甲苯咪唑對大鱗副泥鰍肝臟氧化損傷的毒性作用

摘要：為了探究甲苯咪唑對大鱗副泥鰍肝臟氧化損傷的毒性作用，將大鱗副泥鰍暴露于濃度為0（對照）、0.004、0.02、0.1 mg·L-1的甲苯咪唑溶液中，分別于24、72、144 h測定大鱗副泥鰍肝臟谷丙轉氨酶（GPT）、谷草轉氨酶（GOT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）、乙酰膽堿酯酶（AChE）活性和總抗氧化能力（T-AOC）及丙二醛（MDA）含量的變化。結果表明：24 h時GOT活性隨著甲苯咪唑濃度的增加呈下降趨勢，72 h和144 h時則呈先升高后下降趨勢；低（0.004 mg·L-1）、中（0.02 mg·L-1）和高（0.1 mg·L-1）濃度組GPT活性在甲苯咪唑整個暴露過程中均低于對照組；SOD活性除了中濃度組在72 h時顯著高于對照組外（Plt;0.05），各濃度組SOD活性整體上呈現出不同程度的抑制趨勢；在甲苯咪唑的整個暴露過程中，GPx活性和T-AOC水平均受到顯著抑制（Plt;0.05），而MDA含量受到不同程度的誘導；24 h時各濃度組中AChE活性均顯著低于對照組（Plt;0.05），72 h和144 h時AChE活性則隨著甲苯咪唑暴露濃度的增加而升高，低濃度組受到顯著抑制（Plt;0.05），而高濃度組受到顯著誘導（Plt;0.05）。研究表明，甲苯咪唑暴露可對大鱗副泥鰍肝臟組織產生氧化脅迫和損傷作用，干擾神經遞質系統，并對魚類機體產生神經毒性效應。

關鍵詞：甲苯咪唑；大鱗副泥鰍；抗氧化系統；酶活性

中圖分類號：X171.5；S948 文獻標志碼：A 文章編號：1672-2043（2024）02-0271-07 doi：10.11654/jaes.2023-0471

大鱗副泥鰍（Paramisgumus dabryanus）隸屬于鯉形目（Cypriniformes）、鰍科（Cobitinae）、副泥鰍屬（Paramisgurnus），其生長快、耐低氧、營養價值高、素有“水中小人參”之稱，是我國淡水特種養殖經濟魚類。據統計，2019年我國泥鰍養殖產量高達35.6萬t，占淡水養殖產量的1.4％。隨著市場對大鱗副泥鰍需求量的日益增長，大鱗副泥鰍的養殖密度也在不斷擴大，在高密度養殖過程中，寄生蟲性病害頻繁發生，為了對寄生蟲性病害進行有效防治，養殖戶常大量使用甲苯咪唑（Mebendazole）等抗寄生蟲類藥物。

甲苯咪唑屬于苯并咪唑類藥物，是高效、廣譜的殺蟲劑，被廣泛應用于水產養殖業寄生蟲性病害的防治。然而在水產病害的防治過程中，養殖戶為了追求治療效果常會加大該藥物的使用劑量或頻次，卻忽視了該藥物使用可能帶來的生物殘留問題或對水產動物等非靶標生物造成的毒害作用。Xiao等的研究表明頻繁使用甲苯咪唑會導致其在鯽魚肌肉中殘留，且難以清除出體外。已有研究發現甲苯咪唑影響靶標生物巴西鉤蟲乙酰膽堿酯酶（AChE）活性。Kim等的研究也表明苯并咪唑類藥物對非靶標生物斑馬魚胚胎具有神經發育毒性效應。Dar等研究發現高濃度（20 mg·kg-1）的甲苯咪唑會誘導南亞黑鯪機體的氧化損傷和代謝失常等應激反應。此外，蘇美珍等研究發現口灌20 mg·kg-1的甲苯咪唑能使異育銀鯽肝胰臟的解毒及抗氧化功能受損。可見，甲苯咪唑對魚類機體產生的毒性效應，近年來開始受到了人們的關注。然而，甲苯咪唑對魚類毒害作用的機制研究仍處于起步階段，有關其對大鱗副泥鰍毒性作用的研究仍較為匱乏。據此，本研究以大鱗副泥鰍為研究對象，研究甲苯咪唑對大鱗副泥鰍肝臟組織中谷丙轉氨酶（GPT）、谷草轉氨酶（GOT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）、AChE活性和總抗氧化能力（T-AOC）及丙二醛（MDA）含量的影響，旨在探討甲苯咪唑對大鱗副泥鰍肝臟的氧化損傷作用，為揭示甲苯咪唑對大鱗副泥鰍的毒性作用機制提供理論基礎，并為甲苯咪唑藥物使用的生態風險評估提供科學依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

