基因的轉錄活性，ET 結構域在轉錄激活中發揮關鍵作用。BD1 通常與基因轉錄的啟動和激活相關，而 BD2 則在轉錄延伸和后續步驟中發揮作用，這種功能上的差異反映了 BRD4 在基因表達調控中的復雜性和多樣性［17］。為了深入研究 ASFV 感染過程中 BRD4 不同結構域的作用，分別構建了帶有 3x Flag 標簽的 BRD4 全長、 BD1/2 結構域以及 BD1 截短體質粒。通過 Western blot 在蛋白水平上檢測 BRD4、BD1/2、BD1 對 ASFV 復制的影響，結果表明 BRD4-BD1/2 對 ASFV 復制具有明顯的促進作用。

鑒于 BRD4-BD1/2 結構域的重要性，作者進一步應用慢病毒包裝技術成功構建了穩定表達 BRD4-BD1/2 的 3D4/21 細胞系。慢病毒 （lentivirus）包裝系統構建是將外源基因整合到宿主細胞基因組中，以實現外源基因長期穩定表達的方法。這一技術廣泛應用于研究特定蛋白或病毒功能，例如，ASFV-E165R 蛋白在 PK-15 細胞中的穩定表達［18］；ASFV-D1133L 蛋白在 MA-104 細胞中的穩定表達［19］；宿主 HDAC6 蛋白在 Vero 細胞中的穩定表達等［20］。本研究中，作者發現穩定表達 BRD4-BD1/2 結構域可顯著促進 ASFV 的復制，證明了 BRD4-BD1/2 在 ASFV 復制中的重要性?？偠灾髡呃寐《景b技術成功構建了穩定表達 BRD4-BD1/2 結構域的 3D4/21 細胞系，并驗證了其對 ASFV 復制的促進作用。這為進一步研究 BRD4 在 ASFV 感染中的作用機制提供了基礎，同時為病毒增殖和疫苗生產提供了生物學材料。

1 材料與方法

1.1 細胞與病毒

豬肺泡巨噬細胞（3D4/21）和人胚胎腎細胞 （HEK-293T）由本實驗室保存。慢病毒包裝質粒 pLVX-IRES-Puro、pMD2.G 和 pSPAX2 均由本實驗室保存。ASFV 基因 II 型強毒株 ASFV CN/GS/2018，ASFV 綠色熒光蛋白表達株 （ASFV-EGFP） 是以 ASFV CN/GS/2018 的親本株構建了僅插入 EGFP-Tag 的重組病毒，由中國農業科學院蘭州獸醫研究所國家非洲豬瘟區域實驗室（蘭州）構建并保存。

1.2 試劑和抗體

胎牛血清 （FBS）、0.25% EDTA-Trypsin、嘌呤霉素、RPMI 1640 培養基和高糖 DMEM 培養基、RIPA 裂解液均購于 Thermo Scientific 公司。青霉素-鏈霉素-兩性霉素（三抗）購于北京索萊寶公司。限制性內切酶 EcoRⅠ和 BamHⅠ、DNA 聚合酶、T4 DNA 連接酶均購于 NEB 公司。反轉錄試劑盒購自 TaKaRa 公司。膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒購自南京諾唯贊公司。Cell Counting Kit-8 （CCK8） 購自 APExBIO Technology LLC 公司。小鼠抗 β-actin 單克隆抗體、小鼠抗 Flag 單克隆抗體和山羊抗小鼠IgG抗體購自英濰捷基（上海）貿易有限公司。小鼠抗 ASFV-p30 單克隆抗體，小鼠抗 ASFV-p72 單克隆抗體由本實驗室制備并保存。

1.3 篩選影響ASFV增殖的BRD4結構域

分別構建帶有 3x Flag 標簽的 BRD4 全長、BD1/2 結構域以及 BD1 截短體質粒并轉染至 3D4/21 細胞，隨后將細胞置于 37 ℃ 含 5% CO2的培養箱中培養 24 h，用含 2% FBS的 RPMI 1640 培養基進行培養，感染 ASFV 24 hpi 后，收集細胞樣品進行 Western blot 分析，以評估過表達 BRD4 全長及截短體對 ASFV 復制的影響。

