銀杏內生菌及其次生代謝產物多樣性和生防活性的研究進展

摘要 銀杏是一種含有豐富內生菌和次生代謝產物的藥用植物。近年來，國內外學者對銀杏內生菌進行了較多的研究，從銀杏的根、莖、葉、種子等部位分離出多種不同的內生菌，通過培養發酵、分離、純化和鑒定，獲得了多樣化的次生代謝產物，如黃酮、萜類化合物等。這些化合物具有抗菌、抗氧化和抗病蟲害等功能，在生物防治領域展現了良好的應用前景。綜述了銀杏內生菌及其次生代謝產物的多樣性，并對其生物防治研究現狀進行了總結，以期為銀杏內生菌資源的開發利用提供參考。

關鍵詞 銀杏；內生菌；次生代謝產物；多樣性；生物防治

中圖分類號 Q 939 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2024）22-0020-09

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.22.003

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Endophytes of Ginkgo biloba and Its Secondary Metabolites Diversity and Biocontrol Activity

YANG Yu-wei ZHOU Xiang-ping3，YUAN Zhi-hui^2，4 et al

（1.College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128；2.College of Chemistry and Bioengineering，Hunan University of Science and Engineering，Yongzhou，Hunan 425199；3.Yongzhou Company，Hunan Tobacco Company，Yongzhou，Hunan 425100；4.Hunan Provincial Engineering Research Center for Ginkgo biloba，Yongzhou，Hunan 425199）

Abstract Ginkgo biloba is a medicinal plant rich in endophytes and secondary metabolites. In recent years，scholars at home and abroad have conducted more research on Ginkgo biloba endophytes，isolated a variety of different endophytes from the roots，stems，leaves，seeds and other parts of Ginkgo biloba，and obtained a variety of secondary metabolites，such as flavonoids and terpenoids，through culture fermentation，separation，purification and identification. These compounds have antibacterial，antioxidant and anti-pest and disease functions，and show good application prospects in the field of biological control. In this paper，the diversity of endophytes and their secondary metabolites was reviewed，and the research status of their biological control was summarized，in order to provide a reference for the development and utilization of endophytes in Ginkgo biloba.

Key words Ginkgo biloba;Endophytic bacteria;Secondary metabolites;Diversity;Biological control

基金項目 湖南省煙草公司永州市公司科技項目（YZ2022KJ04）；湖南省教育廳科學研究項目重點項目（21A0519）；湖南省自然科學基金項目（2023JJ50070，2022JJ30272）。

作者簡介 楊雨微（1999—），女，湖南岳陽人，碩士研究生，研究方向：生物工程、微生物資源的開發和利用。

*通信作者：方俊，教授，從事生物工程研究；何福林，教授，從事天然產物開發與利用研究。

植物內生菌（endophyte）是一類特殊的微生物，生活于植物組織、器官中，與植物共生，通常不會引起植物疾病，主要包括內生真菌、內生細菌和內生放線菌^［1］。在各種植物的不同部位，包括木本和草本植物、單子葉和雙子葉植物^［2］，都存在內生菌，這些內生菌在寄主植物生長和發育過程中起著重要的作用，包括幫助宿主植物吸收營養物質，保護宿主對抗病原體，免受病原菌的侵害，有助于植物在不同的環境中更好的生存等。內生菌是具有抗癌、抗菌和其他生物活性的次生代謝產物的重要來源。內生菌產生的次生代謝產物，為開發新的藥用化合物提供了支撐，成為當前研究的熱點^［3］。如內生菌產生的黃酮、萜類等化合物，表現出抗菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤和抗病蟲害等生物活性，成為藥物研發的潛在來源。同時，內生菌產生的次生代謝產物已經廣泛應用于生物防治，包括微生物農藥、增產菌或生防菌等領域^［4］。 Selim等^［5］對內生菌的次生代謝產物進行研究后指出，內生菌是生物活性次生代謝產物的重要來源，其產生的化合物可以廣泛應用于生物醫藥、工農業等領域。

銀杏（Ginkgo biloba L.）屬落葉喬木，是一種古老的孑遺植物，其歷史可追溯到2億多年前，被譽為“活化石”，同時也是我國一級重點保護的珍稀樹種。銀杏對環境適應能力強，能夠在不同類型的土壤和氣候條件下生長，且自身具有很強的抗菌能力，使其在很長的壽命內幾乎不會感染植物病蟲害^［6］，因此，銀杏被廣泛用作藥用植物，其種子、葉子和果實可用于制作具有抗菌、抗氧化、抗病蟲害、抗癌等生物活性的藥物。這些藥物具有良好的藥理活性^［7］，即使長時間使用也沒有副作用，因此市場上對銀杏的需求與日俱增。近年來，國內外研究者致力于優化銀杏資源的開發，以實現更高效、更環保的利用。研究表明，銀杏內生菌也具有類似的抗菌活性，且能夠提高宿主在抗病、抗蟲害和生長發育等方面的能力。從銀杏的不同部位分離出的內生菌多樣性非常豐富，其產生的次級代謝產物約50%對各種病原體具有抗菌活性。一些次生代謝產物，如2-己烯醛，參與了植物對害蟲的防御^［8］。基于此，筆者總結近年來關于銀杏內生菌及其次生代謝產物的多樣性和對植物病害的生物防治研究，以期為后續銀杏內生菌資源的研究和挖掘提供參考。

1 銀杏內生菌的多樣性

銀杏作為一種古老的植物，其內生菌種類繁多，廣泛分布于其根、莖、葉、種子等不同組織部位，影響內生菌多樣性的因素也很多^［9］，如時間、溫度、濕度等，能夠進一步豐富銀杏內生菌的多樣性。

內生菌的多樣性通常可以通過對銀杏根系或土壤樣本進行分析來評估。利用分子生物學技術，如高通量測序、原核微生物的16S rRNA、真菌的ITS、18S rRNA、還有DNA測序等，可以對內生菌進行鑒定和分類，從而研究其多樣性和種類組成^［10］。此外，通過觀察銀杏本身的生長和生長環境，也有助于研究其與內生菌的共生關系。

