高山杜鵑組培快繁關鍵技術研究

摘要 以高山杜鵑品種“23XXL”“5RE”及“6GR”的葉片、莖段、苞片為外植體，研究基本培養基、外植體生理年齡及植物生長調節劑對高山杜鵑外植體愈傷組織誘導的影響。結果表明，高山杜鵑外植體在WPM培養基和MS培養基上均能誘導出愈傷組織。愈傷誘導階段，添加2.0～3.0 mg/L TDZ誘導愈傷效果好，其中外植體生理年齡為2W葉片誘導的愈傷組織生長較好，愈傷誘導率最高為100%；愈傷分化階段，最適宜的愈傷組織分化激素配比為ZT 2.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L和TDZ 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L，其中外植體生理年齡為1M葉片在Z7培養基愈傷組織分化較好，平均芽分化數為0.92；生根階段，培養基最佳激素配比IBA 0.5 mg/L+NAA 1.0～1.5 mg/L均適合高山杜鵑的3種品種。該研究結果為構建高效、穩定的高山杜鵑組培快繁體系提供科學依據，為進一步實現高山杜鵑產業化奠定基礎。

關鍵詞 高山杜鵑；組織培養；外植體；植物生長調節劑

中圖分類號 S 685.21 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2024）22-0042-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.22.007

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Research on Key Techniques for Tissue Culture of Rhododendron lapponicum

NAN Ya-qi LIU Juan3，QI Yu1 et al

（1.Institute of Leisure Agriculture，Shandong Academy of Agricultural Sciences /East China Urban Agriculture Key Laboratory of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Shandong Engineering Research Center for Ecological Horticultural Plant Breeding， Jinan， Shandong 250100; 2.College of Horticulture and Landscape Architecture， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300000; 3. Shandong Hongmei Horticultural Technology Co.， Ltd.， Rizhao， Shandong 276800）

Abstract This study used the leaves， stem segments， and bracts of alpine rhododendron varieties ‘23XXL’‘5RE’and‘6GR’ as explants to investigate the effects of basic culture medium， physiological age of explants， and plant growth regulators on callus induction in alpine rhododendron explants. The results showed that the explants of alpine rhododendron could induce callus on both WPM and MS media. During the callus induction stage， adding 2.0-3.0 mg/L TDZ had a good effect on inducing callus. Among them， the callus induced by leaves with a physiological age of 2W had better growth， and the highest callus rate was 100%;at the stage of callus differentiation， the most suitable ratio of callus differentiation hormones was ZT 2.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L and TDZ 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L. Among them， the explant with a physiological age of 1M had better callus differentiation on Z7 medium， with an average number of bud differentiation of 0.92;during the rooting stage， the optimal hormone ratio of the culture medium was IBA 0.5 mg/L+NAA 1.0-1.5 mg/L， which were suitable for the three varieties of alpine rhododendron. The research results provide a scientific basis for constructing an efficient and stable tissue culture and rapid propagation system of alpine rhododendron， and lay a foundation for further realizing the industrialization of alpine rhododendron.

Key words Rhododendron lapponicum;Tissue culture;Explants;Plant growth regulator

高山杜鵑一般是指以杜鵑亞屬、常綠杜鵑亞屬、馬銀花亞屬為主的生長在海拔較高的地區的常綠杜鵑以及其經過上百年雜交培育出的園藝品種，其花色繁多，花團錦簇，極具經濟價值和觀賞價值^［1］。

當前國內高山杜鵑的研究開發和推廣應用方興未艾，在全國園林花卉大發展的背景下，高山杜鵑的市場潛力巨大^［2］。然而國內高山杜鵑產業存在以下問題：第一，國內優質高山杜鵑品種主要依賴進口，缺乏具有自主知識產權的新優品種^［3］。我國大部分栽培品種為歐洲選育的高山杜鵑品種，耐寒性強，但缺乏抗旱、耐熱性狀^［4］；第二，高山杜鵑為木本植物，生長周期長，養護成本高，生產企業積極性不高，導致產業發展緩慢；第三，扦插不易成活、種苗依賴進口，價格高。部分高山杜鵑品種缺乏完善、高效穩定的組培繁育技術體系，種苗質量得不到保障^［5-6］，使得高山杜鵑進口種苗價格昂貴，不利于產業化推廣。