1.4 引物設計和質粒構建

根據 NCBI 數據庫中 Sus scrofa BRD4 基因序列（ID： 100533540），設計針對 BRD4-BD1/2 結構域的特異性引物，并插入限制性內切酶 5′ EcoRⅠ和3′ BamHⅠ位點，擴增目的片段，以慢病毒表達載體 pLVX-IRES-Puro 為載體，酶切載體與目的片段后，使用 T4 連接酶進行連接，經轉化，涂板，測序鑒定正確后得到重組質粒，命名為 pLVX-FLAG-BRD4-BD1/2。

1.5 重組慢病毒包裝和穩定表達細胞系的建立

HEK-293T 細胞在生長狀態良好時鋪至 60 mm 細胞培養皿中，細胞密度約 80% 時，按照 jet PRIME 的說明，將 pLVX- FLAG-BRD4-BD1/2 （3 μg）、pMD2.G （2 μg）、psPAX2 （1 μg） 共同轉染至 HEK-293T 細胞中。轉染后 48 h 后，收集細胞及上清培養液，以 3000 r·min-1 離心 10 min 后，將上清凍存于 -80 ℃。當 3D4/21 細胞密度達到 30%～50% 時感染上述包裝好的慢病毒，感染 48 hpi 后使用 5 μg·mL-1 嘌呤霉素進行篩選。將篩選得到的細胞稀釋后均勻接種于 96 孔板中，以確保平均每個孔只接種 1 個，以獲得單克隆細胞，繼續在含有 5 μg·mL-1 的嘌呤霉素培養基中擴大培養。

1.6 穩定表達細胞系的驗證

采用 PCR 和 Western blot 方法對上述收集的細胞樣品中的 BRD4-BD1/2 表達情況進行鑒定。PCR結果顯示，3D4/21-BRD4-BD1/2 細胞系在 2 000 bp 處出現與預期一致的目的條帶。

將上述細胞連續傳代培養 10 代后的細胞一部分加入 RIPA 裂解液和 5×loading Buffer，取 20 μL 蛋白上樣量進行 SDS-PAGE，電泳結束后將蛋白用 90 V 恒壓轉印至 PVDF 膜，用 TBST 配制的 5% 的脫脂奶粉溶液室溫封閉 2 h，隨后加入相應小鼠抗Flag單克隆抗體4 ℃過夜孵育，用 TBST 洗 3 次后加入相應的山羊抗小鼠IgG抗體，室溫孵育 1 h，最后用 ECL 化學發光底物全自動化學發光成像分析。

1.7 不同代次穩定表達細胞系細胞活性的測定

使用 CCK-8 檢測方法測定細胞活性，分別將篩選得到的生長狀態良好的 3D4/21-BRD4-BD1/2 細胞和陰性對照 3D4/21-WT 細胞均以每孔 104 個均勻接種至 96 孔板中。分別設置了不同的時間點（12、24、36、48 h）以及不同代次（F10、F20、F30）兩種細胞培養相同的時間，向板孔中加入 10 μL CCK-8 溶液，每個時間點做 3 次重復。將 96 孔板放在 37℃、5% CO2 條件下，避光孵育 2 h。使用酶標儀測量 450 nm 波長下各孔的 OD 值。

1.8 穩定表達 BRD4-BD1/2 細胞系對 ASFV 增殖的影響

1.8.1 RT-qPCR 檢測病毒 mRNA 轉錄水平

通過 Trizol 法提取細胞總 RNA，并反轉錄為 cDNA，再以 cDNA 為模板進行 Real-time qPCR，以豬的 GAPDH 基因作為內參，檢測目的基因的轉錄水平。根據 NCBI 數據庫 ASFV CP204L 基因序列 （GenBank： MK333184.1）， ASFV B646L 基因序列 （GenBank： MK333180.1），豬 GAPDH 基因序列（GenBank： NM 001206359.1）設計的引物序列如表1。