1.1 銀杏內生真菌

銀杏內生真菌能夠在其生長過程中起著重要的作用，有效防止有害病原菌的入侵，保護宿主植物免受感染^［9］。已發現的銀杏內生真菌包括青霉菌屬（Penicillium）、鐮刀菌屬（Fusarium）、鏈格孢屬（Alternaria）、根霉屬（Rhizopus）、枝孢屬（Cladosporium）、毛殼菌屬（Chaetomium）、曲霉菌屬（Aspergillus）等，其多樣性十分豐富^［11］。如Wu等^［12］從銀杏葉、莖、根中一共分離出58株內生真菌，隸屬于24個屬，包括青霉菌屬（Penicillium）、Cylindrocladiella屬、Cylintrocarpon屬、副磷球藻屬（Paraphaeosphaeria）、Clonostachys屬、Glionectria屬、木霉屬（Trichoderma）、絲霉屬（Scytalidium）、鉤球藻屬（Leptosphaeria）、叢孢子蟲屬（Pleosporales）、副孔蟲屬（Paraphoma）、硬殼孢子蟲屬（Sclerostagnospora）、黑木耳屬（Auricularia）、巴塔利尼亞屬（Bartalinia）、褐藻屬（Phaeoacremonium）、赤霉屬（Bionectria）、鏈格孢屬（Alternaria）、鐮刀菌屬（Fusarium）、毛球藻屬（Chaetosphaeronema）、枝孢屬（Cladosporium）、擬莖屬（Phomopsis）等。Cui等^［13］從銀杏根皮中分離出27株可培養的內生真菌，分屬6個不同屬，這些分離株在形態學上被鑒定為鏈格孢屬（Alternaria）、曲霉屬（Aspergillus）、炭疽菌屬（Colletotrichum）、鐮刀菌屬（Fusarium）、肉豆蔻屬（Myrothecium）和青霉屬（Penicillium），揭示了生活在銀杏樹內部的內生真菌的種類和數量。Qian 等^［14］從銀杏的根、莖、葉和樹皮中共分離到57個真菌菌株，其中15個根分離株、34個莖分離株、1個葉分離株和7個樹皮分離株。內生真菌包括鏈格孢屬（Alternaria）、曲霉屬（Aspergillus）、Colletotrichum屬、鐮刀菌屬（Fusarium）、青霉屬（Penicillium）、Pestalotiopsis屬、Phomosis屬、Trichoderma屬、木霉菌屬（Trichoderma）和未鑒定菌株有親緣關系。

1.2 銀杏內生細菌

銀杏根際內生細菌在植物的整個生長代謝過程中起著重要作用，能夠促進植物生長、吸收土壤中的養分、并增強植物的抗性。然而，由于對銀杏內生細菌的分離和培養方式的不同，導致銀杏根際中的內生細菌多樣性研究受到限制，因此，需要不斷開發和改進新的研究方式，以便獲得更多有關內生細菌的信息^［15-16］。Zhang等^［17］從銀杏根際中成功分離了455株內生細菌，其中320個來自根內圈，135個來自根際。基于16S rRNA基因序列分析，確定細菌分離株的多樣性，涵蓋了放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形桿菌門（Proteobacteria）和熱球菌門（Deinococcus-Thermus）等8個門、20個類、42個目、67個科和38個屬。收集最多的是6個屬，分別是芽孢桿菌（Bacillus）、類芽孢桿菌（Paenibacillus）、鏈霉菌（Streptomyces）、黃桿菌（Flavobacterium）、根瘤菌（Rhizobium）和微桿菌（Microbacterium）。此外，銀杏根際還可能存在來自不同屬的其他物種，其中大多數物種來自芽孢桿菌屬（Bacillus）。從根內圈（35屬）和根際（16屬）培養的內生細菌屬種更為豐富，包括紅球菌屬（Rhodococcus）、微桿菌屬（Microbacillus）、Cocuria屬、鏈霉菌屬（Streptomyces）、Deinococcus屬、孢桿菌屬（Bacillus）、賴西尼芽孢桿菌屬（Lysinibacillus）、帕尼芽孢桿菌屬（Panibacillus）、Cohnella屬、根瘤菌屬等，這些細菌在根際和根內層之間共存。 Islam等^［18］從銀杏樹的果實和葉片中分離出50個內生細菌，銀杏葉中有11個分離株，銀杏果實中有39個分離株。分別來自不同的培養基，如LB培養基中有30個分離株、YNA培養基中有19個分離株、MRS培養基中有1個分離株。這些內生細菌的形態多樣，呈現出圓形或不規則的細胞，菌落的顏色也各異，包括白色、米白色、透明、棕色、淺棕色、淺黃色、黃色或橙色，菌落邊緣呈現粗糙或波狀。這些數據充分證明了銀杏根際內生細菌的豐富多樣性。

1.3 銀杏內生放線菌

近年來，內生放線菌在植物生長、控制病害、防治害蟲以及抑制植物的非生物脅迫等方面都具有重要作用。植物內生放線菌定殖的豐富度和多樣性不僅會受到植物種類影響，也會受土壤的類型和其他相關環境條件不同程度的影響，因此不同地域的銀杏內生放線菌的豐富度和多樣性有一定的差別。Yan等^［19］從銀杏種子中分離出一種新型內生放線菌菌株，命名為 KM-1-2T，通過鑒定發現KM-1-2T代表一種新的鏈霉菌物種，其名稱為銀杏鏈霉菌屬。詹剛明等^［20］從銀杏中共獲得內生放線菌80株，其中，從葉片上分離得到60株，從果實上得到 20株，分離比率為3∶1。所分內生放線菌菌落大小各異，形態差異顯著，菌落顏色變化復雜，表明銀杏內生放線菌具有豐富的生物多樣性。根據Himaman等^［21］的研究，銀杏內生放線菌主要有7個優勢菌種，分別為鏈霉菌屬（Streptomyces）、小單胞菌屬（Micromonaspora）、小雙孢菌屬（Microbispora）、弗蘭克氏菌屬（Frankia）、諾卡氏菌屬（Nocardia）、擬諾卡氏菌屬（Nocardiopsis）和鏈孢囊菌屬（Streptosporangium）。與內生真菌、內生細菌相比，對內生放線菌的研究還相對較少，且內生放線菌一直都是生物防治的重點菌株，其中鏈霉菌所產生的抗生素備受關注。除此之外，還有很多其他的放線菌還有待進行挖掘和研究。因此，銀杏內生放線菌的多樣性仍有待深入探究。