大鱗副泥鰍采購于吉安新干源生態泥鰍養殖場，平均體質量為（8.15±1.83）g，平均體長為（11.19±1.04）cm。試驗前將大鱗副泥鰍馴養于水溫為（22.0±1.0）℃的曝氣自來水中，自然光照，正常投喂飼料，并及時清理死魚和排泄物，飼養至大鱗副泥鰍沒有死亡現象后開始試驗，試驗前1d停止投喂。

甲苯咪唑（10％的有效成分含量）購自永濟市晉龍藥業有限公司。試驗前先用蒸餾水將甲苯咪唑配成一定質量濃度的母液，然后用曝氣自來水稀釋至試驗所需的濃度，試驗中所示的濃度為藥物的有效成分濃度。

1.2試驗方法

1.2.1試驗分組

本試驗根據甲苯咪唑對大鱗副泥鰍的安全質量濃度（0.15 mg·L-1）和漁業生產上建議使用的質量濃度（0.10-0.15 mg·L-1）設置了0.1 mg·L-1的高濃度組，同時設置了中濃度組（ 0.02 mg·L-1）、低濃度組（0.004 mg·L-1）和空白對照組（不添加甲苯咪唑）。試驗在規格為13 L的水族箱中進行，箱內裝SL試驗液，每個試驗組設置3個平行，每個水族箱中隨機放置6尾大鱗副泥鰍，試驗期間不投喂飼料。試驗開始后分別在24、72、144 h時從各濃度、各平行水族箱中取2尾魚，將2尾魚迅速解剖后取肝臟組織混合裝于同一離心管中作為一個平行樣品，每個濃度組3個平行樣品，將樣品保存到-80℃冰箱中待測，

1.2.2酶活性的測定

在試驗當日將于-80℃保存的肝臟組織取出，加入適量預冷的生理鹽水冰浴勻漿，勻漿液在4℃下10 000 g離心15 min，離心所獲得的上清液即為用于酶活性測定的粗酶液。AChE、GPT和GOT的活性采用南京建成生物工程研究所有限公司的試劑盒測定；SOD活性、GPx活性、T-AOC、MDA含量以及蛋白含量采用碧云天生物技術有限公司的試劑盒測定。所有操作方法嚴格按照相應試劑盒的說明書進行，所有指標均在當日測定完畢。

1.3統計分析

試驗數據采用SPSS軟件進行分析處理，樣本平均值采用單因素方差分析（One-way ANOVA）的Dun-can法進行組間兩兩比較，Plt;0.05表示差異顯著，使用Excel分析處理數據并制圖，試驗結果均采用平均值±標準差表示。

2結果與分析

2.1甲苯咪唑對大鱗副泥鰍肝臟GOT和GPT活性的影響

甲苯咪唑對大鱗副泥鰍肝臟GOT和GPT活性的影響見表1。由表1可知，在甲苯咪唑的暴露過程中，大鱗副泥鰍GOT活性隨著暴露濃度的增加總體上呈下降趨勢，且與對照組相比較，24 h時中、高濃度組受到顯著抑制（Plt;0.05），72 h時低、中濃度組受到顯著誘導（Plt;0.05），而144 h時各濃度組差異不顯著（Pgt;0.05）。各濃度組GOT活性隨著甲苯咪唑暴露時間的延長均呈上升的趨勢，72 h和144 h顯著高于24 h（Plt;0.05），且144 h時GOT活性恢復至與對照組相當的水平。

