外泌體miR-1246對帕金森病的診斷價值

【摘要】 目的 探討外泌體miR-1246對帕金森病（PD）的診斷價值。方法 收集2022年9月至2023年4月在新疆醫科大學第二附屬醫院住院的30例PD患者（PD組）和接受體檢的30名健康對照者（對照組）的血清樣本，運用實時定量PCR分析外泌體中miR-1246的表達水平，使用受試者操作特征（ROC）曲線評估miR-1246在PD診斷中的預測能力。用1-甲基-4-苯基吡啶離子（MPP+）誘導SH-SY5Y細胞建立PD細胞模型，通過Cell Counting Kit-8細胞毒性（CCK-8）實驗確定MPP+的最佳作用濃度，并在成功建立的PD細胞模型中驗證miR-1246的表達水平。利用TargetScan、miRWalk、miRase數據庫對miR-1246的靶基因進行預測，并進行基因本體論（GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析。結果 PD組與對照組在年齡、性別上具有可比性。與對照組相比，PD組血清外泌體中miR-1246表達下調［0.73（0.20，1.21） vs. 2.21（1.00，3.05），P < 0.05］。ROC曲線分析顯示miR-1246的曲線下面積為0.88，95% CI為0.77～0.99，截斷值為0.98（最佳截斷值）時的靈敏度為76.74%、特異度為95.00%。GO富集分析表明靶基因作用機制涉及細胞連接組裝、對肽激素的細胞反應、γ-氨基丁酸突觸、突觸后膜、轉錄輔助激活蛋白結合方面，KEGG富集分析涉及癌癥中的糖蛋白通路、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（PI3K-AKT）信號通路、長壽調節途徑、多巴胺能神經突觸、腎素-血管緊張素系統（RAS）信號通路等。與正常SH-SY5Y細胞相比，在MPP+誘導的PD細胞模型中miR-1246的表達下調（2.16±1.69 vs. 22.18±6.18， P < 0.05）。結論 miR-1246在PD患者血清外泌體及PD細胞模型中的表達下調，ROC曲線分析證實miR-1246在PD的診斷中具有預測能力，表明其或可作為PD的潛在生物標志物。

【關鍵詞】 帕金森病；血清外泌體；miR-1246；SH-SY5Y細胞

Diagnostic value of exosomal miR-1246 for Parkinson’s disease

WANG Xiaobei1， YANG Shan1， LI Yatan1， YANG Xinling2

（1.State Key Laboratory of Pathogenesis， Prevention and Treatment of High Incidence Diseases in Central Asia， Department of Neurology， the Second Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University， Urumqi 830063， China； 2.Xinjiang Key Laboratory of Nervous System Disease Research， Xinjiang Medical University， Urumqi 830017， China）

Corresponding author： YANG Xinling， E-mail： poplar862@sohu.com

【Abstract】 Objective To investigate the diagnostic value of exosomal miR-1246 for Parkinson’s disease （PD）. Methods Serum samples were collected from 30 PD patients （PD group） and 30 healthy controls （control group） receiving physical examination in the Second Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University from September 2022 to April 2023. The expression level of miR-1246 in exosomes was analyzed using real-time quantitative PCR. The predictive value of miR-1246 in the diagnosis of PD was assessed using the receiver operating characteristic （ROC） curves. SH-SY5Y cells were induced by 1-methyl-4-phenylpyridinium （MPP+） to establish a PD cell model. The optimal concentration of MPP+ was determined by CCK-8 assay， and the expression level of miR-1246 was verified in the MPP+-induced SH-SY5Y cell model. The target genes of miR-1246 were predicted using TargetScan， miRWalk， and miRase databases， and gene ontology （GO） analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） functional enrichment analysis were performed. Results Age and gender were matched between the PD and control groups. Compared with healthy controls， miR-1246 expression was significantly down-regulated in serum exosomes of PD patients ［0.73 （0.20， 1.21） vs. 2.21 （1.00， 3.05）， P < 0.05］. ROC curve analysis showed that the area under the ROC curve （AUC） of miR-1246 was 0.88 with a 95% CI of 0.77-0.99. When the cutoff value was 0.98（optimum cutoff value）， the sensitivity was calculated as 76.74% and the specificity was 95.00%. GO enrichment analysis indicated that the mechanism of action of target genes was involved with cellular junction assembly， cellular response to peptide hormones， GABA synapses， post-synaptic membranes， and transcriptional coactivator protein binding. KEGG signaling pathway was involved with glycoprotein pathway， PI3K-AKT signaling pathway， longevity regulation pathway， dopaminergic synapses， and RAS signaling pathway in cancer. In the MPP+-induced SH-SY5Y cell model， miR-1246 expression was significantly down-regulated compared with the control group （2.16±1.69 vs. 22.18±6.18， P < 0.05）. Conclusions The expression level of miR-1246 is down-regulated in serum exosomes of PD patients and in PD cell models. ROC curve analysis confirms the predictive value of miR-1246 in the diagnosis of PD， suggesting that it may serve as a potential biomarker for PD.

