蟾毒靈在卵巢癌中的作用及其機制的研究進展

摘要：蟾毒靈（bufalin）是中藥材蟾酥中的一種有效成分，又稱蟾毒素，其藥理作用十分廣泛，具有顯著的抗腫瘤作用。關于蟾毒靈作為一種抗腫瘤藥物，近年來受到越來越多關注，且在中國已廣泛應用于多種惡性腫瘤的臨床診治。蟾毒靈可誘導卵巢癌細胞凋亡，抑制其增殖、遷移和侵襲，增敏化療藥物以及實現耐藥逆轉，有良好的抗卵巢癌效果。通過回顧近年來蟾毒靈在卵巢癌方面的作用及其機制，認為蟾毒靈能夠通過多種途徑誘導卵巢癌細胞凋亡，抑制其增殖、遷移和侵襲，且聯合化療藥物起到增效減毒作用以及實現逆轉耐藥。

關鍵詞：蟾毒靈；卵巢癌；作用靶點；分子機制

中圖分類號：R737.31

文獻標志碼：A

文章編號：1007-2349（2024）10-0081-06

卵巢癌是婦科惡性腫瘤中導致患者死亡的最常見原因，其發病率和死亡率在逐年上升，自2017年以來，全球每年新增確診病例超過22萬，約14萬例患者死于晚期卵巢癌，這對女性的生命健康造成嚴重危害^［1］。其中上皮性卵巢癌作為主要亞型，占總病例的95%，其次是性索間質型和生殖細胞型卵巢癌^［2］。對于卵巢癌患者的治療方式主要選擇以手術和化療為主，但化療所產生的副作用比較明顯，且超過80%的患者出現復發和產生耐藥性^［3］。對于晚期卵巢癌患者，治療失敗和導致死亡的主要原因是出現復發和對化療藥物產生耐藥性^［4］。因此，患者的生存和預后不盡如人意。

近些年來研究證明，蟾毒靈對宮頸癌^［5］、肝癌^［6］、乳腺癌^［7］、肺癌^［8］、結直腸癌^［9］、膀胱癌^［10］等惡性腫瘤具有抑制作用。蟾毒靈的作用機制是多方面的，大多數研究發現其通過調控Bcl-2/Bcl-X、IAP、P53和激活caspase-3和caspase-9等促進癌細胞凋亡^［11］。還能激活P21、P27、P38和cyclins等細胞周期調控關鍵因子，導致癌細胞細胞周期阻滯^［12］。蟾毒靈還能抑制NF-kB、PI3K-Akt、MAPK、p-JNK、Axl、Wnt/β-catenin和mTOR等信號通路^［13］。也有研究蟾毒靈用于卵巢癌的治療，其抗卵巢癌細胞作用涉及多個信號通路和多種分子靶點^［14］。

1 蟾毒靈的中藥概述

蟾酥是廣泛使用的中藥之一，尤其在中國、日本、韓國及東南亞地區，目前被用作替代藥物^［15］。其起源于中國，始載于《藥性論》^［16］。蟾酥在中藥方面的使用已有1000多年歷史，一些常用中藥如六神丸^［17］、蘆神丸^［18］和麝香保心丸^［17］等其有效成分中含有蟾蜍。蟾毒靈是一種蟾二烯內酯，可以從許多植物和動物物種中找到，但主要來源是從中華大蟾蜍或黑框蟾蜍的耳后腺或皮膚腺分泌的白色漿液經加工干燥而制成^［19］。其分子質量為386.52D，分子式為C24H34O4的甾體化合物^［20］。具有多種生物學活性，包括緩解疼痛、抗炎、心肌收縮、血壓刺激、呼吸刺激、麻醉作用，還有強大的抗腫瘤活性^［21］。同時蟾毒靈也是一種類似地高辛的C-24類固醇，具有心臟活性，自2010年引起人們廣泛關注^［22］。其可以安全長期使用，且無明顯毒副作用。但是，高劑量心臟活性類固醇會產生一系列的毒副作用，如呼吸困難、心律失常、昏迷和癲癇^［23］。2020年首次通過HPLC-MS/MS驗證了在健康人體血漿中也存在蟾毒靈，其濃度約5.7nM^［24］。而在惡性腫瘤患者中檢測到蟾毒靈濃度顯著降低，尤其在肝細胞癌患者血清中檢測到蟾毒靈濃度下降了5倍^［25］wJZQ4e0Yw/KHcySaA4D5YB43ZO10EpJ1IhY+UpJWcO4=。這也進一步強調了蟾毒靈作為一種保護分子，在預防腫瘤發生發展方面具有重要的意義。