在甲苯咪唑的整個暴露過程中，各濃度組大鱗副泥鰍GPT活性均低于對照組，除了中濃度組在24 h和72 h時與對照組無顯著差異外（Pgt;0.05），其他均顯著降低（Plt;0.05，表1）。隨著甲苯咪唑暴露時間的延長，各濃度組中大鱗副泥鰍GPT活性總體上呈下降趨勢，但除中濃度組144 h顯著低于72 h外（Plt;0.05），其他濃度組各暴露時間GPT活性差異不顯著（Pgt;0.05）。

2.2甲苯咪唑對大鱗副泥鰍肝臟抗氧化能力的影響

甲苯咪唑對大鱗副泥鰍肝臟抗氧化能力的影響見表2。由表2可知，24 h時，各濃度組中大鱗副泥鰍SOD活性均受到顯著抑制（Plt;0.05）；72 h時，SOD活性隨著甲苯咪唑暴露濃度的增加呈先升高后降低的趨勢，中濃度組的SOD活性最高且顯著高于對照組（Plt;0.05），高濃度組的SOD活性最低且顯著低于對照組（Plt;0.05）；144 h時，大鱗副泥鰍SOD活性隨暴露濃度的增加而先降低后升高，中濃度組的活性最低，與對照組相比受到顯著抑制（Plt;0.05）。在整個暴露過程中，與對照組相比較，除中濃度組在72 h時受到顯著誘導外，各濃度組SOD活性整體呈現出不同程度的抑制趨勢。

在甲苯咪唑的整個暴露過程中，各濃度組中大鱗副泥鰍GPx活性與對照組相比均受到顯著抑制（Plt;0.05，表2）。在甲苯咪唑相同濃度的暴露組中，大鱗副泥鰍GPx活性隨著暴露時間的延長呈顯著下降趨勢，24 h時GPx活性顯著高于72 h和144 h（Plt;0.05）。

在甲苯咪唑的暴露過程中，與對照組相比較，各濃度組中大鱗副泥鰍T-AOC水平均受到不同程度的抑制，除24 h時低、中濃度組T-AOC水平受抑制的程度不顯著外（Pgt;0.05），其他組均受到顯著抑制（Plt;0.05，表2）。在低、高濃度組中，大鱗副泥鰍T-AOC水平在不同的暴露時間之間差異不顯著（Pgt;0.05）；在中濃度組中，T-AOC水平則隨著暴露時間的延長而逐漸降低，144 h時顯著低于24 h（Plt;0.05）。

2.3甲苯咪唑對大鱗副泥鰍肝臟MDA含量的影響

由圖1可知，在甲苯咪唑的暴露過程中，各濃度組大鱗副泥鰍MDA含量與對照組相比均被不同程度誘導，除24 h高濃度組和72 h低、中濃度組受到的誘導不顯著外，其他組均受到顯著誘導（Plt;0.05）。低、中濃度組大鱗副泥鰍MDA含量隨著甲苯咪唑暴露時間的延長先降低后上升，不同暴露時間之間均存在顯著差異（Plt;0.05）。高濃度組中，MDA含量隨著暴露時間的延長先升高后下降，72 h時顯著高于24 h和144 h（Plt;0.05）。

2.4甲苯咪唑對大鱗副泥鰍肝臟AChE活性的影響

甲苯咪唑對大鱗副泥鰍肝臟AChE活性的影響見圖2。由圖2可知，與對照組相比，24 h時，甲苯咪唑各濃度組中大鱗副泥鰍肝臟AChE活性均受到顯著抑制（Plt;0.05）；72 h和144 h時，AChE活性則隨著甲苯咪唑暴露濃度的增加而升高，低濃度組AChE活性最低，受到顯著抑制（Plt;0.05），高濃度組AChE活性最高，受到顯著誘導（Plt;0.05）。各濃度組AChE活性隨著暴露時間的延長呈現出不同的變化趨勢，低濃度組AChE活性在各個暴露時間之間差異不顯著；中濃度組AChE活性在144 h時恢復至與對照組相當的水平，顯著高于24 h和72 h；高濃度組AChE活性則隨著暴露時間的延長而升高，且不同暴露時間之間均存在顯著差異（Plt;0.05）。