筆者針對目前高山杜鵑品種組培體系不完善、高效穩定的組培繁育技術缺乏、種苗質量參差不齊等問題，以引入的高山杜鵑種質資源為材料，開展高山杜鵑的種苗繁育關鍵技術研究，探索杜鵑花種質創新的途徑和方法，實現種苗的高效繁育，為高山杜鵑產業可持續發展奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗時間和地點

試驗于2023年3—8月在山東省農業科學院休閑農業所觀賞園藝課題組實驗室進行。

1.2 試驗材料

高山杜鵑“23XXL”“5RE”“6GR”種質資源，種植于山東省農業科學院休閑農業研究所觀賞園藝課題組溫室，常規栽培管理。

選用WPM、MS作為基本培養基，使用激素有TDZ、ZT、NAA、IBA。

1.3 試驗方法

1.3.1 外植體取材及消毒方法。

采用“23XXL”高山杜鵑品種的葉片、莖段、苞片為外植體材料，其中葉片按照新葉長出時間分為生長7 d（1W）、14 d（2W）、30 d（1M）3種；莖段按照生長時間分為生長30 d的莖段（JM）、14 d的莖段（J2W）；苞片（bp）。

將外植體用洗潔精浸泡10 min后，搓洗葉片表面黏膩的絨毛和莖段表面的污垢，用流水沖洗干凈，放置無菌瓶中備用。倒入75%乙醇消毒。其中，1W葉片消毒40 s，2W葉片消毒45 s，苞片（bp）消毒40 s，1M葉片消毒45 s，JM（莖段30 d）消毒45 s，J2W（莖段14 d）消毒45 s，外植體消毒要晃動瓶身，使其均勻消毒。后分別夾到無菌瓶中，倒入0.1%氯化汞1W葉片、苞片（bp）消毒6 min，2W葉片、JM（莖段30 d）、J2W（莖段14 d）均消毒8 min。消毒期間不斷晃動瓶身，使外植體與消毒液充分接觸，使其消毒徹底（表1）。

消毒后的外植體，用無菌水沖洗3～5遍，放入無菌盤中，切除莖段兩頭褐化部位，葉片切除葉尖、葉柄和葉片兩側備用。

1.3.2 愈傷組織誘導方法。

愈傷組織誘導培養基分為A1～A6，其中A1～A5以WPM為基本培養基，A6以MS為基本培養基，同時附加不同濃度的植物生長調節劑、蔗糖30 g/L、瓊脂6 g/L，培養基調制為pH 5.8，具體配比見表2。將葉片切成大小均等4塊，背部朝下接入誘導培養基中，每瓶接種4片，每個處理5瓶，3個重復。暗培養14 d后，培養光照強度1 500～1 800 lx，光照時間12 h/d，培養溫度（24±2）℃。接種30 d后統計愈傷組織的誘導率、褐化率。

1.3.3 愈傷組織分化處理方法。

分化培養基以WPM為基本培養基，附加不同濃度的細胞分裂素TDZ、ZT和生長素NAA，同時添加蔗糖30 g/L，瓊脂6 g/L，調pH至5.8，具體配比見表3。將“23XXL”外植體誘導的愈傷組織接種到分化培養基中，每瓶接種4塊，每個處理5瓶，3個重復。暗培養14 d后，培養光照強度1 500～1 800 lx，光照時間12 h/d，培養溫度（24±2）℃，培養30 d后觀察生長情況并統計平均芽分化數。

1.3.4 組培苗生根處理方法。

當叢生芽生長至3～5 cm時，將其從基部切割，接種至生根培養基上。生根培養基以WPM為基本培養基，添加不同濃度的生長素NAA和IBA，同時添加蔗糖30 g/L、瓊脂6 g/L、活性炭1 g/L，pH調至5.8，具體配比見表4。生根培養基為g1～g5，其中g5培養基放入活性炭，接種后的叢生芽，暗培養14 d后，光照強度1 500～1 800 lx，光照時間12 h/d，培養溫度（24±2）℃，35 d后觀察生根情況并統計生根率。