【Key words】 Parkinson’s disease； Serum exosome； miR-1246； SH-SY5Y cell

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一種常見的神經退行性疾病，其特征是多巴胺能神經元的逐漸喪失，尤其是在大腦的黑質區域［1］。PD的發病率隨年齡增長而增加，且隨著全球人口老齡化的日益加重，PD患者的數量將持續上升。PD的主要臨床表現包括靜止性震顫、肌僵直、運動遲緩和姿勢平衡障礙，這些癥狀嚴重降低患者的生活質量［2-3］。盡管PD的確切病因尚未完全明了，但研究表明，PD的發生可能是遺傳和環境因素共同導致的結果［3］。目前，PD的診斷主要依賴于臨床癥狀和神經學檢查，缺乏早期特異性生物標志物，這使得疾病的早期診斷、治療和干預面臨巨大挑戰［4］。此外，目前PD的治療主要側重于緩解癥狀，而非阻止疾病的進展，這進一步凸顯了開發新治療策略的必要性［5-7］。外泌體是細胞間通信的重要介質，近年來其在疾病診斷和治療中的潛力受到廣泛關注。外泌體是一類直徑30～150 nm的囊泡，能夠攜帶蛋白質、脂質和核酸，包括微小RNA（microRNA，miR）等生物分子，通過細胞外泌的方式在細胞間傳遞信息［8］。在神經退行性疾病中，外泌體的異常表達可能與疾病的發生發展密切相關［9-10］。miR是一類小的非編碼RNA分子，對多種生物學過程發揮重要作用［11］。本課題組通過測序發現PD患者血清外泌體中miR-1246較對照組表達下調，但miR-1246在PD中的具體作用及其通過外泌體傳遞的機制尚不明確。因此，本研究旨在探討血清外泌體中miR-1246的表達情況，并評估其作為PD早期診斷生物標志物的潛力。通過深入分析miR-1246在外泌體中的作用，以期為PD的早期識別、疾病監測和治療提供新的視角和策略。

1 對象與方法

1.1 研究對象

納入2022年9月至2023年4月在新疆醫科大學第二附屬醫院神經內科住院的30例患者，其中男18例、女12例，年齡（67.70±6.64）歲，Hoehn-Yahr（H-Y）分級2.5（1.5，3），帕金森綜合評分量表（unified Parkinson’s disease rating scale，

UPDRSⅢ）（26.73±11.37）分。PD組納入標準如下：①臨床資料及實驗室檢查資料完整；②至少由2名經驗豐富的神經內科醫師進行嚴格的神經系統檢查，依據英國腦庫PD診斷標準診斷為原發性PD［12］。排除標準如下：①服用酚噻嗪類、噻噸類、丁酰苯類等藥物所致的帕金森綜合征；②近6個月內出現腦血管疾病、顱腦外傷、中樞神經系統感染、帕金森疊加綜合征；③既往有顱腦腫瘤、顱腦轉移瘤；④近6個月血常規提示白細胞數量超過正常值；⑤近6個月患自身免疫性疾病，甲狀腺功能出現異常；⑥存在慢性感染病史；⑦近6個月內曾應用抗生素及其他抑制免疫藥物；⑧近3個月有重大外傷史及重要器官手術史；⑨既往曾出現肝、腎損害及心功能異常。同期納入在新疆醫科大學第二附屬醫院體檢的30名健康志愿者作為對照組，其中男19名、女11名，年齡（64.55±7.27）歲。2組的性別、年齡比較差異均無統計學意義（P