3討論

GOT和GPT是動物有機體內廣泛存在的重要氨基酸轉氨酶，其活性的變化可以反映出肝細胞的受損情況以及肝功能正常與否。當肝臟受損時，肝組織中的GOT和GPT就會釋放至血液中，使其在血清中的活性增加，而在肝組織中的活性降低。有研究表明，在不同濃度的藥物作用下，魚類肝組織中GOT和GPT活性的升高或降低表明肝功能受到藥物影響的程度不同，因此其可用于評估藥物對魚類機體的毒性作用。Murmu等的研究表明雙酚A能誘導或抑制印度鯪肝臟GOT和GPT的活性，導致肝功能發生異常改變。Xia等研究發現隨著吡蟲啉給藥濃度的增加和暴露時間的延長，泥鰍肝臟GOT和GPT活性逐漸下降，提示肝臟的解毒機制可能不足以有效防止吡蟲啉藥物對肝臟系統的損傷作用，最終導致GOT和GPT的活性水平失衡。李婧等研究發現隨著苯并芘暴露質量濃度的增加，泥鰍肝臟GOT和GPT的活性受抑制的程度增強，肝功能受損的程度也增加。在本研究甲苯咪唑的整個暴露過程中，大鱗副泥鰍肝臟GOT活性隨著甲苯咪唑濃度的增加總體上呈下降趨勢，24 h時中、高濃度組均顯著低于對照組，且GPT活性在甲苯咪唑各濃度組中均低于對照組，提示甲苯咪唑暴露可能會引起大鱗副泥鰍肝臟的損傷作用，這與其他研究結果相似。大鱗副泥鰍肝組織中GOT和GPT活性的降低，可能是因為甲苯咪唑高濃度暴露使大鱗副泥鰍肝臟細胞受損，導致GOT和GPT從肝組織中異常釋放至血液中所致。此外，本研究中隨著甲苯咪唑暴露時間的延長，各濃度組GOT活性均呈上升的趨勢，72 h和144 h時顯著高于24 h，且144 h時恢復至對照組水平；而GPT活性總體上呈下降趨勢，但各濃度組間差異不顯著，表明甲苯咪唑對大鱗副泥鰍所誘導的肝損傷作用具有時間依賴性和可逆性。蘇美珍等的研究結果也表明甲苯咪唑誘導的異育銀鯽的肝損傷作用在24 h時達到峰值，48 h后有所恢復，這可能與24 h時異育銀鯽肝臟中甲苯咪唑含量最高，而48 h時肝臟中甲苯咪唑被代謝掉有關，然而具體的作用機制還有待進一步探討研究。

抗氧化系統在正常情況下能不斷清除機體內產生的多余的活性氧（ROS）等自由基，維持自由基的相對穩定，在生物體抗氧化損傷過程中發揮著重要作用。當生物體受到外源物質刺激時，機體內可能會生成過量的ROS，對機體造成危害，為了應對這種氧化損傷，機體會產生SOD、GPx等抗氧化酶，提高T-AOC水平，以結合并清除過量ROS，防止氧化應激損傷。其中，SOD能將機體內超氧陰離子自由基歧化成過氧化氫和分子氧，是機體內抗氧化損傷的重要防線；GPx能將有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，促進過氧化氫分解，緩解氧化應激損傷；而T-AOC水平的高低用于評價生物有機體清除ROS能力的強弱。在本研究中，與對照組相比較，除中濃度組在72 h時SOD活性受到顯著誘導外，各濃度組SOD活性整體上呈現出不同程度的抑制趨勢；GPx活性和T-AOC水平則在甲苯咪唑的整個暴露過程中均受到顯著抑制。Dogan等的研究表明虹鱒肝臟SOD和GPx活性隨著樂果暴露濃度的增加，15 d時呈現出上升的變化趨勢且受到不同程度的誘導，而30 d時則出現下降的變化趨勢且受到顯著抑制，表明樂果暴露前期可通過激活虹鱒肝臟抗氧化酶活性清除過量ROS，但長時間暴露則會對機體造成氧化損傷。弓飛龍的研究表明隨著甲苯咪唑暴露時間的延長，黃河鯉鰓組織T-AOC水平呈現出逐漸下降的趨勢，表明魚體抗氧化系統清除自由基的能力有限。這些研究結果與本研究結果相似，提示甲苯咪唑暴露可能會使得魚類機體內產生過量的ROS，SOD和GPx等抗氧化酶被大量消耗，機體的T-AOC水平也大幅度下降，造成氧化損傷。