2 蟾毒靈對卵巢癌的作用及其機制研究

2.1 蟾毒靈誘導卵巢癌細胞凋亡 基于生物信息學分析，蟾毒靈誘導細胞凋亡是一個研究熱點，目前主要有三種細胞凋亡途徑：（1）細胞內線粒體途徑。（2）細胞外死亡受體途徑。（3）內質網途徑^［21］。蟾毒靈可以通過調控凋亡相關蛋白并參與轉錄因子相關的凋亡通路抑制卵巢癌細胞存活和集落形成能力。Dou、王淞等^［26-27］人研究發現，蟾毒靈以劑量和時間依賴的方式抑制卵巢癌SKOV3細胞存活能力及集落的形成。王淞等^［27］在卵巢癌SKOV3細胞采用不同濃度蟾毒靈處理，發現蟾毒靈抑制卵巢癌細胞增殖通過MAPK信號通路，用western blot監測相關通路蛋白表達情況，發現p-ERK1/2、p-pMAPK38蛋白表達均出現明顯下降。這些研究結果說明，蟾毒靈通過抑制ERK1/2與p38MAPK蛋白磷酸化調節MAPK信號通路抑制卵巢癌細胞增殖。王博等^［28］用流式細胞儀分析經0、1、10、100nmol/L蟾毒靈處理24和48 h后的卵巢癌OVCAR-3細胞，發現10nmol/L蟾毒靈培養24 h后的卵巢癌細胞凋亡峰值明顯增高，并呈現劑量依賴性。使用蛋白質印記發現蟾毒靈誘導卵巢癌OVCAR-3細胞凋亡與凋亡抑制蛋白Livin下調和半胱天冬酶3（Caspase-3）剪接有關。這些結果表明蟾毒靈抑制卵巢癌細胞活力、促進凋亡，這一過程可能由Livin蛋白起調控作用。Dou等^［26］應用蛋白質印記發現蟾毒靈誘導卵巢癌細胞凋亡與表皮生長因子受體（EGFR）、蛋白激酶B（AKT）和ERK下游分子的磷酸化水平下調有關。EGFR與表皮生長因子（EGF）結合，激活EGFR酪氨酸激酶活性和自身磷酸化。進而與下游信號蛋白相互作用，啟動信號通路，最終誘導卵巢癌細胞增殖和存活^［29］。既往已有研究發現在卵巢癌中，EGFR高表達或擴增與疾病進展及預后有關^［30］。因此，未來蟾毒靈可以聯合EGFR抑制劑用于卵巢癌的治療。

為了進一步探尋蟾毒靈在卵巢癌細胞中作用機制，Su等^［31］采用濃度高達40μM的蟾毒靈作用于正常卵巢上皮組織7天，發現對細胞活力沒有影響，表明蟾毒靈在較高濃度下對正常卵巢上皮組織具有良好的耐受性。在確認安全的前提下，通過MTT試驗和Transwell試驗發現，在卵巢癌PA-1細胞和OAW28細胞中，可以清楚地觀察到10μM 蟾毒靈對細胞增殖和遷移有明顯的抑制作用，與對照組相比，下調了近50%。為了進一步在體外得到驗證，使用0.1mg/kg 蟾毒靈治療裸鼠（每周三次，腹腔注射），發現裸鼠的體重基本上與對照組相同，表明蟾毒靈對動物沒有明顯毒性，這與原代卵巢細胞系結果相同。繼續觀察發現裸鼠體內腫瘤細胞增加速度慢，異種移植模型實驗進一步鞏固了細胞培養系統中的發現。

2.2 蟾毒靈抑制HIF-1α mTOR途徑是包括卵巢癌在內的多種癌癥中研究最多的通路之一，是細胞生長和代謝的關鍵調節器^［32］。Su等^［31］使用免疫印跡分析發現，用10μM的蟾毒靈可有效抑制卵巢癌細胞系中mTOR的激活，并下調缺氧誘導因子1a（HIF1α）水平，HIF-1α是腫瘤生存和轉移的關鍵因素。研究結果也支持HIF-1α作為蟾毒靈的下游靶點發揮其抗腫瘤活性。同時Su等^［31］在Transwell試驗檢測到HIF-1α的過度表達可以減弱蟾毒靈對細胞遷移的抑制作用，還發現了HIF-1α在順鉑耐藥的卵巢癌患者中高表達，而蟾毒靈聯合順鉑比單用蟾毒靈進一步抑制細胞增殖及其遷移。這些研究結果進一步展望：（1）當卵巢癌患者開始以順鉑為基礎的化療時，HIF-1α可以作為一種新的生物標志物，評估患者對化療藥的敏感性。（2）在沒有明顯藥物相互作用下，蟾毒靈聯合順鉑治療卵巢癌患者，通過降低HIF-1α的表達水平，起到增加卵巢癌細胞對順鉑的敏感性，延長患者的壽命。之前Ai等^［33］研究發現敲除HIF-1可顯著提高順鉑耐藥的卵巢癌細胞對順鉑的應答，其途徑是將耐藥癌細胞的有氧糖酵解作用轉向線粒體氧化磷酸化，從而使得活性氧過量產生，促進癌細胞死亡。進一步證明了由HIF-1參與調控的腫瘤代謝途徑是攻克卵巢癌順鉑耐藥的一個新靶點。因此，未來還需要進一步研究來驗證這種治療潛力。