均> 0.05）。本研究通過新疆醫科大學第二附屬醫院醫學倫理委員會的批準（批件號：2022H029），所有研究對象知情同意。

1.2 材 料

SH-SY5Y細胞（武漢普諾賽生物有限公司），外泌體總RNA提取試劑盒（廣州Magen生物有限公司），實時熒光定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）試劑盒及引物（銳博生物有限公司），MEM/F12培養基（武漢普諾賽生物有限公司），胎牛血清及胰蛋白酶（美國GIBCO公司），1-甲基-4-苯基吡啶離子（1-methyl-4-phenylpyridinium MPP+）（美國Sigma公司），Trizol （美國Invitrogen公司），氯仿、異丙醇、乙醇、無酶水（國藥集團化學試劑有限公司），磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline PBS）、Tris鹽含吐溫20緩沖液（Tween 20-tris-buffered saline TBST）（武漢博士德生物工程有限公司）；Cell Counting Kit-8細胞毒性（CCK-8）試劑盒（日本同仁化學），CD9抗體（美國Abcam 公司），HRP標記德抗兔二抗（美國Proteintech公司），低速離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司），CP100MX超速離心機（日本日立公司），RT-qPCR儀（美國BIO-RAD公司），化學發光儀（廣州譽維生物科技儀器有限公司），透射電鏡（日本日立公司）。

1.3 方 法

1.3.1 血清外泌體的提取與鑒定

PD組于入院后第2日清晨、對照組于體檢當日清晨分別取靜脈血10 mL，3 000×g離心15 min，取血清。采用超速離心法提取血清外泌體，通過投射電子顯微鏡觀察提取的外泌體形態確定是否提取成功，采用蛋白免疫印跡法檢測外泌體標記蛋白CD9。

1.3.2 SH-SY5Y細胞培養

SH-SY5Y細胞培養基由15%的MEM/F12完全培養基組成，具體配制為：7.5 mL澳洲胎牛血清+

0.5 mL青霉素-鏈霉素雙抗和42 mL MEM/F12基礎培養基混合而成。細胞被分為2個實驗組：一組作為正常對照組，維持在常規培養條件下；另一組則使用MPP+進行處理，以建立PD的細胞模型。

1.3.3 miR-1246水平測定

使用離心柱提取血清外泌體的總RNA。使用Trizol法提取2組細胞的RNA，使用銳博生物RT-qPCR試劑盒將分離的RNA逆轉錄為cDNA后進行RT-qPCR，miR-1246以U6為內參，表達水平用2-△△Ct法分析。本研究中用于RT-qPCR的引物序列見表1。

1.3.4 CCK-8細胞活力檢測

計數確定所需SH-SY5Y細胞數量，在96孔板的每孔中加入100 μL含有5 000個細胞的細胞懸液，在細胞培養箱中培養24 h。隨后，向培養孔中分別加入不同濃度的MPP+ （分別為0、0.25、0.50、1.00、2.00 mmol/L），每個濃度設置6個復孔作為重復，繼續孵育24 h。之后每孔加入10 μL的CCK-8溶液，避光處理，繼續孵育2 h。使用酶標儀測定各孔的吸光度，測定波長為450 nm。將測得的吸光度值減去僅含培養基的陰性對照孔的吸光度值，最后對不同MPP+濃度下的吸光度值進行統計分析，以評估MPP+對細胞活性的影響。

1.3.5 生物信息學分析

使用TargetScan（https：//www.targetscan.org/）、miRDB（https： //www.mirdb.org/）、miRWalk（http： //

mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）數據庫預測miR-1246的結合位點以及與mRNA的相互作用。對這些靶mRNA進行基因本體論（gene ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析。

