果梨多酚氧化酶特性及抑制劑研究

摘要：梨汁褐變會導致其色澤、風味與狀態(tài)等品質(zhì)受到影響。本文以延邊蘋果梨為原材料，采用丙酮粉法從蘋果梨中提取多酚氧化酶，研究了底物濃度、pH值與溫度對多酚氧化酶活性的影響，并測定了不同濃度Vc、檸檬酸和蕎麥提取物對多酚氧化酶的抑制效果，結(jié)果表明：酶與底物最適比例為0.01 mL酶+0.18 mL底物，最適pH值6.4，最適溫度為25 ℃。檸檬酸、Vc和蕎麥提取物濃度分別在0.005 g/l、0.2 g/l、0.05 g/l時，抑制效果最好。

關鍵詞：蘋果梨汁；褐變；多酚氧化酶

在果蔬的儲藏、加工過程中容易發(fā)生褐變，根據(jù)發(fā)生機理不同包括酶促褐變或非酶促褐變[1]。酶促褐變是指多酚氧化酶（PPO）與多酚類物質(zhì)和氧氣接觸，酚類物質(zhì)被氧化成羥基醌，羥基醌易聚合成黑色素物質(zhì)，使果汁顏色加深從而引起褐變[2]。行業(yè)內(nèi)主要根據(jù)酶促褐變的發(fā)生機制，應用物理或化學手段尋找抑制方法，常用化學抑制劑有二氧化硫、亞硫酸鹽、L-半胱氨酸等，例如亞硫酸鹽通過阻止發(fā)生美拉德反應從而抑制褐變，但是因為化學抑制劑的殘毒性，為避免環(huán)境污染從而限制用量，物理手段有降低溫度、改變pH值、降低果汁成品濃度等方法[3]。

隨著我國經(jīng)濟快速發(fā)展，梨果消費形式種類日益增加，對梨汁加工的研究方面逐漸深化[4]。褐變大大損害了果汁加工的商業(yè)價值[5]。本實驗探討了幾種褐變抑制劑對蘋果梨中多酚氧化酶的影響，意在確定多酚氧化酶的最適宜生理反應條件并篩選出對蘋果梨褐變效果作用最好的抑制劑，為蘋果梨汁的加工提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

蘋果梨采購于吉林農(nóng)業(yè)大學農(nóng)貿(mào)市場，產(chǎn)地為吉林省延邊自治州。蘋果梨大小均勻，色澤良好，外觀完整且無機械外傷。

1.2 方法

1.2.1 PPO提取

采用丙酮粉法。取蘋果梨果肉樣品40 g，加入預冷的丙酮液研磨，抽濾制成干燥酶粉。加入PBS緩沖液（pH值6.8）20 mL，在4 ℃下離心（4 000 r/min）30 min，取上清液為PPO粗酶液[6]。

1.2.2 PPO活性測定

采用比色法測定。將0.01 mL酶液、0.01 mL水，加入0.18 mL鄰苯二酚溶液（pH值6.8）中。測定吸光度的變化，波長420 nm。每隔30 s記錄一次，共記錄20 min。吸光度變化0.001mol/min為一個PPO酶活性單位[7]。

1.2.3 最適酶量與底物濃度比例的確定

在室溫（20 ℃）下，將pH值6.8的PBS緩沖液0.01 mL和粗酶液0.01、0.02、0.03、0.04 mL，再加入1 mL鄰苯二酚溶液（濃度分別為0.015、0.016、0.017、0.018M）中，方法同1.2.2，測定不同底物濃度下的PPO活性。

1.2.4 PPO最適pH值確定

配制不同pH值的PBS緩沖液，取粗酶液0.01 mL、0.02 M鄰苯二酚溶液0.18 mL分別加入不同pH值的磷酸緩沖液0.01 mL，測定吸光度值，波長420 nm下[8]。以不加粗酶液的不同pH值反應液做對照，測定方法同1.2.3。