1.8.2 Western blot 檢測病毒蛋白表達情況

3D4/21-BRD4-BD1/2 和 3D4/21-WT 細胞接種于 12 孔板，分別以不同 MOI （0、0.1、1、2） 或不同感染時間 （12、24、36、48 hpi） 感染 ASFV CN/GS/2018，收集細胞樣品并使用 RIPA 裂解液裂解蛋白，4 ℃、12 000 r·min-1 離心 10 min 后收集上清液加入 5×loading buffer，金屬浴高溫變性后進行 SDS-PAGE，電泳結束后 100 V，1 h 30 min 恒壓轉印至 NC 膜上。轉印完成后，使用含 5% 脫脂奶粉的 TBST 緩沖溶液將 NC 膜至室溫封閉 2 h 后，用 TBST 洗膜 5 次，每次 5 min；按照比例稀釋 αnti-Flag （1∶1 000），αnti-β-actin （1∶5 000），αnti-p30 （1∶1 000），αnti-p72 （1∶1 000） 抗體，4 ℃ 過夜孵育；TBST 洗膜 5 次，每次 5 min；加入 1∶10 000 稀釋的 HRP-conjugated Afinipure Goat Anti-Rabbit IgG（H+L），Goat αnti-Mouse 二抗室溫孵育 2 h；TBST 洗膜 5 次；最后，使用 ECL 化學發光底物進行成像和分析。

1.9 紅細胞吸附現象（HAD50）測定

將 3D4/21-BRD4-BD1/2 細胞與 3D4/21-WT 細胞同時感染 ASFV （MOI=1） 36 hpi 后，收集上清，并于 -80 ℃ 進行多次反復凍融。隨后 1 200 r·min-1離心 10 min，取 100 μL 病毒上清液進行 10-1～10-8 倍梯度稀釋，然后接種到鋪滿 PAM 細胞的 96 孔細胞培養板中。每孔加入 25 μL 1% 的豬紅細胞，每個稀釋梯度設置 8 個重復，37℃ 培養箱中培養 5～7 d，每天觀察細胞及玫瑰花環數。根據 Reed-Muench 法計算病毒滴度。

1.10 不同代次 3D4/21-BRD4-BD1/2 細胞系對ASFV復制的影響

為了研究不同代次細胞系對于 ASFV 復制的影響，分別將 3D4/21-BRD4-BD1/2 和 3D4/21-WT 在 37℃、5% CO2 培養箱中培養至所需要的代次。分別選取了第 10、20、30 代細胞，將其接種到 12 孔板中，感染 ASFV CN/GS/2018。在感染后的特定時間點（12、24、36、48 hpi）收集細胞樣品，通過 Western blot 評估不同代次細胞系對于病毒復制的影響。

使用免疫熒光檢測不同代次（F10、F20、F30）穩定表達細胞系的穩定表達情況。使用熒光標記的二抗檢測 Flag-BRD4-BD1/2 的表達情況，并對不同代次細胞系進行比較。

1.11 數據分析

使用 GraphPad Prism 軟件進行數據分析和圖形繪制，采用獨立樣本 t 檢驗進行顯著性分析。ns.Pgt;0.05 說明數據間無顯著差異，*.P≤0.05 說明數據間有顯著差異，**. P ≤0.01 說明數據間有極顯著差異。***. P≤0.001 表明數據間差異具有極高的統計顯著性。****. P≤0.0001。

2 結 果

2.1 BRD4-BD1/2促進 ASFV 的復制

為了探究 BRD4 及其溴結構域對于 ASFV 復"" 制的影響，分別構建 BRD4、BD1/2 和 BD1 的截短體轉染細胞后感染 ASFV，利用 Western blot 及 RT-qPCR 檢測其對 ASFV 復制的影響。

結果表明，轉染 BRD4-BD1/2 結構域顯著提高了 ASFV B646L 基因及其編碼的 p72蛋白和 CP204L 基因及其編碼的 p30 蛋白表達水平。這一結果表明，BRD4的 BD1/2 結構域在 ASFV 復制中發揮了明顯的促進作用（圖1B～D）。

2.2 重組慢病毒質粒的構建

本研究以 pLVX-IRES-Puro 質粒為骨架構建了含有 Flag 標簽的 BRD4-BD1/2 基因的重組質粒。為了驗證構建的載體，進行了 EcoRⅠ 和 BamHⅠ 限制性內切酶的雙酶切試驗。通過瓊脂糖凝膠電泳分析，觀察到兩條明顯的 DNA 條帶。

其中一條約為 5 000 bp，對應切割后的載體條帶，另一個約為 2 000 bp，與預期的 BRD4-BD1/2 的目的基因片段大小相符。結果表明慢病毒表達載體 pLVX-IRES-Puro-3x Flag- BRD4-BD1/2 構建成功（圖 2）。

