玉米穗腐病致病南方鐮孢菌菌株JX18-4效應蛋白的預測及分析

摘要：為挖掘與玉米受體蛋白互作進而觸發免疫反應的南方鐮孢菌效應蛋白，基于南方鐮孢菌菌株JX18-4全基因組編碼蛋白序列，利用Signal P、WoLFP SORT、Target P、TMHMM和big PI Predictor等生物信息學軟件預測出分泌蛋白684個，隨后再用EffectorP軟件預測出效應蛋白157個，隨后篩選出氨基酸殘基數lt;400且半胱氨酸殘基數≥4的效應蛋白115個。植物與寄主互作（PHI）和碳水化合物酶類（CAZymes）分析結果表明，獲得PHI和CAZymes數據庫注釋的效應蛋白數分別為14、26個。10個效應蛋白獲得PHI和CAZymes 2個數據庫注釋，其中6個候選效應蛋白的注釋結果一致。本研究所預測出的南方鐮孢菌菌株JX18-4效應蛋白將會為南方鐮孢菌引起的玉米穗腐病的致病機制及防控方法研究提供了參考依據。

關鍵詞：南方鐮孢菌；玉米穗腐病；全基因組；分泌蛋白；效應蛋白

中圖分類號：S435.131.4+9" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）23-0124-05

蘇月貴，唐照磊，杜" 青，等. 玉米穗腐病致病南方鐮孢菌菌株JX18-4效應蛋白的預測及分析［J］. 江蘇農業科學，2024，52（23）：124-128.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2024.23.017

收稿日期：2024-02-02

基金項目：廣西自然科學基金（編號：2020GXNSFAA297137）；廣西農業科學院科技發展基金（編號：桂農科2021JM39、桂農科2022JM17）。

作者簡介：蘇月貴（1984—），男，廣西靈川人，碩士，助理研究員，從事玉米抗病性研究。E-mail：suyuegui@163.com。

通信作者：杜" 青，碩士，副研究員，從事玉米抗病性研究。E-mail：duq82@163.com。

穗腐病是玉米生產上的重要病害之一，在世界范圍內普遍發生，也是我國最常見的玉米真菌病害。鐮孢菌主要引起的2種類型的玉米穗腐病，分別為鐮孢穗腐病（Fusarium ear rot，簡稱 FER）和赤霉穗腐病（Gibberella ear rot，簡稱GER）［1］，南方鐮孢（Fusarium meridionale）與禾谷鐮孢（F.graminearum）同為禾谷鐮孢復合種的不同發育種，均能引起 GER。在國外，由南方鐮孢引起的玉米穗腐病主要發生在氣候溫潤的巴西南部、阿根廷東北部和我國西南近鄰尼泊爾等地［2-4］；在我國，主要分布在西南玉米產區，如廣西、貴州、云南、四川、陜西、重慶等地，也是引起廣西玉米穗腐病的重要致病菌［5-7］。南方鐮孢穗腐病導致玉米產量損失和品質下降，更重要的是收獲感染了該病菌的果穗，可能會導致真菌毒素如雪腐鐮刀菌烯醇（nivalenol，簡稱NIV）和赤霉烯酮（zearalenone，簡稱ZEA）的污染，給人畜的生命健康構成嚴重威脅。

南方鐮孢喜好冷涼和濕度較高的環境，在22～28 ℃，開花期或收獲期遇到降雨、霧水等潮濕的環境有利于該病害的發生［7-8］。Machado等認為，巴西南方鐮孢菌株的侵染力和競爭性要強于禾谷鐮孢，導致南方鐮孢相比禾谷鐮孢處于優勢地位［2］。桂北是廣西的玉米主產區，具有冷涼、多山、多霧、多雨、寡照等氣候特點，適宜南方鐮孢生長繁殖，而玉米是該地區最主要的口糧作物之一，因此尤其需要重視該病害在該區域的防控，而選育抗性品種成為防控玉米穗腐病最經濟和安全有效的方法［9］。