1.4 數據分析

采用DPS軟件和Excel軟件進行各數量性狀的誘導率、分化數、生根率計算。

誘導率=誘導愈傷的總數/接種外植體數×100%

褐化率=褐化的總數/接種外植體數×100%

平均芽分化數=分化出的芽總數/接種中間繁殖體數

生根率=生根株數/誘導株數×100%

2 結果與分析

2.1 不同培養基對高山杜鵑愈傷組織誘導的影響

高山杜鵑外植體接入培養基后，先進行暗培養，14 d后再進行光照培養。葉片接入培養基7 d后，邊緣出現卷曲現象，開始形成愈傷組織，其他外植體無任何變化；接入14 d后，莖段開始長出愈傷，1W葉片相比其他生長期的葉片長出愈傷數量較多；苞片接種20 d后，才開始誘導愈傷組織。30 d天后觀察并統計高山杜鵑外植體誘導愈傷情況和褐化死亡情況。

由表5可知，加入不同濃度TDZ、ZT、NAA的培養基對高山杜鵑外植體愈傷組織的誘導率差異較大。1M葉片培養基中A3、A5培養基愈傷組織誘導率最高，為100%，且愈傷長勢良好。而其他培養基誘導率在86.9%～97.9%；2W葉片在A1～A6培養基上，愈傷組織誘導率均為100%，其中A5培養基愈傷生長勢最好，而A1培養基愈傷長勢一般；1W葉片誘導率除A1外，均為100%，其中A5、A6培養基的愈傷長勢狀態最佳；苞片的最適基本培養基為MS，誘導率為94.0%；JM莖段培養基中，A4培養基愈傷組織誘導率最高，為87.5%；J2W莖段培養基中A3、A5培養基愈傷組織誘導率最高，均為100%。部分葉片愈傷組織長勢見圖1。

2.2 不同外植體對高山杜鵑愈傷組織誘導的影響

由表5可知，不同外植體愈傷組織褐化率差異顯著。1W和2W褐化率均為0，而1M葉片A1、A2、A4、A6均出現褐化現象，其中A1培養基褐化率高于其他培養基，褐化率為10.8%。說明1W葉片和2W葉片比1M葉片更適合誘導愈傷組織，幼嫩的葉片更適合作為外植體。苞片的A5培養基出現褐化現象，褐化率達22.2%。JM莖段在6種培養基上均出現褐化現象，其中A3培養基褐化率最高，為60.0%。J2W莖段在A4培養基上褐化率最高，為50.0%，而在A1、A3、A5培養基上均未出現褐化現象。因此，高山杜鵑生長14 d的莖段比生長30 d 的莖段更適合作為外植體。

2.3 不同培養基對高山杜鵑愈傷組織分化的影響

由表6可知，TDZ和ZT2對高山杜鵑愈傷組織分化起到促進作用，隨著TDZ和ZT濃度的升高，平均芽分化數呈上升趨勢。其中1M、2W和1W的葉片愈傷組織在Z7培養基上的平均芽分化數均顯著高于其他處理，分別為0.92、0.83和0.72；苞片愈傷組織在7種培養基上的平均芽分化數差異不顯著；JM莖段愈傷在Z3培養基上的平均芽分化數高于其他培養基，為0.19；J2W莖段在Z1培養基上未分化出芽，Z2和Z7培養基平均芽分化數較低，為0.08，而在Z3～Z6培養基上無顯著差異。

2.4 不同培養基對高山杜鵑組培苗生根的影響

由表7可知，“5RE”品種在g2培養基中25 d和35 d的生根率均高于其他培養基，分別為45.50%和50.00%。在25 d時 g1、g4培養基均未長根。而35 d后，g1生根率與g2生根率均為50.00%；“6GR”品種生長25 d時，在g2培養基中生根率高于其他培養基，為76.50%，35 d后生根率高達94.12%，而在g3～

g5培養基上35d的生根率均比25d的生根率增加；“23XXL”品種，生長25 d時，g1培養基中生根率高于其他培養基，為83.40%，35 d后g1培養基生根率高達94.12%（圖2）。