銀杏內生菌的多樣性及其功能特性匯總見表1。由表1可知，銀杏內生菌種類非常豐富，這些菌株不僅在銀杏中被分離，從其他植物當中也可以分離到^［21］。雖然已有研究表明銀杏內生菌的多樣性很豐富，但是很多種類都是基于序列分析得到的，其純培養的數量還不多，可以采用現代培養方法，優化培養條件，比如高通量的培養方法、模擬自然生境、適應菌株的生長等方式來培養特定菌株，以此增加純培養的數量。

2 銀杏內生菌的次生代謝產物多樣性

研究表明，從銀杏中提取共有26種萜類化合物和83種分離出的黃酮類化合物，分別占銀杏標準提取物的6%和24%^［22］。此外，還發現了20種烷基酚酸和烷基酚等微量化合物，雖然含量較少，但由于其副作用也受到了廣泛研究。與銀杏共生的銀杏內生菌也能產生類似的次生代謝產物^［23］，如黃酮類、萜類等，并且還能產生特殊的代謝產物用于農業生產的生物防治活性。銀杏內生菌的次生代謝產物是通過發酵、提取和分離獲得的一系列化合物，這些次級代謝產物的種類繁多，如生物堿（alkaloids）、酚類化合物（phenolic compounds）、三萜類化合物（triterpenes）、酮類化合物（ketones）和類黃酮（flavonoids）等。對銀杏內生菌次級代謝產物的研究表明，毛霉菌發酵液中發現了115種代謝產物，在曲霉菌中發現了44種代謝產物，在木霉屬中發現43種代謝產物。這3個屬的代謝產物占內生原核生物次級代謝產物的72%，從鐮刀菌、鏈格孢菌和青霉中分離出的次級代謝產物占比約21%。銀杏的許多代謝產物對致病菌金黃色葡萄球菌、糞腸球菌和銅綠假單胞菌等有很強的抑制作用。其中最著名的成分是黃酮類和萜類化合物，這些化合物還可以用作治療外周動脈疾病、神經系統疾病、腦動脈硬化和腦老化的藥物或前藥。近年來，開發新型具有抗菌活性的內生菌和代謝產物成為研究的重要方向之一^［24］。

2.1 黃酮類化合物

黃酮類化合物是以黃酮（2-苯基色原酮）為母核而衍生的一類化合物，其結構式如圖1所示。其中包括黃酮的同分異構體及其氫化的還原產物，也即以C6—C3—C6為基本碳架的一系列化合物，結構如圖2所示。黃酮類化合物在植物界分布很廣，在植物體內大部分與糖結合成苷類或碳糖基的形式存在，也有以游離形式存在的。天然黃酮類化合物母核上常含有羥基、甲氧基、烴氧基、異戊烯氧基等取代基。由于這些助色團的存在，該類化合物多顯黃色。

黃酮類化合物是植物次生代謝產物的一個重要類別，在植物發育和防御中發揮著多種作用^［25］。許多黃酮類成分具有止咳、祛痰、平喘、抗菌的活性，可護肝，解肝毒，抗真菌，治療急、慢性肝炎及肝硬化^［26］。銀杏中的黃酮類化合物是一種多酚類化合物，具有抗氧化和清除自由基的作用。銀杏葉中含有豐富的黃酮類化合物，如槲皮素（quercetin）、蘆丁（rutin）、異鼠李素（isorhamnetin）等^［27］。

銀杏黃酮及其苷類化合物表現出顯著的生物學作用，包括抗氧化、抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎和神經保護作用^［28］。一些銀杏黃酮類化合物具有抗神經炎癥和神經保護效應^［29-30］。此外，銀杏內生菌的研究中也分離到了不同的黃酮類化合物，這些化合物與銀杏中提取出的黃酮類化合物具有類似的功能。

Pan等^［6］從Czapek-Dox培養基培養的銀杏葉種子中分離出一種可產生黃酮類化合物的內生真菌（Psathyrella candolleana），對肉湯和菌絲體的乙酸乙酯提取物進行色譜分離，鑒定得到了麥角甾醇、2′-羥基查耳酮、肉豆蔻酸、順式-9-十八碳烯酰胺、槲皮素、羧基苯、尿嘧啶和煙酰胺。Zhou等^［31］從銀杏中分離出來的尖孢鐮刀菌GF521產生的次級代謝產物包括蘆丁和山奈酚等。Qiu等^［32］研究發現，從銀杏樹枝中分離的菌株構巢曲霉ST22和米曲霉SX10能夠產生酚類和類黃酮化合物。Wu等^［33］從銀杏根部分離出了曲霉屬銀杏內生菌Gbtc2，該內生菌可產生類黃酮化合物。通過進一步研究發現，苯丙氨酸可促進內生菌Gbtc2產生的類黃酮。

綜上所述，銀杏中含有豐富的黃酮類化合物，這些化合物具有重要的抗氧化和抗炎作用（表2）。與銀杏共生的內生菌也能產生類似的黃酮類化合物，為植物提供多種保護和功能。對銀杏內生菌及其次級代謝產物的研究還有待進一步挖掘和深入探索，為開發新的生物活性化合物提供更多的潛在資源。

2.2 萜類化合物

萜類化合物是銀杏主要的活性成分之一，其中最主要的就是二萜類和倍半萜類。銀杏內酯也是銀杏內生菌次級代謝產物中一種重要的生理活性物質，具有多種藥理作用，如擴張血管、抗凝血和抗炎等^［34-43］。因此，它們在中藥和保健品中被廣泛應用，尤其在改善血液循環和記憶力方面。表3列舉了一些銀杏內生菌產生的次生代謝產物中的部分萜類化合物，如銀杏內酯B、銀杏內酯C和孢子蟲內酯等。

Cui等^［13］從銀杏根皮中分離出的內生真菌SY0056，鑒定為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum），從其代謝產物中成功分離出銀杏內酯B。Qian 等^［14］從銀杏葉中分離出的內生真菌GZUYX13，鑒定為Pestalotiopsis uvicolavia，在其生長過程中，產生的代謝產物中存在白果內酯（BB）。Liu等^［41］從銀杏中分離出了一株橘黃色的內生真菌，其產生的次級代謝產物有果霉素A（fructigenine A）、β-谷甾醇（β-sitosterol）和孢子蟲內酯（sporothriolide）等化合物。Su等^［42］在銀杏葉中分離得到內生真菌Paraphaeosphaeria sp.，從該內生菌次生代謝物中分離出10種未描述的萜類化合物，包括聚酮-萜類雜交副萜酮，以及4種倍半萜類化合物A～D。