2.3 3D4/21-BRD4-BD1/2 細胞系的鑒定

通過慢病毒包裝系統感染 3D4/21-WT 細胞后，觀察到細胞形態并未顯著改變，嘌呤霉素篩選后能夠正常傳代培養。通過篩選出的陽性克隆細胞連續傳代后，提取穩定表達 BRD4-BD1/2 基因的細胞系的總蛋白。通過 Western blot 檢測，發現傳代培養的 3D4/21-BRD4-BD1/2 細胞系中 BRD4-BD1/2 基因能夠穩定表達（圖 3）。

2.4 細胞活性檢測

使用 CCK-8 測定3D4/21-BRD4-BD1/2 和 3D4/21-WT 細胞的細胞活性。分別在不同時間點（12、24、36和48 h）以及不同代次的細胞（F10、F20、F30），通過測量 450 nm 波長下的 OD 值。結果顯示，各時間點及各代次細胞的兩種細胞系的細胞活性沒有顯著差異。盡管 3D4/21-BRD4-BD1/2 細胞經過改造，但其細胞活性與 WT 細胞相比，細胞活性正常，無顯著差異（Pgt;0.05）（圖 4 A、B）。

2.5 BRD4-BD1/2 穩定表達細胞系促進 ASFV 復制

為了比較分析 ASFV-EGFP 毒株在 3D4/21-BRD4-BD1/2 和 3D4/21-WT 細胞中的增殖能力，作者分別在這兩種細胞系中進行了 ASFV-EGFP 的感染試驗。兩種細胞系均在不同的病毒滴度（MOI 分別為0、0.1、1、2）下進行了 ASFV-EGFP 感染。隨后在感染后 36 hpi 觀察熒光強度。在前期研究中發現，病毒感染 24 hpi 時 Western blot 結果并不能明顯檢測到 ASFV 主要結構蛋白 p72 的表達，而在 36 hpi 時能夠明顯檢測到其表達，因此作者選擇 36 hpi 作為主要的試驗時間點。

試驗結果顯示在感染后 36 hpi，與 3D4/21-WT 相比，穩定表達 BRD4-BD1/2 細胞中的熒光強度顯著增強，這表明 3D4/21-BRD4-BD1/2 細胞系能夠促進 ASFV-EGFP 復制（圖 5）。

2.6 不同 MOI ASFV 感染 3D4/21-BRD4-BD1/2 細胞系對 ASFV 增殖的影響

為了分析不同 MOI （0、0.1、1、2） ASFV CN/GS/2018 在 3D4/21-BRD4-BD1/2和 3D4/21- WT 細胞中的復制能力，分別將兩種細胞接種到 12 孔板，待細胞密度長至 70%，分別以不同 MOI （0、0.1、1、2） 的 ASFV CN/GS/2018 毒株感染兩種細胞。感染后 36 hpi 收取樣品。

利用 RT-qPCR 檢測 3D4/21-BRD4-BD1/2 細胞中 ASFV 基因 CP204L、B646L/GAPDH表達量。結果顯示，3D4/21-BRD4-BD1/2 細胞中 CP204L、B646L/GAPDH 表達量顯著高于 WT 細胞（Plt;0.01）（圖 6 C、D）。3D4/21-BRD4-BD1/2 細胞系與 WT 細胞相比均能促進 ASFV CP204L、B646L 基因轉錄水平的表達。

同時，利用 Western blot 檢測病毒蛋白 p30、p72 的表達，結果顯示 3D4/21-BRD4-BD1/2 細胞系中 p30、p72 蛋白表達量顯著高于 3D4/21-WT 細胞（圖 6 A）。綜上所述，3D4/21-BRD4-BD1/2 細胞在不同 MOI ASFV 感染時現出明顯的促進病毒復制的能力。

2.7 不同時間點 ASFV 感染 3D4/21-BRD4-BD1/2 細胞系對 ASFV 增殖的影響

為了分析 3D4/21-BRD4-BD1/2 和 3D4/21-WT細胞在感染 ASFV CN/GS/2018 不同時間點之間的復制能力，將兩種細胞分別接種到 12 孔板，待細胞密度長至 70%，使用 ASFV CN/GS/2018 （MOI=1） 進行感染，分別在感染后 12、24、36、48 hpi 收取樣品。

