gga-miR-130b-3p在雞脂肪相關組織中的表達規律及其靶基因的生物信息學分析

摘要：為探究gga-miR-130b-3p對雞脂肪沉積的作用，以江蘇省家禽科學研究所自主培育的矮小品系S3系和引進的國外肉雞品種隱性白羽雞為試驗素材，檢測gga-miR-130b-3p在2個品種0日齡、2周齡、8周齡、14周齡、16周齡肝臟、腹脂、腿肌和肌內脂肪細胞中的表達變化，并對靶基因進行預測、分析。結果顯示，0 W與 16 W 肝臟組織中gga-miR-130b-3p的表達水平存在明顯品種差異，且在S3系雞中gga-miR-130b-3p的表達水平顯著高于隱性白羽雞（Plt;0.05）；與其他周齡相比，0 W時腹部脂肪組織中gga-miR-130b-3p的表達量較高（Plt;0.01）；在腿肌組織中，2個品種間8 W與14W時gga-miR-130b-3p的表達有顯著性差異（Plt;0.05），隱性白羽雞8 W的表達顯著高于S3系雞，14 W時S3系雞的表達顯著高于隱性白羽雞（Plt;0.05）；在腹脂細胞和肌內脂肪細胞中，gga-miR-130b-3p分化4 d后的表達均顯著高于增殖期（Plt;0.01）。靶基因預測分析表明，gga-miR-130b-3p共預測到70個交集靶基因。GO和KEGG分析結果表明，ULK2和GRB10是gga-miR-130b-3p的預測靶基因。綜合所述，gga-miR-130b-3p在雞不同發育時期的表達存在顯著的品種和組織差異性，gga-miR-130b-3p很可能是通過ULK2和GRB10調控脂肪沉積。

關鍵詞：雞；gga-miR-130b-3p；組織；細胞；表達分析；脂肪沉積

中圖分類號：S831.2" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）23-0181-06

李瑞瑞，宗" 毅，趙振華，等. gga-miR-130b-3p在雞脂肪相關組織中的表達規律及其靶基因的生物信息學分析［J］. 江蘇農業科學，2024，52（23）：181-186.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2024.23.025

收稿日期：2023-11-09

基金項目：現代農業產業技術體系建設專項（編號：CARS-41-Z05）；江蘇省種業振興揭榜掛帥項目［編號：JBGS（2021）109、JBGS（2021）029］；國家家養動物種質庫建設項目（2023）；國家自然科學基金（編號：32102538）；廣東省自然科學基金（編號：2022A1515012014）。

作者簡介：李瑞瑞（1998—），女，山東泰安人，碩士，主要從事家禽遺傳育種研究。E-mail：liruirui117@163.com。

通信作者：向" 海，博士，副教授，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究。E-mail：xh@fosu.edu.cn。

雞肉是一種高蛋白、低脂、低膽固醇的食品，在人們的日常餐桌上占有重要地位。近年來，優質肉雞生長性能不斷改良，但同時也伴隨著腹部脂肪的過度沉積。腹部脂肪的過度沉積會降低飼料轉化效率，而脂肪沉積在肌肉中則會提高嫩度和風味［1］。因此，有效控制家禽脂肪沉積，對于優質肉雞培育和肉質改善是非常有意義的。

microRNAs（miRNAs）長度為21～30個堿基，它是一種小的、非編碼的RNA分子，附著在mRNA的3′-非翻譯區域（3′-UTR）上，作用主要是負向調節靶基因［2］。gga-miR-130b-3p是屬于miR-130/301家族的一種多功能因子，在不同疾病與生物學過程中均發揮了作用。miR-130b-3p在不同的癌癥類型中具有組織特異性，如gga-miR-130b-3p過表達，可以在甲狀腺腺瘤［3］和上皮性卵巢癌［4］中作為癌基因，也可以在乳腺癌［5-6］和卵巢癌［7］中發揮抑癌作用。miR-130b通過靶向Sp1轉錄因子抑制肌母細胞增殖并促進肌源分化［8］，miR-130b-3p通過靶向CHD9在結直腸癌腫瘤發生中起致癌作用［9］，miR-130b通過靶向PTEN可顯著促進膀胱癌細胞的遷移、侵襲和增殖［10］。