綜上所述，萜類化合物是銀杏中重要的藥理活性成分，銀杏內生菌產生的萜類化合物與銀杏產生的同類物質也有著相似的特性，這為進一步研究和開發銀杏內生菌提供了潛在的資源和更多的可能性。

2.3 其他化合物

銀杏內生菌的次生代謝產物除了黃酮類和萜類外，還有很多其他的化合物（表4）。從銀杏中分離出來的毛殼球菌產生的次級代謝產物有毛球蛋白A、毛球蛋白C、毛球蛋白G、毛球蛋白Vb、毛球素A、毛球菌素D和過氧化麥角甾醇等^［46］。球毛藻菌屬產生的次級代謝產物有3，4-二羥基苯基乙酸、4-氨基苯乙酸和3-甲基奧司林酸等^［44］。曲霉菌產生的次級代謝產物包括 3-羥基-叔苯基、4，5-二甲氧基念珠菌素A、丙烯基念珠菌素C，對4″-脫氧念珠菌素A、4″-脫氧曲戊蛋白、4′-脫氧-3-羥基利培酮、曲霉菌病A、香豆素A和三芐基等^［45］。此外，Zhang 等^［47］從銀杏中分離的內生真菌Chaetomium globosum No.04 的發酵液中分離純化了6 種生物堿，并鑒定出其結構為Chaetoglobosin A、C、D、E、G、R。Yuan等^［43］從銀杏的根部分離出的內生真菌Penicillium sp.YY-20，其提取物中得到了6種次級代謝產物，包括腺苷、甲基b-D-呋喃核糖糖苷、腺嘌呤、20-脫氧腺苷、3-甲基哌嗪-2，5-二酮和20-脫氧尿苷。另外，Pan等^［48］從銀杏葉中分離出一種內生真菌蕓苔鏈格孢 GL07，其可以產生果香揮發物，在GL03的次生代謝產物中發現了與銀杏精油成分相同的2，5-二羥基苯乙酮，β-紫羅蘭酮和壬醛。

3 銀杏內生菌及次生代謝產物的生防活性

銀杏內生菌的次生代謝產物在農業、醫學和食品工業中有潛在的用途^［49］，銀杏內生菌及其次生代謝產物的生防活性見表5。

3.1 銀杏內生真菌及次級代謝產物的生防活性 由表5可知，

從銀杏中分離出的內生真菌對植物有重要作用，包括促進植物生長和抑制病原菌的侵害等。Wu等^［12］從銀杏根中分離的內生真菌中，其中一株青霉屬真菌（Penicillium cataractum SYPF 7131）對金黃色葡萄球菌FtsZ表現出最強的抗菌活力。另外，Yuan等^［43］從銀杏的根部分離出的內生真菌Penicillium sp.YY-20，其提取物中得到了6種次級代謝產物，包括腺苷、甲基b-D-呋喃核糖糖苷等，通過光譜鑒定方法，這些化合物能夠抗氧化和促進生長的活性，對蘿卜、蕓薹屬植物種子發芽、甘藍型油菜和小白菜的生長有刺激作用。Cui等^［13］從銀杏根皮中分離出的內生真菌SY0056，鑒定為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum），從其代謝產物中成功分離出銀杏內酯B，具有生物活性化合物的潛力。張祖姣等^［50］從銀杏根、葉中分離出對青枯勞爾氏菌Ralstonia solanacearum有拮抗作用的內生真菌，分離獲得的80株內生真菌中有5株對青枯菌有拮抗作用，其中，Gbh45具有良好的抑菌效果和遺傳穩定性，結合形態特征和ITS序列對該菌株進行了鑒定，該菌株為球黑孢菌Nigrospora sphaerica，對姜青枯病的生物防治具有巨大的發展潛力。Cao 等^［51］從銀杏葉分離出1株內生真菌Nodulisporium sp.A21，它產生的孢子絲菌內酯是聚酮類化合物，這種化合物對稻瘟病菌具有抑制作用。

銀杏的其他部位也獲得了有生防活性的內生真菌。例如Pan等^［6］從Czapek-Dox培養基培養的銀杏種子中分離出1種可產生黃酮類化合物的內生真菌（Psathyrella candolleana），產生多種次級代謝產物，其中化合物槲皮素表現出較強的抗氧化活性，對二苯基苦味肼（CL5014.538 μg/mg）和化合物槲皮素、羧基苯和煙酰胺對金黃色葡萄球菌具有抗菌活性。另外，Zhao等^［52］從銀杏中分離出的內生真菌CDW7在體外對植物病原真菌表現出較強的抑制活性，是一種有前途的農業菌核生防真菌。CDW7菌株具有對7種植物病原真菌的抗真菌活性以及對菌核病引起的油菜菌核腐病的生化防治潛力。CDW7的發酵液可以有效抑制菌核侵染油菜體內的疾病發生，保護效率為8.59%。通過采用生物測定指導方法，分離并通過光譜分析鑒定7種已知代謝物，其中，毛細胞蛋白A和D對菌核鏈球菌表現出抑制活性。此外，還有報道從銀杏葉、根和其他部位分離得到的內生真菌產生的次級代謝產物對多種植物病原菌具有顯著的抑制活性。Li等^［44］研究發現，銀杏內生真菌球毛菌培養產生了5種細胞松弛真菌毒素，對蘿卜幼苗生長有顯著的抑制作用。Zhang等^［47］從藥用植物銀杏中分離得到內生真菌毛殼菌No.04。其次級代謝產物包括6種生物堿和3種非靶向生物堿的純化，發酵產生的化合物及其結構鑒定為毛球蛋白、麥角甾醇、尿囊素和尿嘧啶等，對抗2種重要的植物病原真菌R.stolonifer和C.diplodiella有顯著的抑制活性。Zhang等^［53］從健康的銀杏葉中分離出的內生真菌，鑒定為曲霉屬IFB-YXS，通過發酵產生的生物活性化合物，對植物病原體的抗菌活性和機制，在這些化合物中，黃素顯著抑制植物病原菌Clavibacter michiganense亞種的生長。Sepedonicus的最小抑菌濃度（MIC）值為0.31 μg/mL，其比鏈霉素（MIC 0.62 μg/mL）更有效，鏈霉素是已研究出的有效抗菌藥物。黃素做為1種有效的抗菌農用化學品，有助于開發新的抗菌藥物。