2.3 蟾毒靈通過有氧糖酵解抑制卵巢癌細胞 有氧糖酵解是腫瘤細胞的一個特征，與氧化磷酸化相比，腫瘤細胞具有更高的需氧糖酵解率^［34］。包括卵巢癌在內的大多數實體瘤細胞很大程度上依賴有氧糖酵解產生能量來適應其異質性微環境，這種現象被稱為Warburg效應^［35］。近幾年，越來越多的研究發現，以糖酵解途徑為靶點作為抑制腫瘤進展的治療方法^［36］。Mossmann D等^［37］在卵巢癌細胞A2780和Hey中分別采用一系列不同濃度的蟾毒靈作用24、48和72 h后，使用定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）和Western blotting檢測A2780和Hey細胞中糖酵解相關蛋白的表達水平，發現葡萄糖轉運蛋白4（GLUT4）、乳酸脫氫酶B（LDHB）和HK2的mRNA和蛋白質表達水平降低。CCK和集落形成試驗結果表明，蟾毒靈通過誘導ITGB2基因表達抑制卵巢癌細胞系生長和增殖，由于ITGB2可以提高葡萄糖攝取和乳酸生成，從而促進癌細胞生長增殖。還發現ITGB2的過度表達可以減弱經蟾毒靈處理的A2780和Hey細胞中GLUT4、LDHB和HK2的表達水平。表明ITGB2是卵巢癌治療的新靶點，未來以ITGB2為靶點的治療可以進一步使更多耐藥、復發和轉移的卵巢癌患者受益。Li等^［38］將卵巢癌A2780細胞注射到裸鼠中，待皮下腫瘤體積達到100mm后，開始蟾毒靈治療（每隔一天），使用PET-CT的檢測發現蟾毒靈可以顯著抑制卵巢癌體內的葡萄糖攝取。qRT-PCR檢測基因發現，ITGB2、FAK、GLUT4、LDHB和HK2的表達水平大幅降低。上述結果闡明了蟾毒靈通過抑制糖酵解誘導的卵巢癌細胞生長增殖的一種新通路，即Integrinβ2/ITGB2/FAK信號通路。猜測蟾毒靈聯合ITGB2抑制劑可以帶來更好的治療效果。

2.4 蟾毒靈阻滯卵巢癌細胞周期 越來越多的研究表明，細胞周期改變存在于各種腫瘤。P21ｗaf1屬于細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CDK）家族，與細胞周期蛋白依賴性激酶復合物結合并降低激酶活性，P21ｗaf1全長8.6kb，定位于6p21.2染色體，編碼164個氨基酸殘基組成的蛋白質^［38］。可以促使細胞周期停滯，尤其在阻斷細胞周期G1期起著重要作用，還能促進腫瘤細胞凋亡、抑制轉移和侵襲^［39］。近年來研究發現，蟾毒靈作用于SKOV-3和OMC-3卵巢癌細胞，通過細胞周期分析發現蟾毒靈使卵巢癌細胞周期G0/G1期積累和S期比例降低^［40］。TaKai等^［41］通過免疫印跡分析發現，蟾毒靈在兩種卵巢癌系中顯著上調P21ｗaf1蛋白表達水平。進一步Western blotting分析發現，在兩種卵巢癌細胞系中，蟾毒靈通過誘導細胞周期蛋白A（cyclinA）、細胞周期蛋白D3（cyclinD3）、Bcl-2和Bcl-xl表達上調，P21ｗaf1和Caspase-9表達下調使其凋亡。這些研究發現蟾毒靈具有潛在的臨床應用價值，值得更深入研究。