植物對病原菌的侵染存在2種類型的免疫機制，被稱為PTI（PAMP-triggered immunity）途徑和ETI（effector-triggered immunity）途徑［10］，當病原菌侵染作物時，病原相關分子模式（pathogen-associated molecular paterns，PAMP）分子機制識別病原菌，啟動PTI免疫反應，該防衛反應是系統性、廣譜性的，其烈度相對較弱，因此很多病原菌能夠突破植物的PTI免疫反應而進一步增殖。病原菌為了克服植物的本底防御反應，在侵染植物時會分泌效應蛋白（effector）來抑制植物免疫反應使植物感病（effector-triggered susceptibility，ETS）。植物為了克服ETS反應，進化出了第2種防御機制ETI，即病原菌效應蛋白誘導的免疫反應。ETI反應往往伴隨著植物超敏反應的發生，是更劇烈的防衛反應，能夠在病原菌侵染點附近引起過敏性壞死反應，導致植物細胞程序性死亡，從而將病原菌限制在侵染點，具有持久性、高效性。稻瘟菌的無毒基因與植物的抗病基因相互作用符合經典的“基因對基因”理論，病原菌侵入植物體內釋放效應蛋白，植物的抗性蛋白能夠特異性識別病原菌分泌的效應蛋白，從而激活下游的免疫反應［10］。

真菌效應子大多具有以下特征：（1）氨基酸序列N端具有一段信號肽，定位在胞外；（2）無GPI錨定位點；（3）一般在侵染宿主前期階段活躍表達；（4）蛋白長度為50～400個氨基酸，并且含有大量的半胱氨酸殘基（Cys），這些參數常被用來預測真菌效應蛋白［11-12］。研究者已經開發出Signal P、WoLFP SORT、Target P、TMHMM、big PI Predictor等可以預測分泌蛋白的軟件，在此基礎上再用EffectorP軟件預測效應子。

本研究前期從一個采自廣西靖西市的玉米病穗上單孢分離得到1株南方鐮孢菌菌株JX18-4，經形態學鑒定后，采用FUSARIUM-ID v.3.0對引物延伸因子TEF-1α基因（NCBI登錄號：OR513044）進行序列比對分析，明確其為南方鐮孢菌。隨后對該菌株進行三代 Pacbio 和二代 Illumina 全基因組測序。本研究利用生物信息學軟件進行分泌蛋白和效應蛋白的序列特征預測，并利用數據庫對預測到的效應蛋白進行注釋。以期為后續南方鐮孢菌引起的玉米穗腐病的致病機制及防控機制研究提供參考依據。

1" 材料與方法

1.1" 基因組信息

南方鐮孢菌菌株 JX18-4 分離自2019年秋季廣西靖西市玉米田玉米穗腐病發病果穗，全基因組蛋白信息來源于 NCBI（登錄號：PRJNA977470），下載地址為（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/GCA_032355295.1/），該南方鐮孢菌基因組共包含11 920個蛋白。

1.2" 分泌蛋白預測

參考文獻［11-12］中的方法，使用多種軟件對基因進行預測分析。（1）使用SignalIP 5.0在線軟件（http：//www.Cbs.dtu.dk /services/SignalP /）預測分泌信號肽，保留有信號肽的基因。（2）使用SecretomeP軟件（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SecretomeP-2.0/）對缺乏信號肽的蛋白預測非經典分泌蛋白（NN-scoregt;0.5）。（3）使用TargetP軟件TargetP v2.0（http：//www.cbs.dtu.dk /services/TargetP-2.0/）對SignalP和SecretomeP預測結果所保留的基因進行TargetP分析，去除其中的線粒體蛋白。（4）利用TMHMM 2.0 sever（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對具有N-端信號肽且定位于胞外的蛋白質進行跨膜結構域分析，僅保留跨膜結構域數目≤1的蛋白質。（5）使用WoLF PSORT軟件（https：//wolfpsort.hgc.jp/）進行蛋白的亞細胞定位分析，選擇得分大于17的細胞外目的蛋白。（6）使用big-PI predictor（https：//mendel.imp.ac.at/gpi/gpi_server.html）分析錨定位點，無 GPI 錨定位點的蛋白為候選分泌蛋白。