綜上可知，銀杏內生真菌及其次級代謝產物在生物防治中具有潛在的應用前景。通過對這些內生真菌的深入研究和開發，有望找到更多具有抗病原菌活性的化合物，為生物防治提供更多有效的措施，從而保護環境和糧食安全，為人類健康和經濟發展作出貢獻。

3.2 銀杏內生細菌及次級代謝產物的生防活性

內生細菌產生的活性物質在生物防治和醫藥方面有著抗菌和無毒害等優點，其中芽孢桿菌為代表，能夠產生抗菌脂肽物質。Yang等^［54］從銀杏葉中分離出2株內生細菌為Fy11 和Zy44，這2株內生細菌混合使用時能有效抑制辣椒疫病，其中Zy44 所產生的粗脂肽起著主要作用。將辣椒疫霉（Phytophthora capsici）接入到3 周大的辣椒苗上，第7 天和第15 天接入Fy11 和Zy44 的混合菌劑，防治效果分別達到84.8%和67.2%。李勃等^［55］從銀杏中分離內生細菌A97，經過一系列分析，可確認該菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。通過體外篩選和活體篩選相結合的方法進行植物病原拮抗菌的篩選，得到內生細菌A97對病原菌如鐮刀菌屬、鏈格孢菌屬及青霉菌屬菌有顯著的拮抗作用，即對于甘薯干腐病、梨黑斑病、柑橘綠霉、蘋果青霉等主要園藝產品采后病害具有顯著拮抗作用，能夠在宿主表面有效定殖，并顯著抑制果實表面及傷口處病原菌的侵染，具有良好的應用開發潛力。

此外，Islam等^［18］從銀杏中分離的內生細菌對5種有害食源性致病菌的抗菌活性，即大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌、單核細胞增生李斯特菌和金黃色葡萄球菌。在分離的內生細菌中，GbF-96、GbF-97和GbF-98對所有病原菌均表現出抗菌活性，抑制區范圍為33.47～9.55 mm。 GbF-96被鑒定為枯草芽孢桿菌，對所有測試細菌具有最高的抗菌活性。相比之下，GbF-96的乙酸乙酯提取物僅對蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌表現出抗菌活性。因此，從銀杏中分離內生細菌枯草芽孢桿菌GbF-96可以有效抑制食源性病細菌，無論是菌株本身還是其代謝物。Yuan等^［56］從銀杏中分離到1種內生細菌，命名為解淀粉芽孢桿菌CGMCC 5569，其提取物中得到一系列脂肽類抗真菌化合物，包括風霉素、表面活性素和芽孢霉素等，對腐霉Lasiodiplodia rubropurpurea、L.crassispora和L.theobromae的生長具有抑制活性（>65%）。抗腐真菌活性表明內生解淀粉芽孢桿菌CGMCC 5569及其生物活性成分可能為腐染的生物防治提供一種替代生物資源。王祖華等^［57］在銀杏中分離到枯草芽孢桿菌菌株YJ5，該菌株發酵液產生的脂肽類物質能夠有效抑制草莓灰霉病原菌的生長。范曉靜等^［58］在銀杏莖葉中分離內生細菌，并且測定其體外抑菌活性及對辣椒果疫病的防治效果。一共分離出9株內生細菌，其中菌株W5對檢測的6種病原菌均有抑制作用。Zhou等^［59］從銀杏根際發現了1株能產生類黃酮的球形細菌Deinococcus sp.43，對該菌株的全基因組進行測序，并解釋一系列類黃酮合成代謝的基因。高效液相色譜（HPLC）結果表明，Deinococcus sp.43能夠產生黃酮類化合物，最大槲皮素產量為2.9 mg/L。這些研究結果表明，銀杏內生細菌及其產生的活性物質在生物防治中具有重要的應用前景，有望為農業和醫藥領域提供新的生物防治手段和治療方法。

3.3 銀杏內生放線菌及次級代謝產物的生防活性

放線菌由于其自身能產生抗生素等次級代謝產物，因此在植物病害生物防治中應用廣泛。目前對于銀杏內生放線菌及其次生代謝產物生防活性的研究還相對較少。李玲玲等^［60］從健康的銀杏莖和葉片中分離出23株內生放線菌，其中有3 株表現出了抑菌活性，XJF-2、XJF-8和XJF-13對金黃色葡萄球菌有抑菌活性，XJG-13對黑曲霉有抑菌活性，有抑菌活性菌株比例為13.0%。譚力等^［61］從銀杏的根、莖、葉中分離得到98、50、8株內生放線菌，共計156株，其中有47株放線菌具有拮抗植物病原真菌活性。菌株KLBMP 5501表現出最佳的抗菌活性和廣譜性，經過多項分類特征分析表明，菌株 KLBMP 5501是1株淺紫鏈霉菌（Streptomyces violascens），為放線菌在生物防治上的應用提供新的菌種資源。詹剛明等^［20］從銀杏中分離到具有拮抗活性的內生放線菌M和EAF-1，并對這2種菌進行了了皿內及盆栽生防活性檢測，結果表明，在皿內試驗中，M和EAF-1對玉米大斑病菌、辣椒炭疽病菌和玉米小斑病菌表現的抑菌圈較大，對棉花黃萎病菌的抑菌圈最小。在盆栽試驗中，接種了EAF－1的番茄植株的番茄灰霉病發病率顯著降低，EAF-1表現出對番茄灰霉病菌有明顯的預防作用，由此可以看出，該菌在農業生防方面具有潛在的應用價值。李慶蒙等^［62］從銀杏中分離篩選出拮抗放線菌奈良鏈霉菌（Streptomyces naraensis）對稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）、煙草黑脛病菌（Phytophthora parasitica）等植物病原真菌的相對抑制率高達 90% 以上。穆珊^［63］從銀杏中發現一株鏈霉菌 Streptomyces lycopersici RGN-GS-3 對番茄黃萎病（Verticillium dahlia 和 Verticillium alboatrum引起的土傳病害）。