3 討論

目前，高山杜鵑組織培養采用的外植體多為莖段、葉片、花苞、側芽和種子等。蘇家樂等^［7］選取高山杜鵑新品種富麗金陵幼嫩莖段，獲得了較高的組培成活率。董春枝等^［8］利用錦繡杜鵑、迎紅杜鵑、映山紅早春花后新發幼莖作為外植體，成功培養出大量的組培苗。湯桂鈞等^［9］選用高山杜鵑的莖段和莖尖進行外植體誘導試驗，成功培育出試管苗。陳平芬等^［10］以常綠雜交杜鵑一年生半木質化莖段為外植體，運用側芽建立杜鵑屬植物的組培快繁體系。王蔚瓊等^［11］采用高山杜鵑（Rhododendron lapponicum）“粉冠博士”的花苞誘導出不定芽，獲得試管苗。Preece等^［12］直接用葉片誘導得到叢芽；管耀義等^［13］選取高山杜鵑的嫩葉作為外植體和張楊軍等^［14］利用云錦杜鵑的葉片誘導出愈傷組織，并成功培育出組培苗。

該研究比較了高山杜鵑“23XXL”不同外植體愈傷組織誘導情況。結果表明，葉片>苞片>莖段，其中2W葉片比1W葉片和1M葉片更適合誘導愈傷組織。而苞片誘導愈傷組織周期較長，且愈傷組織分化能力較弱。該研究發現WPM+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L和WPM+ZT 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L均適合1M葉片、J2W莖段愈傷組織誘導，這與姜澤盛等^［15］利用莖段誘導愈傷的結果一致；2W葉片在6種培養基中均可誘導出愈傷組織，其中WPM+ZT 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L誘導出的愈傷組織狀態最佳；最適1W葉片誘導愈傷培養基為WPM+TDZ 0.5～1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L和MS+ZT 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L，誘導率均為100%；最適苞片誘導培養基為MS+ZT 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L，誘導率為94%；最適JM莖段誘導愈傷培養基為WPM+TDZ 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L，誘導率達87.5%。上述結果表明，ZT和TDZ均適合高山杜鵑外植體誘導，且隨著TDZ濃度的增高，愈傷組織誘導率呈上升趨勢。

不同品種高山杜鵑適合的培養基也不同^［15］。杜鵑屬組織培養常用的培養基主要有Read、Anderson、1/2MS、1/4MS、WPM等^［16］。Read培養耐寒落葉杜鵑時，研制出的Read培養基被廣泛應用；Anderson^［17］在1975年研發了Anderson培養基應用于杜鵑屬組培；李俊強^［18］用Anderson培養基對銀葉杜鵑的葉片和莖段培養，獲得很好的試驗結果；何芳蘭^［19］發現木本植物培養基（WPM和Read）對杜鵑科植物非常有效。苗永美^［20］發現WPM培養基對誘導大樹杜鵑和桃葉杜鵑愈傷組織的效果很好，但在誘導銀葉杜鵑的愈傷組織時，效果不及Read培養基；湯桂鈞等^［9］采用1/4 MS進行外植體誘導、叢芽增殖及試管苗生根試驗，效果良好。該研究結果認為，WPM培養基比MS更適合高山杜鵑外植體誘導愈傷組織，這與何芳蘭^［19］和苗永美^［20］的研究結果一致。

該研究發現葉片誘導的愈傷組織較莖段和苞片的愈傷組織分化好，其中最適1M葉片和1W葉片愈傷分化的培養基為WPM+ZT 2.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L，平均芽分化數為0.92；最佳2W葉片愈傷分化的培養基為WPM+ZT 2.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L和WPM+TDZ 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L；最適J2M莖段、JM莖段愈傷分化的培養基為WPM+TDZ 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L；表明ZT濃度為2.5 mg/L、TDZ濃度為1.5 mg/L適合高山杜鵑愈傷組織分化。

從生根試驗看出WPM+IBA 0.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L和WPM+IBA 0.5 mg/L+NAA 1.5 mg/L均適合“5RE”“6GR”和“23XXL”生根培養，生根率達88.89%～94.12%。且隨著生長素NAA濃度的升高，生根率呈上升趨勢。這與劉玉冬等^［21］ 和陳妹幼^［22］的結果一致。另外，該研究生根培養基中添加活性炭能夠促進高山杜鵑生根，這與周艷等^［23］的研究結果一致。

該研究結果為高山杜鵑組培生產提供數據支持，為進一步推動高山杜鵑產業化發展奠定基礎。

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