近年來，有文獻報道miR-130b-3p不但參與了疾病調控，同時也參與了哺乳動物脂肪代謝的調控過程。miR-130b可降低人類肌肉細胞的靶基因PPARGC1A的表達，在人類肥胖相關代謝疾病發病機制中起關鍵作用［11］；miR-130b可以調控參與膽固醇脂蛋白運輸的關鍵蛋白質的表達［12］；gga-miR-130b-3p在雞上研究還有很大的空間可以完善。有研究報道gga-miR-130b-3p通過靶向IBDV基因組和抑制SOCS5來抑制傳染性法氏囊病病毒的復制［13］。目前，對于gga-miR-130b-3p與優質肉雞脂肪沉積（腹脂和肌內脂肪沉積）的直接關系尚未見詳細報道。矮小型S3系雞是通過導入矮小基因（dw）并經多個世代的選育所形成的遺傳性能穩定的品系種，體質量低于正常雞40%左右，但脂肪沉積也更嚴重［14-15］，是研究脂肪沉積的理想模型。研究表明，性連鎖矮小雞的GHR基因突變能引起脛骨變短、肌肉量變少、基礎代謝率降低、血液胰島素樣生長因子1（IGF-1）含量降低、血液生長激素含量升高、耐熱性升高、飼料利用率升高［16］等一系列生理和表型性狀的改變。本研究以江蘇省家禽科學研究所自主選育的矮小品系S3和隱性白羽雞（RR）為試驗材料，分析gga-miR-130b-3p在肝臟、腹脂、腿肌組織、腹脂和肌內脂肪細胞增殖期和分化期的表達差異，將為明確miR-130b-3p對脂肪沉積的作用提供重要的前期研究基礎。

1" 材料與方法

1.1" 試驗材料

試驗動物：0日齡（0 W）、2周齡（2 W）、8周齡（8 W）、14周齡（14 W）、16周齡（16 W）江蘇省家禽科學研究所矮小品系S3系雞（DW）和隱性白羽肉雞（RR）各6羽。S3系雞是利用矮小基因DW培育而成的優質肉雞，體型較小，生長速度較慢；隱性白羽肉雞屬于快大型肉雞，體型較大、生長周期短、肉質好。試驗雞由江蘇省家禽科學研究所邵伯試驗基地提供，雞飼養期為2022年5—10月；試驗在江蘇農業科學院家禽研究所完成。

主要儀器：高壓滅菌鍋（TOMY/SX-500，日本TOMY公司），分光光度計（NanoDrop 2 000）、CO2細胞培養箱（3111），均購自美國Thermo公司；PCR擴增儀（CFX96）、熒光定量PCR擴增儀（9902），均購自美國applied biosystems公司。

主要試劑和耗材：胎牛血清（FBS，以色列BI公司），青鏈霉素混合液（美國Gibco公司），DME/F12培養基（SH30023.01，美國HyClone公司），D-HANKS（北京Solarbio公司），Ⅰ型膠原酶（北京英坊科技有限公司），油酸（美國Sigma公司），總RNA提取試劑盒（DP419）、miRcute增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒（KR211-02）、miRcute增強型miRNA熒光定量檢測試劑盒（FP411-02）均購自天根生化科技（北京）有限公司，75%乙醇（德州名德消毒科技有限公司），15 mL離心管、10 cm培養皿、12孔板，均購自美國Corning公司。

1.2" 樣品采集

對不同周齡試驗雞的肝臟、腹脂和腿肌進行取樣，將收集到的樣品快速的放到液氮中進行冷凍，在-80 ℃的環境下進行保存待用。

1.3" 細胞培養

將S3系7日齡母雞置于盛有75%乙醇的燒杯中直至死亡，取腹部脂肪和腿部肌肉，放入裝有 D-HANKS 的6 cm進口培養皿內，清洗2～3次。

將腹脂組織剪成小碎塊，然后轉移至15 mL的進口離心管中，再加入1.0～1.5倍的0.1% Ⅰ型膠原酶，在37 ℃培養箱中進行1 h消化，直至變成肉糜，再加入等體積的全培養基，使其停止消化，使用尼龍膜過濾后收集濾液并離心，去除上清液后使用10%的全培養基懸浮細胞沉淀，將培養皿放入 37 ℃ 細胞培養箱中培養。細胞融合至70%時進行傳代鋪板。