綜上可知，從銀杏中可以得到的內生菌以及次級代謝物的種類眾多（表5），但目前研究仍較為集中在少數菌屬，如青霉菌、芽孢桿菌等，對于放線菌等其他菌屬的次級代謝物研究還比較少。因此，可以對不同屬的菌株進行深入研究，將具有活性的次級代謝產物應用于農業生產、醫藥等領域，進一步發掘其在生物防治中的潛在作用。這些內生菌及其次生代謝產物在生物防治中發揮著重要作用，通過利用內生菌產生的生物活性化合物，可以更好地保護環境，減少對化學農藥的使用，同時利用這些天然資源，為生物防治提供潛在的發展前景^［64-65］。持續的研究和開發，有望為植物病害控制提供更環保、高效的解決方案，確保農作物的健康生長和糧食安全。

4 總結與展望

目前對于銀杏內生菌株的純培養數量仍然不足，對于內生菌所產生的次級代謝產物有待進一步挖掘，菌株主要集中在少數屬中，對其他屬的研究還不夠深入，而且內生菌產生的活性物質的關鍵原因尚未完全厘清，還需要進一步探索。雖然人們可以根據不同的病原菌疾病進行研究，找出對應的活性菌株，對某種特定的病原菌進行針對性的有效抑制，但仍需進一步思考內生菌活性物質的關鍵。內生菌的生防活性的研究尚存不足，當前內生菌對于培養方法的要求還不足以表現其多樣性，被培養出的菌不多，因此急需找到一個新的高效的培養方法；同時，次生代謝產物依賴傳統方法進行研究，分離到的很多化合物均已有研究，效率有待提高，因此急需開發高通量的方法，另外，對于內生菌抗菌、抗蟲以及化合物合成的機制缺乏研究，真正應用于生防的內生菌較少。

該研究提供了對于銀杏內生菌及次生代謝產物的多樣性和生物防治方面的參考，并為其他相關研究提供了方向。銀杏內生菌能夠產生大量新的生物活性化合物，這些化合物可被用作生物控制劑，幫助宿主植物抵抗外界環境的侵害，對抗病原菌、病蟲害、促進植物的生長和發育等，也可被用作藥物開發的關鍵成分。不管是在植物病害或是醫藥領域，這些具有生物活性的銀杏內生菌及其次生代謝產物的多樣性為發現新藥提供了不竭動力，成為研究新藥的潛在來源。這些藥物在植物病害防治中可以抑制病原菌、促進植物生長，在醫藥方面可以對抗癌癥和保健身體。銀杏中分離的內生菌種類的多樣性能有效防治植物病原菌，銀杏內生菌產生的次生代謝產物（如黃酮類物質和銀杏內酯）對于人體也有很大的益處，可以用于治療心血管疾病等，因此，研究內生菌已經成為防治植物病害和醫藥保健的重點發展方向，同時也有望為植物病害防治提供可持續、環保的解決方案。

一直以來，植物病害一直都是我國的熱點問題，病原菌對于宿主植物的侵害越來越嚴重，而過度使用農藥化肥對于土地和環境造成的嚴重污染，亟待高效無污染的植物病害防治方法解決。植物內生菌是一種新型的微生物資源，其在微生物藥物方面的研究越來越受到國內外的重視，生物防治是天然的藥物防治，具有安全、高效、環保的優點。隨著科學技術的不斷發展，現代農業正朝著生態化的方向發展，對植物內生菌及其次生代謝產物的研究與應用已經成為一個重要的研究方向。近年來，內生菌及其次生代謝產物已經逐漸成為防治植物病原菌有效藥物和抗病品種的重要來源，同時生物防治有利于減少環境污染、生產投入和農藥的使用，符合農業的可持續發展的要求，內生菌產生的生物活性化合物對農作物的生長和健康具有積極的影響。通過研究和利用內生菌產生的次生代謝產物，人們能夠開發更環保、高效的生物控制劑，減少對化學農藥的依賴，提高作物的抗病能力和產量。同時，對內生菌進行深入研究，挖掘和利用其豐富的生物活性化合物，有望為新藥的發現和開發提供新的方向和可能性。因此，繼續探索和開發內生菌的潛力，對于農業生產和醫藥領域都具有重要的意義。

參考文獻

［1］ WU W，CHEN W H，LIU S Y，et al.Beneficial relationships between endophytic bacteria and medicinal plants［J］.Front Plant Sci，2021，12：1-13.

［2］ HE Q，ZENG Q C，SHAO Y B，et al.Anti-cervical cancer activity of secondary metabolites of endophytic fungi from Ginkgo biloba［J］.Cancer Biomark，2020，28（3）：371-379.

［3］ SHAO S C，BURGESS K S，CRUSE-SANDERS J M，et al.Using in situ symbiotic seed germination to restore over-collected medicinal orchids in Southwest China［J］.Front Plant Sci，2017，8：1-10.

［4］ JAKUBIEC-KRZESNIAK K，RAJNISZ-MATEUSIAK A，GUSPIEL A，et al.Secondary metabolites of actinomycetes and their antibacterial，antifungal and antiviral properties［J］.Pol J Microbiol，2018，67（3）：259-272.

［5］ SELIM M S M，ABDELHAMID S A，MOHAMED S S.Secondary metabolites and biodiversity of actinomycetes［J］.J Genet Eng Biotechnol，2021，19（1）：1-13.

［6］ PAN Y，ZHENG W H，YANG S L，et al.Chemical and activity investigation on metabolites produced by an endophytic fungi Psathyrella candolleana from the seed of Ginkgo biloba［J］.Nat Prod Res，2020，34（21）：3130-3133.

［7］ SATI P，PANDEY A.Influence of age on Ginkgo biloba phytochemicals in antimicrobial activity perspective［J］.Journal of Graphic Era University，2016，4（2）：57-65.

［8］ YUAN Z H，TIAN Y，HE F L，et al.Endophytes from Ginkgo biloba and their secondary metabolites［J］.Chin Med，2019，14（1）：1-40.

［9］ KATOCH M，PULL S.Endophytic fungi associated with Monarda citriodora，an aromatic and medicinal plant and their biocontrol potential［J］.Pharm Biol，2017，55（1）：1528-1535.