通過 Western blot 檢測病毒蛋白 p30、p72 的表達，結果顯示 3D4/21-BRD4-BD1/2 細胞系中 p30、p72 蛋白表達量顯著高于 WT 細胞（圖 7 A、B）。利用 RT-qPCR 檢測 3D4/21-BRD4-BD1/2 細胞中 CP204L、B646L 和 GAPDH mRNA 表達水平。結果顯示，3D4/21-BRD4-BD1/2 細胞中 CP204L、B646L / GAPDH mRNA 表達量顯著高于 WT 細胞（Plt;0.01）（圖 7 C、D）。穩定表達細胞系能促進 ASFV CP204L、B646L 基因的表達。

綜上所述，3D4/21-BRD4-BD1/2 細胞在 ASFV 感染不同時間點的病毒復制能力強于 WT 細胞。

2.8 3D4/21-BRD4-BD1/2 細胞中 ASFV 滴度測定

為了深入分析 ASFV CN/GS/2018 在 3D4/21-BRD4-BD1/2 與 3D4/21-WT 細胞系中的增殖能力，作者通過觀察豬源紅細胞在感染 ASFV 的單核巨噬細胞周圍的吸附現象，采用 HAD50 測定方法對兩種細胞系中的病毒滴度進行了量化。

如圖8，使用 HAD50 值計算，3D4/21-BRD4-BD1/2 細胞系中強毒株 ASFV CN/GS/2018 的病毒滴度分別為 6.5和6.7 lgHAD50·0.1 mL-1，這顯著高于3D4/21-WT細胞系中的病毒滴度（5.45和5.5 lgHAD50·0.1 mL-1）。這一結果表明，在3D4/21-BRD4-BD1/2細胞系中ASFV的增殖能力顯著高于3D4/21-WT細胞系 （Plt;0.05）。

2.9 不同代次 3D4/21-BRD4-BD1/2 細胞系對于 ASFV 復制影響的評估

為了深入研究不同代次 3D4/21-BRD4-BD1/2 細胞系對于 ASFV 復制的影響，作者分別選取了第 10、20、30 代 3D4/21-BRD4-BD1/2 以及相應代次的 3D4/21-WT 細胞，將其接種到 12 孔板中并感染 ASFV CN/GS/2018。在感染后的特定時間點（12、24、36、48 hpi）收集相應的細胞樣品，通過 Western blot 進行對比分析。

試驗結果表明，在上述特定時間點（12、24、36、48 hpi），3D4/21-BRD4-BD1/2 細胞系在第 10、20、30代次相對于相應代次的 3D4/21-WT 細胞，均能促進 ASFV 復制，而這種促進 ASFV 復制的能力并沒有降低或消失（圖 9A～D）。

同時利用免疫熒光檢測了不同代次（F10、F20、F30）穩定表達細胞系的 BRD4-BD1/2表達情況，試驗結果表明：不同代次的穩定表達細胞系中 BRD4-BD1/2 均能穩定表達（圖 9E）。

3 討 論

非洲豬瘟（African swine fever）因其死亡率高、傳染性強，對全球養豬業構成重大威脅，因此成為了獸醫學研究領域的重點。關于非洲豬瘟病毒（African swine fever vrius）的研究涵蓋了發病機制、免疫逃避機制和疫苗開發等方面。最近的研究表明，ASFV 可以感染多種商業化傳代細胞系，包括 MA-104、MARC-145 在內的多種細胞系，這些細胞系被用來替代肺泡巨噬細胞（PAM）來研究 ASFV 的復制動力學［21］。同樣，3D4/21 細胞系也被用作感染 ASFV 的細胞系，以替代肺泡巨噬細胞（PAM），盡管其復制效率相對較低［22］。

本研究主要聚焦于表觀遺傳調節蛋白 BRD4 在 ASFV 感染中的作用，轉染 BRD4-BD1/2 能夠促進 ASFV 復制，作者推測可能與 BRD4 蛋白的結構和功能有關。BRD4 在 HSV 感染研究中也有類似的現象：轉染 BRD4 全長不能直接促進 HSV 感染，而轉染 BD1/2 能夠促進 HSV 感染，這種現象可能是由于 BD1/2 與 BRD4 競爭性結合乙酰賴氨酸［23］。相比之下，BRD4-BD1/2 的穩定表達可能通過特定的相互作用或調控路徑直接促進 ASFV 復制，因此作者構建了 BRD4-BD1/2 穩定表達 3D4/21 細胞系，驗證了其在 ASFV 復制中的關健作用。作者的研究擴展了對 BRD4 在病毒感染領域的了解，前期研究已經證明 BRD4 在 HIV、HPV、HSV 等多種病毒感染中發揮重要作用［24-26］。然而，本研究的結果揭示了 BRD4 在 ASFV 復制中的作用，豐富了 BRD4 在免疫學和病毒學領域的潛在應用。