1.4 統計學方法

使用SPSS 26.0處理數據。對于符合正態分布的連續型變量，采用描述，并采用獨立樣本t檢驗進行組間比較。如果變量不符合正態分布，采用M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。組間性別差異采用χ 2檢驗。為了評估miR-1246的診斷價值，進行受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析，選擇具有最大約登指數的點作為最佳臨界值，圖表的制作采用GraphPad Prism 8.0軟件。雙側P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 外泌體鑒定

本研究成功提取了外泌體，外泌體在透射電鏡（transmission electron microscopy，TEM）下呈現

非常明顯的膜結構，為大小不一的凹半球樣，見圖1A。CD9在外泌體上呈陽性表達，見圖1B。

2.2 PD組與對照組血清外泌體中miR-1246的表達

PD組患者血清外泌體中miR-1246的相對表達量為0.73（0.20，1.21），對照組為2.21（1.00，

3.05），2組比較差異有統計學意義（P < 0.01），見圖2。

2.3 血清外泌體miR-1246的ROC曲線

構建ROC曲線評估miR-1246作為生物標志物在區分PD患者與健康者方面的性能。miR-1246 ROC曲線的曲線下面積（area under the curve，AUC）為0.88，95%CI為0.77～0.99（P < 0.05），見圖3。根據約登指數選擇最佳截斷值0.98時的靈敏度為76.74%，特異度為95.00%。

2.4 采用CCK-8實驗篩選MPP+最佳造模濃度

使用MPP+處理SH-SY5Y細胞，構建PD細胞模型。0 mmol/L濃度組貼壁細胞多，細胞間連接緊密，經MPP+處理后，貼壁細胞數量減少，細胞皺縮成圓形或橢圓形，細胞間距增加，見圖4。不同濃度MPP+作用的SH-SY5Y細胞存活率均低于

0 mmol/L濃度組且SH-SY5Y細胞的活力隨著MPP+濃度的增加而降低，見圖5。最終根據CCK8實驗結果選擇1.00 mmol/L的MPP+持續作用24 h作為最適宜的實驗條件。

2.5 RT-qPCR檢測細胞中miR-1246表達水平

SH-SY5YS細胞用1 mmol/L MPP+處理后，提取RNA，逆轉錄為cDNA進行RT-qPCR檢測，PD組miR-1246相對表達量較對照組低（2.17±1.19 vs.22.18±6.39），比較差異有統計學意義（P < 0.01），見圖6。

2.6 miR-1246靶基因的GO、KEGG富集分析

GO富集分析顯示，miR-1246的靶基因可能涉及細胞連接組裝、細胞對肽激素的響應、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）突觸、突觸后膜、轉錄輔助激活結合蛋白方面，見圖7。KEGG富集分析顯示miR-1246靶基因可能參與的信號通路包括癌癥中蛋白聚糖路徑、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositide 3-kinases，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）信號通路、長壽調節途徑、多巴胺能神經突觸、腎素-血管緊張素系統（renin-angiotensin system，RAS）信號通路，見圖8。

3 討 論

PD是一種神經退行性疾病，全球約有1 000萬

患者，是全球第二大常見退行性疾病［13-14］。PD導致患者多巴胺能神經元死亡，影響其運動能力，還可能引起其認知與情緒障礙，降低生活質量。PD的病理特征包括黑質區多巴胺神經元減少和α-突觸核蛋白形成的路易體，這些均導致患者出現動作緩慢等運動障礙以及非運動癥狀［15-16］。由于PD的早期診斷困難，生物標志物對于提高其診斷準確性至關重要［17］。

近年來，外泌體miR在PD中的潛在作用受到廣泛關注。外泌體是一種特殊的分泌性納米囊泡，能夠攜帶蛋白質、脂質、RNA等生物分子，在中樞神經系統及其外周循環中自由穿梭［18-19］。它們在促進錯誤折疊蛋白的擴散、激活免疫細胞以及加速神經退行性疾病進展方面發揮作用［10， 20］。研究表明，PD患者的血清和腦脊液中外泌體miR的表達模式與健康對照組存在顯著差異，具有PD生物標志物的潛力［21］。例如，miR-7能夠抑制編碼α-突觸核蛋白的mRNA的轉錄，其缺失可能導致α-突觸核蛋白的上調、聚集和多巴胺能神經元的丟失［22］。其他如miR-19b、miR-124、miR-221、miR-29c等在血清中的表達也已被報道與PD相關［23-27］。