1.3" 效應蛋白的預測

對預測出的分泌蛋白進一步進行效應子預測，利用EffectorP軟件（https：//effectorp.csiro.au/）預測分泌蛋白中的真菌的候選效應蛋白。隨后篩選出氨基酸殘基數lt;400且半胱氨酸殘基數≥4的效應蛋白［13］。

1.4" PHI 及CAZymes基因注釋

基于 PHI（Pathogen-Host Interaction database，http：/ /www.phi-base.org /downloadLink.Htm）數據庫，對預測到的效應子進行植物病原互作相關基因注釋，同時，利用CAZymes（Carbohydrate-Active enzymes，CAZymes，http：//www.cazy.org/）對分泌蛋白、候選效應蛋白與碳水化合物酶類序列進行BlastP同源性比對。優先關注E-value最低、 比對得分（score）最高的注釋，同時關注注釋基因的功能描述。

2" 結果與分析

2.1" 南方鐮孢菌分泌蛋白預測

對利用SignalIP 5.0南方鐮孢菌菌株JX18-4預測出的11 920個蛋白質進行信號肽預測，具有N端信號肽的蛋白序列有1 248個，這些蛋白屬于典型的內質網/高爾基體途徑進行運輸，并最終分泌到細胞外SP（Sec/SPI）型經典分泌蛋白。為不遺漏不具備信號肽特征卻能分泌到細胞外發揮功能的非經典分泌蛋白，SecretomeP軟件分析結果顯示，NN-score分值高于0.5的蛋白序列為5 602個。SignalIP和SecretomeP軟件分析所得的共6 850個蛋白序列采用TargetP v2.0軟件預測蛋白的亞細胞定位，去除定位在線粒體上的蛋白后，共獲得5 868個蛋白序列。采用TMHMM v2.0軟件對上述蛋白序列進行跨膜結構域分析，751個蛋白序列具有2個以上跨膜區，即分泌到其他細胞器的蛋白，僅保留跨膜結構域數≤1的蛋白序列5 117個。利用WoLF PSORT對含有上述蛋白序列進行亞細胞定位分析，794個蛋白得分大于17，是分泌到細胞外的目的蛋白。最后用big-PI predictor軟件排除含有錨定位點的蛋白序列，最終獲得684個分泌蛋白（圖1）。684個分泌蛋白中，635個蛋白是具有信號肽序列特征，占比92.84%，另外49個是不具備信號肽特征序列的非經典分泌蛋白，占比7.16%。

2.2" 效應蛋白的篩選

利用EffectorP軟件預測分泌蛋白中的真菌效應蛋白，不是效應子的蛋白序列405個，剔除掉篩選出不大可能是效應子的蛋白序列22個［可能性（probability）值lt;0.55］，預測出效應子157個（probability值≥0.55），這些效應蛋白的可能性probability為0.553～0.984不等。大多數已知效應蛋白氨基酸殘基較少且富含半胱氨酸，且缺乏保守的氨基酸序列特征，真菌效應蛋白的預測一般采用相對寬泛的標準［13］。不同研究往往采用的參數指標并不一致，本研究以蛋白序列長度小于400個氨基酸且半胱氨酸殘基數≥4的標準進一步篩選效應蛋白［11，13］，最終獲得115個符合要求的效應蛋白（圖1）。