［10］ CHRISTIAN N，SULLIVAN C，VISSER N D，et al.Plant host and geographic location drive endophyte community composition in the face of perturbation［J］.Microb Ecol，2016，72（3）：621-632.

［11］ NISA H，KAMILI A N，NAWCHOO I A，et al.Fungal endophytes as prolific source of phytochemicals and other bioactive natural products：A review［J］.Microb Pathog，2015，82：50-59.

［12］ WU Y Y，ZHANG T Y，ZHANG M Y，et al.An endophytic fungi of Ginkgo biloba L.produces antimicrobial metabolites as potential inhibitors of FtsZ of Staphylococcus aureus［J］.Fitoterapia，2018，128：265-271.

［13］ CUI Y N，YI D W，BAI X F，et al.Ginkgolide B produced endophytic fungus（Fusarium oxysporum）isolated from Ginkgo biloba［J］.Fitoterapia，2012，83（5）：913-920.

［14］ QIAN Y X，KANG J C，LUO Y K，et al.A bilobalide-producing endophytic fungus，Pestalotiopsis uvicola from medicinal plant Ginkgo biloba［J］.Curr Microbiol，2016，73（2）：280-286.

［15］ ZOU K，LIU X D，HU Q，et al.Root endophytes and Ginkgo biloba are likely to share and compensate secondary metabolic processes，and potentially exchange genetic information by LTR-RTs［J］.Front Plant Sci，2021，12：1-20.

［16］ WEMHEUER F，TAYLOR J A，DANIEL R，et al.Tax4Fun2：Prediction of habitat-specific functional profiles and functional redundancy based on 16S rRNA gene sequences［J］.Environ Microbiome，2020，15（1）：1-12.

［17］ ZHANG S F，SUN C R，LIU X D，et al.Enriching the endophytic bacterial microbiota of Ginkgo roots［J］.Front Microbiol，2023，14：1-16.

［18］ ISLAM M N，CHOI J，BAEK K H.Control of foodborne pathogenic bacteria by endophytic bacteria isolated from Ginkgo biloba L.［J］.Foodborne Pathog Dis，2019，16（10）：661-670.

［19］ YAN X，LI Y F，WANG N N，et al.Streptomyces ginkgonis sp.nov.，an endopQ7VNY7BE4BwKtve10CbCcIOYg6Td1ONfyuB+nk/NwUM=hytic from Ginkgo biloba［J］.Anthony van Leeuwenhoek，2018，111（6）：891-896.

［20］ 詹剛明，榮曉瑩，孫廣宇.兩株頡頏內生放線菌的分離及生防活性檢測［J］.陜西農業科學，2005（5）：38-39.

［21］ HIMAMAN W，THAMCHAIPENET A，PATHOM-AREE W，et al.Actinomycetes from Eucalyptus and their biological activities for controlling Eucalyptus leaf and shoot blight［J］.Microbiol Res，2016，188/189：42-52.

［22］ TOGHUEO R M K，ZABALGOGEAZCOA I，DE ALDANA B R V，et al.Enzymatic activity of endophytic fungi from the medicinal plants Terminalia catappa，Terminalia mantaly and Cananga odorata［J］.S Afr J Bot，2017，109：146-153.

［23］ TOGHUEO R M K.Endophytes from Gingko biloba：The current status［J］.Phytochem Rev，2020，19（4）：743-759.

［24］ KOULA M，SINGH S.Penicillium spp.：Prolific producer for harnessing cytotoxic secondary metabolites［J］.Anti-Cancer Drugs，2017，28（1）：11-30.

［25］ 閆玉嬌，吳佩穎.基于指紋圖譜技術的銀杏葉黃酮類成分分析研究進展［J］.中成藥，2016，38（5）：1123-1127.

［26］ WANG J，ZHENG M Z，CHEN L N，et al.Rapid screening，separation，and detection of hydroxyl radical scavengers from total flavonoids of Ginkgo biloba leaves by chromatography combined with molecular devices［J］.J Sep Sci，2016，39：4158-4165.

［27］ LIU X G，LU X，GAO W，et al.Structure，synthesis，biosynthesis，and activity of the characteristic compounds from Ginkgo biloba L.［J］.Nat Prod Rep，2022，39（3）：474-511.

［28］ ZHANG L H，WU T T，XIAO W，et al.Enrichment and purification of total ginkgo flavonoid O-glycosides from Ginkgo biloba extract with macroporous resin and evaluation of anti-inflammation activities in vitro［J］.Molecules，2018，23：1-12.

［29］ 張立虎，吳婷婷，趙林果，等.銀杏葉提取物中黃酮類化合物抗腫瘤活性研究進展［J］.中國藥學雜志，2019，54（6）：444-449.

［30］ MA G L，XIONG J，YANG G X，et al.Biginkgosides A-I，unexpected minor dimeric flavonol diglycosidic truxinate and truxillate esters from Ginkgo biloba leaves and their antineuroinflammatory and neuroprotective activities［J］.J Nat Prod，2016，79（5）：1354-1364.

［31］ ZHOU S L，CHEN S L，TAN G H.Antibacterial substances of endophytic fungus isolated from Ginkgo biloba［J］.Nat Prod Res Dev，2010，22（2）：193-196.

［32］ QIU M，XIE R S，SHI Y，et al.Isolation and identification of two flavonoid-producing endophytic fungi from Ginkgo biloba L.［J］.Ann Microbiol，2010，60（1）：143-150.

［33］ WU X H，ZOU K，LIU X D，et al.The novel distribution of intracellular and extracellular flavonoids produced by Aspergillus sp.Gbtc 2，an endophytic fungus from Ginkgo biloba root［J］.Front Microbiol，2022，13：1-14.

［34］ CHEN T R，WEI L H，GUAN X Q，et al.Biflavones from Ginkgo biloba as inhibitors of human thrombin［J］.Bioorg Chem，2019，92：1-10.

［35］ CHEN Z.Potential antidepressant mechanistic insights of diterpene ginkgolides through NT3-TrkA and RAS-MAPK pathways［D］.Chongqing：Chongqing Medical University，2019.

［36］ EISVAND F，RAZAVI B M，HOSSEINZADEH H.The effects of Ginkgo biloba on metabolic syndrome：A review［J］.Phytother Res，2020，34（8）：1798-1811.