1.2.5 PPO最適反應溫度確定

在pH值6.8下，將0.02 M鄰苯二酚溶液0.18 mL、酶液0.01 mL與水0.01 mL混合。在不同溫度（25～60 ℃，梯度為5 ℃）中分別水浴4 min后加入三氯乙酸，冷卻至室溫，測定420 nm吸光度值。

1.2.6 不同抑制劑對PPO活性影響

根據(jù)不同抑制劑的抑制原理，試驗選用檸檬酸、抗壞血酸、蕎麥提取物這三種抑制劑。用pH值6.8磷酸緩沖液配制濃度為0.005 g/l、0.05 g/l、0.1 g/l、0.2 g/l、0.5g/l的抑制劑溶液。在20 ℃條件下，將0.01 mL酶液、0.01 mL抑制劑溶液加入0.02 M鄰苯二酚溶液0.18 mL中， 迅速混勻后，測定PPO的活性方法同2.2.2。

抑制率計算方法：抑制率（%）=［（對照酶活-加入抑制劑后酶活）/對照酶活］×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 反應體系的最適底物濃度

不同粗酶液添加量與底物濃度對蘋果梨PPO活性影響見圖1。圖示表明，吸光值隨酶反應時間的變化均符合標準酶促反應變化規(guī)律，呈拋物線上升趨勢。酶的反應速率與酶和底物接觸面積等因素有關，而如何選擇最適底物濃度是酶促反應關鍵。通常酶隨著反應時間的增加，底物逐漸減少，酶促反應速率逐漸減慢。而將整個酶促反應時間作為計算酶活時會比實際值小。圖1曲線表明，PPO粗酶液在開始反應的前四分鐘酶與底物存在一定的線性關系，斜率代表酶促反應的酶活，R2可以作為衡量酶促反應的好壞。在不同體積粗酶液和不同濃度的底物（0.01 mL酶液+0.018 M底物、0.02 mL酶液+0.017 M底物、0.03 mL酶液+0.016 M底物、0.04 mL酶液+0.015 M底物）體系中，在0～4 min的回歸方程率分別為：0.1958、0.0556、0.0647、0.0804。R2分別為：0.9985、0.9455、0.9462、0.9102。綜上所述，酶活最大、酶促反應速率最大的是當?shù)孜餄舛葹?.015 M時，加入0.01 mL粗酶液的反應體系。本試驗選用該體系作為酶促反應的標準體系。

2.2 PPO的最適pH值

pH值對 PPO酶活的影響見圖2。pH值2.8～5.8范圍內(nèi)時蘋果梨肉PPO活性隨著pH值的升高而上升， pH值6.1時，酶活稍有下降，而后又繼續(xù)上升，在pH值6.4時酶活性達到最高；pH值2.8的PPO相對活性僅為pH值6.4的28.94%；但pH值在6.4～6.6時，酶活性隨著pH值的升高或下降，pH值6.6時PPO相對活性僅為pH值6.4的55.26%；pH值進一步上升，pH值6.6～7.0時，酶活隨著pH值的升高而上升，并在pH值7.0達到另一高峰，為pH值6.4的86.84%，隨后開始下降；pH值7.3～7.5酶活小幅度上升，而后直線下降，pH值8.0酶活下降至最低值（0%），PPO幾乎喪失活力。其原因可能是強酸性條件下，PPO的輔基Cu2+被解離，從而失去活性。在強堿條件下，Cu2+轉(zhuǎn)化為Cu（OH）2沉淀，脫離了酶蛋白，也會失去活性[9]；另外由于pH值對底物的解離使之不能被催化也是原因之一。由此可見pH值對PPO酶活性有一定影響。從整個圖表來看，在pH值6.4和7.0時分別出現(xiàn)較高的酶活值，使圖表呈現(xiàn)出“雙峰”現(xiàn)象，雙峰曲線可能是由于蘋果梨中的多酚氧化酶是復合酶，各個酶的最適pH值。根據(jù)圖表2判斷，PPO的最適pH值為6.4。