研究表明，當抗氧化能力不能完全清除過量的ROS時，生物體內就會發生過氧化反應生成脂質過氧化產物——MDA。MDA含量的高低可以間接反映機體內ROS水平及細胞中脂質過氧化損傷程度。本研究結果顯示，在甲苯咪唑的暴露過程中，與對照組相比較，除了24 h高濃度組和72 h低、中濃度組的MDA受誘導不顯著外，其他組均受到顯著誘導，表明甲苯咪唑對大鱗副泥鰍肝臟組織造成了脂質過氧化損傷。這與其他藥物對斑馬魚和黃河鯉魚MDA含量影響的研究結果相似，表明甲苯咪唑等藥物暴露可使魚體內ROS堆積，導致脂質過氧化產物MDA含量的增加，最終加重機體的氧化損傷。

AChE是生物神經傳導中的一種關鍵性酶，能把乙酰膽堿水解為乙酸和膽堿，從而終止神經興奮的傳遞，保證神經信號的正常傳遞，是有機磷農藥等環境污染物對生物體神經毒性效應的敏感指標之一。在本研究中，24 h時，甲苯咪唑各濃度組中大鱗副泥鰍肝臟AChE活性均受到顯著抑制，表明甲苯咪唑在短時間內可通過抑制大鱗副泥鰍AChE活性，使突觸后膜的乙酰膽堿（ACh）不能及時水解，導致神經沖動一直傳導；而72h和144 h時，AChE活性則隨著甲苯咪唑暴露濃度的增加而升高，低濃度組AChE活性最低受到顯著抑制，高濃度組AChE活性最高受到顯著誘導，表明隨著暴露時間的延長，甲苯咪唑能通過抑制或誘導AChE活性干擾大鱗副泥鰍體內的膽堿能系統，從而產生神經毒性效應。Dutta等的研究表明隨著硫丹暴露時間的延長，藍鰓太陽魚AChE活性逐漸降低，表明硫丹對藍鰓太陽魚具有神經毒性作用；楊慧婷等研究發現高濃度的卡馬西平能夠干擾斑馬魚幼魚腦組織中AChE活性的平衡，從而產生神經毒性效應。這些研究結果與本研究結果相似，表明甲苯咪唑暴露會通過影響AChE活性的變化干擾大鱗副泥鰍的神經遞質系統，從而對機體產生神經毒性效應。

綜上，甲苯咪唑暴露會對大鱗副泥鰍產生負面的影響，因此在大鱗副泥鰍寄生蟲性病害的防治過程中應該慎用該藥物。

4結論

（1）經甲苯咪唑暴露后大鱗副泥鰍肝臟中谷草轉氨酶的活性受到不同程度的抑制或誘導，谷丙轉氨酶的活性整體被抑制，造成大鱗副泥鰍具有時間依賴性和可逆性的肝損傷。

（2）甲苯咪唑暴露誘使大鱗副泥鰍肝臟超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶活性和總抗氧化能力降低，導致脂質過氧化產物丙二醛含量的增加，對大鱗副泥鰍肝臟產生氧化損傷效應。

（3）甲苯咪唑暴露破環了大鱗副泥鰍肝臟中乙酰膽堿酯酶活性的平衡，干擾神經遞質系統，對大鱗副泥鰍機體產生神經毒性效應。