2.5 蟾毒靈聯合miRNAs使卵巢癌細胞化療增敏及實現逆轉耐藥 miRNAs是一種非編碼RNA，長度約18-25個核苷酸，高度保守^［41］。其通過結合靶基因的3＇非翻譯區（3′-UTR）來抑制基因表達或誘導蛋白質降解，可以調節多種腫瘤細胞過程，如轉移、增殖和化學敏感性^［42］。miRNAs的表觀遺傳學失調已被證實參與卵巢癌發病機制、凋亡、化療耐藥、侵襲和轉移，同時也為卵巢癌檢測、診斷的治療提供新靶點^［43］。近年來多項研究發現，miRNAs能增強卵巢癌患者對蟾毒靈敏感性。Yoshida K^［44］等用miR-127-3p模擬慢病毒轉染卵巢癌OVCAR-3和Caov-3細胞，讓其過度表達內源性miR-127-3p，發現miR-127-3p過度表達不僅能降低卵巢癌細胞系活力，而且能明顯增強對蟾毒靈的敏感性。另外，Du S Y等^［45］用miR-183進行慢病毒轉染卵巢癌細胞系SKOV3和ES-2細胞，結果發現下調miR-183的表達可抑制卵巢癌細胞系增殖、降低體內致瘤性及增強腫瘤細胞對蟾毒靈的敏感性。Chen H等^［46］用InRNA NORAD慢病毒轉導卵巢癌OVCAR-3和ES-2細胞，然后用不同濃度（0～10ng/mL）蟾毒靈處理卵巢癌細胞系48 h通過體外抗藥性試驗進行評估，結果發現與對照組相比，用InRNA NORAD轉導的卵巢癌細胞系對蟾毒靈耐藥性顯著下降及敏感性明顯增強。這些研究結果表明，表觀遺傳學調控能改善卵巢癌細胞對蟾毒靈的敏感性并降低其耐藥性。

3 小結

綜上所述，蟾毒靈作為中藥蟾酥中主要活性成分之一，具有多途徑、多靶點的抗腫瘤特性。目前已上市的蟾蜍類中藥制劑分為外用和口服制劑，外用制劑主要作用于局部，起到解熱鎮痛作用，口服制劑常與化療藥物聯合治療中晚期卵巢癌，減輕化療藥物毒副作用和增強藥效。

目前卵巢癌的臨床治療主要以手術、化學治療及新輔助治療為主，由于卵巢癌患者早期多無明顯臨床癥狀，發現時多為晚期。對于晚期患者，化療容易產生耐藥性，降低了對藥物的敏感性。耐藥性的產生是導致治療失敗和死亡的主要原因之一。蟾毒靈作用于miRNAs轉染的卵巢癌細胞，可以顯著降低卵巢癌耐藥性，提高其敏感性，與此同時還能減少化療藥物對正常卵巢組織的毒害作用。針對晚期卵巢癌患者，為防止復發和轉移，術后化療藥物聯合蟾毒靈，尤其與順鉑聯合使用時，克服癌細胞的耐藥性，這體現了中西醫結合治療的優勢，為中西醫治療卵巢癌提供了新方向。

就目前來看，在基礎研究和臨床方面已獲得一定成果，但仍有不足：（1）蟾蜍中有很多活性成分，除蟾毒靈外，其它活性成分是否也可以成功被提取用來研究，以及是否可以直接作用于卵巢癌，這些有待于進一步研究。（2）卵巢癌的種類與分型多種多樣，針對不同類型和分型卵巢癌，蟾毒靈或其它活性成分的具體療效或最佳療效仍未明確。（3）蟾毒靈或其他活性成分如何更好的與西醫治療結合，尋找新的藥物作用靶點變得尤為重要。關于蟾毒靈作用于卵巢癌，仍需進一步尋找有效的作用靶點，使其蟾毒靈的治療效果得到進一步優化。（4）蟾毒靈的藥理特性決定其水溶性差、半衰期短、分布和代謝迅速^［47］。目前已有許多研究集中開發新的工具，解決蟾毒靈的水溶性、代謝和腫瘤攝取能力，同時降低其心臟毒性來提高蟾毒靈的生物利用度，更好的發揮抗腫瘤作用^［48］。

總之，蟾毒靈具有潛在的臨床價值。研究發現，在高濃度下（40uM）下，蟾毒靈對正常卵巢組織沒有明顯傷害，且具有良好的耐受性。除此之外，在健康人體血清中可以檢測到低水平蟾毒靈，而在惡性腫瘤患者體內發現蟾毒靈濃度顯著降低，這表明在惡性腫瘤治療過程給予正常水平蟾毒靈可以抑制和延遲腫瘤擴散^［24］。這些研究結果表明，蟾毒靈是一種有希望的聯合化療方案。對于創新藥物的發現具有重要科學價值，同時也為抗腫瘤藥物的設計提供了具有中醫藥特色的新視角與新思想。

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（收稿日期：2024-01-19）