2.3 PPO的最適反應溫度

溫度對 PPO 酶活的影響結(jié)果如圖3。由于PPO酶活受pH值變化影響的圖表出現(xiàn)了“雙峰”的現(xiàn)象，在研究最適反應溫度時，把pH值條件分別設定為6.4和7.0，觀察其影響。在兩個不同pH值條件下，溫度變化趨勢基本相同。溫度為25-45℃時，pH值6.4時PPO酶活隨溫度下降而緩慢減小；而pH值7.0時，酶活隨溫度下降的幅度要更大一些。在超過40 ℃時，兩個不同pH值條件下，酶活均急劇下降至負值，完全抑制酶促化。由圖3可知，反應PPO的最適溫度為25 ℃。溫度對PPO酶活的影響是雙重的。在一定范圍內(nèi)呈正相關，隨著溫度升高加快PPO酶催化反應速度，但超過一定閾值會導致酶蛋白變性，所以溫度對PPO的影響是由以上兩個方面疊加的效果。高溫酶失活主要因為酶活性部位三維結(jié)構的完整性與穩(wěn)定性遭到破壞。

2.4 不同濃度抑制劑對PPO活性影響

2.4.1 檸檬酸對褐變反應的抑制作用

檸檬酸對PPO酶活性的抑制率見圖4。由圖4可知，隨著檸檬酸濃度的增加，PPO酶活性的抑制率呈現(xiàn)先下降后上升再下降趨勢。原因可能是PPO受pH值影響。PPO酶對pH值較為敏感，檸檬酸含量升高，pH值隨之下降，PPO酶中的銅被解離從而失去活性，pH降低到一定程度造成蛋白質(zhì)變性也是酶失去活性的一個原因，一定酸濃度后PPO酶活性抑制率呈線性下降趨勢。在試驗范圍內(nèi)，檸檬酸抑制 PPO酶活性的最適濃度為0.005 g/l。

2.4.2 Vc對褐變反應的抑制作用

Vc對PPO酶活性的抑制率見圖5。由圖5可知，抗壞血酸對PPO酶活性具有較好的抑制作用，抑制率均在89%以上。Vc對PPO酶活性的抑制率隨濃度增加，先下降后上升。反應伊始，抑制作用下降的原因可能是由于抗壞血酸極易氧化分解。當濃度為 0.2 g/l時，抑制率為100%。在試驗范圍內(nèi)，Vc抑制 PPO 酶活性的最適濃度為0.2 g/l。

2.4.3 蕎麥提取物對褐變反應的抑制作用

蕎麥提取物對 PPO 酶活性的抑制率見圖5。由圖5可知，蕎麥提取物對PPO酶活性具有較好的抑制作用，抑制率均在85%以上。蕎麥提取物對PPO酶活性的抑制率隨濃度增加，先上升后下降。其原因可能是蕎麥提取物里含多酚類物質(zhì)，隨蕎麥提取物濃度增大，酶促反應體系中多酚類底物濃度也增大，反應力度增強，從而降低了抑制作用。在試驗范圍內(nèi)，蕎麥提取物抑制 PPO 酶活性的最適濃度為0.05 g/l。

3 結(jié)論

本試驗首先研究了蘋果梨多酚氧化酶的底物濃度、pH值和反應溫度對多酚氧化酶活性的影響，在此基礎上研究了不同濃度抑制劑（Vc、檸檬酸和蕎麥提取物）對多酚氧化酶的抑制效果。結(jié)果表明：在0.01 mL酶液中加入0.018 M底物濃度的體系，酶活最高；酶促反應的最適pH值6.4，反應最適溫度為25 ℃。對蘋果梨PPO酶活性抑制作用由強到弱的抑制劑依次是蕎麥提取物、Vc、檸檬酸。這三種抑制劑抑制蘋果梨PPO酶活性的最佳濃度分別為0.05 g/l、0.2 g/l、0.005 g/l，在該濃度下PPO活性抑制率分別為85%、89%、76%。

參考文獻

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