2.3" PHI和CAZymes注釋分析

從“2.2”節中得到的115個效應蛋白序列，僅14個獲得PHI數據庫注釋（表1）。其中注釋為無毒效應子的3個， 均與稻瘟病菌誘導過敏性反應相

關；注釋為基因敲除突變體后毒力減弱的基因7個；注釋為基因敲除后突變體無致病力變化的4個。

684個分泌蛋白，獲得CAZymes注釋的基因為202個。碳水化合物結合模塊（carbohydrate-binding module，CBM）家族基因最多，為84個，糖苷水解酯酶（glycoside hydrolases，GH）家族基因次之，為78個，輔助氧化還原酶類（auxiliary activities，AA）家族基因23個，碳水化合物酯酶（carbohydrate esterases，CE）家族基因16個，多糖裂解酶（polysaccharide lyases，PL）家族基因僅1個（表2）。115個候選效應蛋白中，CBM家族基因最多，為11個，CE家族基因次之，為10個，GH家族基因為3個，AA家族基因為2個，PL家族基因未獲得注釋（表2）。

表2" JX18-4菌株分泌蛋白和效應蛋白的CAZymes家族蛋白數

類型數量（個）CBMGHAACEPL總計

分泌蛋白847823161202

候選效應蛋白113210026

10 個效應蛋白獲得PHI和CAZymes 2個數據庫注釋，6個基因的注釋基因功能一致，例如JX18-4_002683的基因功能為糖苷水解酶，JX18-4_004928、JX18-4_005073、JX18-4_010703注釋為果膠裂解酶，JX18-4_005366注釋為果膠酯酶，JX18-4_008860注釋為阿魏酸酯酶。

3" 討論

本研究基于南方鐮孢菌株JX18-4的全基因組測序后的序列分析，共預測到115個效應蛋白，其中獲得PHI數據注釋的效應蛋白為14個，獲得CAZymes注釋的基因為26個，這可能是由于大量真菌效應子還未被發掘和報道，植物病原真菌效應蛋白與寄主植物的互作機制研究報道還極不充分。14個PHI數據庫注釋的效應蛋白中，10個被CAZymes數據庫注釋，其中6個基因的注釋功能一致，說明本注釋結果具有較好的一致性。這些已報道、注釋到的基因在其他物種上影響著病害的發生程度，其是否影響玉米穗腐病的致病情況有待進一步進行研究。利用高通量測序技術預測分泌蛋白和效應蛋白，能極大程度地為后續研究進行前期篩選。隨著病原真菌和植物寄主間的互作機理研究逐漸深入，大量病原菌效應蛋白將會不斷被鑒定和報道，合理利用預測出的115個南方鐮孢效應蛋白序列，與已報道、影響致病力的效應蛋白序列進行序列比對，將有利于闡明南方鐮孢菌與玉米的互作機制。隨著測序技術的發展，真菌全基因組測序價格快速降低，基于全基因組測序后的真菌效應蛋白預測，能大大加快真菌效應蛋白的挖掘進程。

JX18-4_002683、JX18-4_003263和JX18-4_005485共3個基因注釋為無毒效應蛋白，誘導過敏性壞死反應。JX18-4_002683注釋到的基因MoCDIP4作用是誘導細胞死亡，包含1個糖基水解酶家族結構域和1個真菌纖維素結合結構域，C末端的纖維素結合結構域在誘導細胞死亡中具有重要的功能［14］。JX18-4_003263注釋到的稻瘟病病菌基因MgSM1，無論是在真菌生長還是在水稻的初侵染過程中都能組成型表達，在擬南芥中通過上調防衛基因的表達引起葉片的過敏性反應［15］。JX18-4_005655注釋到的MoCDIP1基因的N端PbH1 motif基序功能為誘導植物細胞過敏性壞死［14］。這3個基因作為稻瘟病菌的無毒基因，侵入寄主細胞后，可能與植物細胞中的R基因發生互作，可誘導寄主產生過敏性壞死反應，從而導致寄主抗病。然而，南方鐮孢菌作為玉米穗腐病、玉米莖腐病、小麥赤霉病、水稻赤霉病和大豆莢枯病［5-7，16］的致病菌，是否會在玉米葉片、莖稈、籽粒組織中引起ETI免疫應答反應還尚待后續驗證。廣西玉米育種家當前極缺乏玉米赤霉穗腐病優異抗源，筆者所在項目組前期已經鑒定出CML287、CML362等極少量抗南方鐮孢菌穗腐病的玉米自交系，但其抗病機制尚不明確，從抗病自交系中發掘出與無毒效應子互作的抗病基因，合理利用其劇烈的ETI防衛反應機制，對于玉米抗穗腐病育種具有重要價值。