此外，本研究中的一個重要發現是，盡管 3D4/21-BRD4-BD1/2 細胞系在增殖活性上與3D4/21-WT 細胞無顯著差異，但其可以顯著促進 ASFV 復制。RT-qPCR 和 Western blot 的結果表明 ASFV B646L 基因編碼的 p72 蛋白和 CP204L 基因編碼的 p30 蛋白的表達量在 3D4/21-BRD4-BD1/2 細胞中顯著升高，這是衡量病毒在細胞中增殖的重要標志，這提示 BRD4-BD1/2 可能在 ASFV 的生命周期中起到了促進作用［27］。

此外，BRD4-BD1/2 對 ASFV 復制的持續促進作用表明，其穩定表達可能在 ASFV 生命周期的特定階段起到關鍵影響，為 ASFV 的生物學特性提供了新的視角。HAD50 測定結果一步證實了在 3D4/21-BRD4-BD1/2 細胞系中，ASFV 的復制能力相較于 3D4/21-WT 細胞有了顯著提升，這強調了BRD4-BD1/2 在 ASFV 復制過程中的重要作用。

BRD4 在調控病毒感染反應中的作用不僅限于 ASFV。Wang 等［16］的研究表明，抑制 BRD4 可通過 DNA 損傷依賴的方式激活 cGAS-STING 途徑，進而激發廣泛的抗病毒天然免疫反應，顯示出對多種 DNA 和 RNA 病毒的廣譜抗病毒活性。在呼吸道合胞病毒（RSV）的研究中，BRD4 抑制被發現可以改變病毒感染初期宿主免疫反應中的蛋白質相互作用復合體，有助于治療病毒性和過敏性肺?。?8］。這一結果進一步證實了 BRD4 在調節宿主對病毒感染反應中的關鍵作用，為針對 RSV 等 RNA 病毒開發基于 BRD4 抑制的治療方法提供了依據。研究發現 BRD4 與 HPV 中的 E2 蛋白相互作用，參與 HPV 生命周期的多個關鍵步驟，這為開發針對 BRD4 的 HPV 治療策略提供了新的思路［29］。綜上所述，我們的研究以及相關文獻的支持，均強調了 BRD4 在病毒復制和宿主免疫調節中的關鍵作用，表明針對 BRD4 的策略可能成為一種有效的抗病毒治療方法，證明了將其作為潛在抗病毒靶標的可能性。

綜上所述，本研究不僅成功構建了 BRD4-BD1/2 穩定表達細胞系，驗證了其在 ASFV 復制中的關鍵作用，還為 ASFV 感染機制的深入理解和疫苗開發提供了新的理論基礎，為今后的病毒感染治療和疫苗研發提供了新的思路。在未來的研究中，可以進一步探索 BRD4 與 ASFV 復制機制之間的分子交互作用，以更全面地理解這一復雜的病毒感染過程。

4 結 論

本研究通過構建穩定表達 BRD4-BD1/2 基因的細胞系，證明了 BRD4-BD1/2 基因在促進 ASFV 復制中的關鍵作用。我們的研究不僅揭示了 BRD4 在 ASFV 感染和復制過程中的重要功能，也強調了其作為防治非洲豬瘟的潛在藥物靶標的價值。此外，鑒于 ASFV 對全球豬業和農業經濟構成的嚴重威脅，該細胞系的建立為未來研究 ASFV 的感染機制及疫苗候選株的開發提供了生物材料，而且為探索新的防控策略提供了科學依據，為農業經濟和豬業的可持續發展提供了新的見解。通過深入分析 BRD4-BD1/2 在 ASFV 生命周期中的角色，未來的研究應進一步探索其具體的分子機制及其它潛在的生物標記物，以促進對疫苗和藥物開發的全面理解。

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（編輯 白永平）