［37］ SUN H Y，LI X Y，LIANG Z，et al.In silico screening ginkgolide compounds from Ginkgo biloba extract injection to affect drug-metabolzing enzymes［J］.Lat Am J Pharm，2016，35（2）：383-385.

［38］ JARACZ S，MALIK S，NAKANISHI K.Isolation of ginkgolides A，B，C，J and bilobalide from G.biloba extracts［J］.Phytochemistry，2004，65（21）：2897-2902.

［39］ DONG H L，LIN S，WU Q L，et al.A new bilobalide isomer and two cis-coumaroylated flavonol glycosides from Ginkgo biloba leaves［J］.Fitoterapia，2020，142：1-6.

［40］ SHU P H，SUN M Y，LI J P，et al.Chemical constituents from Ginkgo biloba leaves and their cytotoxicity activity［J］.J Nat Med，2020，74（1）：269-274.

［41］ LIU J J，CHEN S J，GONG H X，et al.An endophytic fungus producing orange pigment isolated from Ginkgo biloba L.［J］.Prog Modern Biomed，2009，9（2）：246-250.

［42］ SU S，YANG X Q，YANG Y B，et al.Antifungal and antifeedant terpenoids from Paraphaeosphaeria sp.cultured by extract of host Ginkgo biloba［J］.Phytochemistry，2023，210：1-6.

［43］ YUAN Y，TIAN J M，XIAO J，et al.Bioactive metabolites isolated from Penicillium sp.YY-20，the endophytic fungus from Ginkgo biloba［J］.Nat Prod Res，2014，28（4）：278-281.

［44］ LI H，XIAO J，GAO Y Q，et al.Chaetoglobosins from Chaetomium globosum，an endophytic fungus in Ginkgo biloba，and their phytotoxic and cytotoxic activities［J］.J Agric Food Chem，2014，62（17）：3734-3741.

［45］ GUO Z K，YAN T，GUO Y，et al.p-Terphenyl and diterpenoid metabolites from endophytic Aspergillus sp.YXf3［J］.J Nat Prod，2012，75（1）：15-21.

［46］ XUE M，ZHANG Q，GAO J M，et al.Chaetoglobosin Vb from endophytic Chaetomium globosum：Absolute configuration of chaetoglobosins［J］.Chirality，2012，24（8）：668-674.

［47］ ZHANG G Z，ZHANG Y H，QIN J C，et al.Antifungal metabolites produced by Chaetomium globosum No.04，an endophytic fungus isolated from Ginkgo biloba［J］.Indian J Microbiol，2013，53（2）：175-180.

［48］ PAN Y，JIN H J，YANG S L，et al.Changes of volatile organic compounds and bioactivity of Alternaria brassicae GL07 in different ages［J］.J Basic Microbiol，2019，59（7）：713-722.

［49］ KUMAR A，SINGH R，YADAV A，et al.Isolation and characterization of bacterial endophytes of Curcuma longa L.［J］.3 Biotech，2016，6（1）：1-8.

［50］ 張祖姣，袁志輝，趙子豪，等.抗姜青枯菌銀杏內生真菌的分離及抑菌特性［J］.中國生物防治學報，2018，34（6）：890-896.

［51］ CAO L L，ZHANG Y Y，LIU Y J，et al.Anti-phytopathogenic activity of sporothriolide，a metabolites from endophyte Nodulisporium sp.A21 in Ginkgo biloba［J］.Pestic Biochem Physiol，2016，129：7-13.

［52］ ZHAO S S，ZHANG Y Y，YAN W，et al.Chaetomium globosum CDW7，a potential biological control strain and its antifungal metabolites［J］.FEMS Microbiol Lett，2017，364（3）：1-6.

［53］ ZHANG W J，WEI W，SHI J，et al.Natural phenolic metabolites from the endophytic Aspergillus sp. IFB-YXS，with antimicrobial activity［J］.Bioorg Med Chem Lett，2015，25（13）：2698-2701.

［54］ YANG R X，FAN X J，CAI X Q，et al.The inhibitory mechanisms by mixtures of two endophytic bacterial strains isolated from Ginkgo biloba against pepper phytophthora blight［J］.Biol Contr，2015，85：59-67.

［55］ 李勃，馬瑜，黨永.銀杏中內生細菌的分離鑒定［J］.果樹學報，2010，27（4）：566-569，665.

［56］ YUAN B，WANG Z，QIN S，et al.Study of the anti-sapstain fungus activity of Bacillus amyloliquefaciens CGMCC 5569 associated with Ginkgo biloba and identification of its active components［J］.Bioresour Technol，2012，114：536-541.

［57］王祖華，楊瑞先，劉萍，等.銀杏內生拮抗菌株的鑒定及脂肽類物質的活性［J］.貴州農業科學，2017，45（10）：92-94.

［58］ 范曉靜，黃未，邱思鑫，等.銀杏內生細菌的分離鑒定及抑菌活性初探［J］.微生物學通報，2013，40（9）：1638-1648.

［59］ ZHOU J，ZOU K，FU S D，et al.Flavonoid synthesis by Deinococcus sp.43 isolated from the Ginkgo rhizosphere［J］.Microorganisms，2023，11（7）：1-18.

［60］ 李玲玲，李青愛，易回香，等.銀杏內生菌的分離及其抑菌活性篩選［J］.生物資源，2019，41（3）：249-254.

［61］ 譚力，袁博，秦盛，等.邳州銀杏內生放線菌分離、篩選及活性菌株鑒定［J］.微生物學通報，2015，42（6）：1043-1051.

［62］ 李慶蒙，王世強，李昆太，等.拮抗放線菌JD211的抑菌活性及其鑒定［J］.生物災害科學，2013，36（4）：394-398.

［63］ 穆珊.抗番茄黃萎病功能放線菌Streptomyces lycopersici RGN-GS-3 的篩選及新品種鑒定［D］.哈爾濱：東北農業大學，2019.

［64］ BRADER G，COMPANT S，MITTER B，et al.Metabolic potential of endophytic bacteria［J］.Curr Opin Biotechol，2014，27：30-37.

［65］ KUMARI P，TRIPATHI S，KUMAR S.Isolation of endophytic microorganism from Kigelia pinnata（Jacq.）DC and Barleria prionitis Linn.［J］.Ind J Fundam Appl Life Sci，2015，5：6-10.