根據前期研究成果，本研究對miR-1246與PD的關系做了深入分析，以探討其對PD的診斷價值。結果顯示，本研究提取到的外泌體與已知的形態特征相一致，證實提取成功［28］。進一步對PD患者和對照組血清外泌體中的miR-1246表達情況進行了比較分析，發現PD組血清外泌體中miR-1246的相對表達量低于對照組，ROC曲線分析顯示miR-1246具有較高的診斷準確性。上述結果提示miR-1246在外泌體中的表達水平能夠以較高的準確度區分PD患者和健康個體。

為了模擬PD的病理環境，本研究使用不同濃度的MPP+處理SH-SY5Y細胞，觀察到隨著MPP+濃度的增加，細胞形態發生變化，細胞存活率降低，表明MPP+誘導的細胞毒性具有劑量依賴性，在1 mmol/L MPP+處理24 h的條件下，miR-1246的表達較對照組下調，這可能與神經退行性變過程中的特定分子機制有關。miR-1246可能通過靶向特定的mRNA，調節與PD相關的信號通路。既往研究顯示miR-1246在腎癌、結腸癌、乳腺癌、肺癌、宮頸癌和肝癌等多種癌癥中起一定作用［29-32］，

但目前關于miR-1246與神經退行性疾病之間的直接聯系的研究相對較少。為探討miR-1246在神經退行性疾病中的具體作用和機制，本研究采用了多種生物信息學工具和數據庫，以期獲得更全面和深入的分析結果。通過TargetScan、miRWalk、miRase的綜合分析，預測了一系列潛在的靶基因，這些基因可能在miR-1246的調控下發揮作用，GO富集分析揭示了這些靶基因在生物學過程中的多種作用機制，miR-1246可能在細胞間的相互作用和組織結構的形成、參與調節細胞對外部信號的感應和應答、神經系統的抑制性突觸傳遞中起關鍵作用，在轉錄輔助激活結合蛋白的富集中，miR-1246可能在轉錄調控網絡環節扮演重要角色。KEGG信號通路分析進一步揭示了miR-1246在多種生物學通路中的潛在作用，包括miR-1246可能通過蛋白聚糖通路在腫瘤的發展和轉移中發揮作用，可能通過PI3K-AKT信號通路在細胞生長、增殖、分化和存活中起調控作用，也可能與長壽調節途徑中的衰老和壽命調控有關，此外，在神經系統功能中，miR-1246可能在多巴胺能神經突觸的富集中發揮重要作用。由此可見，miR-1246在細胞生物學和病理生理學中可能扮演了多種角色，上述發現為未來的實驗研究提供了重要的線索和理論基礎，有助于深入理解miR-1246在PD發病中的作用，并可能為其治療提供新的靶點。

盡管本研究顯示miR-1246具有成為PD的生物標志物的潛力，但由于樣本量較少，可能會限制結果的普適性，未來的研究需要在更大的樣本量和不同人群中進行驗證，以進一步評估miR-1246的診斷效能和臨床應用價值。此外，考慮到miR可通過外泌體在PD患者顱內與血液循環中傳遞，為了提高研究結果的準確性，后續擬從患者腦脊液或血液中篩選中樞來源的外泌體進行分析，以進一步驗證此次研究的結果。本研究提示，探索miR-1246與其他已知PD生物標志物的聯合使用效果，可能有助于進一步提高PD的診斷準確性和早期識別能力。未來的研究可以進一步通過驗證預測靶基因以及通過細胞、動物模型深度探討miR-1246的具體作用，從而為PD治療策略的革新提供參考。

參 考 文 獻

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（責任編輯：洪悅民）