玉米籽粒中富含淀粉，主要存在于玉米胚乳中，纖維素主要存在于玉米的種皮和內皮中，果膠作為一種半乳糖醛酸的聚合多糖，存在于玉米的種皮或細胞壁中。注釋到的部分效應蛋白為潛在的淀粉、纖維素、果膠等物質降解酶。植物病原真菌分泌到胞外的碳水化物酶是一類重要的活性蛋白，依據這些酶的氨基酸序列的保守結構域，將這些活性酶歸入不同的蛋白質家族，其功能結構域可能通過作用于寄主的糖復合物、寡糖和多糖等方式，從而降解玉米籽粒中的多種物質。26個獲得CAZymes注釋的效應蛋白中，碳水化合物結合模塊（CBM）家族11個，碳水化合物酯酶（CE）家族11個。JX18-4_004928、JX18-4_005073和JX18-4_010703等3個基因的PHI和CAZymes數據庫注釋均為果膠裂解酶，CAZymes數據庫注釋均為CBM1亞家族，CBM1亞家族被稱為纖維素結合模塊蛋白，例如，里氏木霉的Cel7A酶中含有該蛋白，EC分類號為3.2.1.176，其底物為纖維素［17］。

南方鐮孢與禾谷鐮孢為禾谷鐮孢復合種的不同發育種［5］，禾谷鐮孢菌模式菌株PH-1與本研究中南方鐮孢菌菌株JX18-4具有極高的共線性關系（另文發表），利用已報道禾谷鐮孢菌致病相關基因與南方鐮孢菌菌株JX18-4進行序列比對，基因預測會更為準確。PHI數據庫注釋結果顯示，3個效應蛋白的E-value值為0，JX18-4_005655、JX18-4_007996和JX18-4_008860對應的物種均為禾谷鐮孢菌，說明這3個效應蛋白與注釋基因高度同源。只有JX18-4_007996注釋基因FGL1明確為侵染小麥赤霉病和玉米穗腐病的毒力因子，具有細胞外脂肪酶分解活性［18］。然而，禾谷鐮孢效應蛋白與玉米靶標蛋白互作調控玉米穗腐病抗性機制的報道尚不充分，亦未見南方鐮孢菌效應蛋白相關的報道。本研究所預測出的115個南方鐮孢菌效應蛋白，可能對禾谷鐮孢菌引起的病害亦具有一定參考價值。

前人的研究已成功定位了大量玉米抗禾谷鐮孢菌引起的赤霉穗腐病QTL［19］，卻未見明確抗赤霉穗腐病基因的相關報道。這可能是由于玉米的基因組較大，采用常規QTL定位方法，抗病QTL定位區間往往過大且表型解釋率較低，難以聚焦到寄主中與效應蛋白互作的、免疫反應相關的蛋白質。為了闡明玉米抗病基因與鐮孢菌的互作機制，鑒定并明確南方鐮孢效應蛋白，通過酵母雙雜交技術，利用效應蛋白作為誘餌，篩選與效應蛋白互作的玉米靶標蛋白，縮小候選抗病基因的篩選范圍。本研究結果可為南方鐮孢效應蛋白與玉米靶標蛋白互作機制、抗玉米穗腐病基因的挖掘及分子育種奠定基礎。

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