將腿部肌肉組織剪碎后，轉移至15 mL的進口離心管中，再加入1.0～1.5倍的0.1% Ⅰ型膠原酶，置于37 ℃培養箱中進行1.5 h消化，直至變成肉糜，再加入等體積的全培養基，使其停止消化，然后進行離心。吸取上清液至T25瓶中，添加完全培養基裝滿T25，放入37 °C細胞培養箱中倒置培養。細胞融合至70%時進行傳代鋪板。

細胞傳代后繼續培養融合至70%，未添加油酸組的為增殖期細胞，另一組用0.1%油酸誘導分化并將此時定義為分化0 h，收集增殖期分化后1、4、6 d 的細胞。

1.4" 引物設計與合成

本項目擬在前期工作的基礎上，以miRbase中的雞gga-miR-130b-3p序列（登錄號：MIMAT0026503）為切入點，采用 miRNAs Design v1.01軟件，以U6為內參，設計1條引物并由生工生物工程有限責任公司進行合成。引物信息見表1。

1.5" 反轉錄合成與QPCR試驗

利用miRNA提取分離試劑盒對不同組織和細胞樣本中的總RNA進行提取，RNA濃度和純度采用紫外分光光度計檢測（1.8≤D260 nm/D280 nm≤2.0）。使用加A法，每個樣本取3 μL總RNA進行反轉錄，然后放置于-20 ℃冰箱保存。

miRNA的熒光定量檢測使用SYBR Green Ⅰ嵌合熒光法，以U6為內參考基因在Aplied Biosystems 7500熒光定量PCR系統進行PCR反應。每個樣本重復2次，參照日齡為矮小品系S3雞0 W的表達量，內參基因為U6。miRNA相對表達采用2-ΔΔCT方法進行計算。

1.6" 靶基因預測及功能分析

本研究采用3種在線軟件TargetScan、miRDB、miRmap等，篩選出gga-miR-130b-3p調控的下游靶基因。為了避免單一軟件預測到的靶基因過少，并降低預測結果的假陽性，所以對3個軟件預測中至少出現2次的基因進行選取。采用DAVID、KOBAS 3.0等在線工具，對得到的目標基因進行了GO功能分析和KEGG pathway富集分析。

1.7" 數據處理

利用2-ΔΔCT方法，對gga-miR-130b-3p在雞各組織中的表達水平進行比較研究。結果以“平均值±標準偏差”為標準。使用SPSS 26.0軟件對其進行了單因素方差分析，Plt;0.05表示差異顯著，Plt;0.01表示差異極顯著。

2" 結果與分析

2.1" gga-miR-130b-3p在肝臟組織中的表達

由圖1可知，gga-miR-130b-3p在0 W和 16 W 肝臟組織中的表達存在明顯的品種特異性（Plt;0.05）。DW的表達量在5個時間點的表達均高于RR。RR在0 W的表達顯著高于其他周齡（Plt;0.05）。RR在8 W時，gga-miR-130b-3p的表達量較0、14周齡顯著降低（Plt;0.05）。

2.2" gga-miR-130b-3p在腹脂組織中的表達

由圖2可知，gga-miR-130b-3p在2個品種腹脂組織中的表達模式有一定的差異。gga-miR-130b-3p在RR與DW中0 W時表達量最高且極顯著高于其他周齡（Plt;0.01），而在2 W后gga-miR-130b-3p的表達相對穩定，至16 W仍保持在這種低表達水平。

2.3" gga-miR-130b-3p在腿肌中的表達

由圖3可知，在8 W與14 W的腿肌肉組織中，gga-miR-130b-3p的表達有明顯的品種差異（Plt;

0.05），在8 W時，在DW中，gga-miR-130b-3p的表達明顯高于RR，但在14 W時，gga-miR-130b-3p的表達明顯低于RR（Plt;0.05）。DW各周齡間gga-miR-130b-3p的表達量無顯著差異（Pgt;0.05）；在RR，gga-miR-130b-3p的表達在8 W時最低，至14 W時則顯著升高。

2.4" gga-miR-130b-3p在脂肪細胞中的表達

在雞腹脂脂肪細胞中，由圖4-A可知，分化 4 d 和6 d，gga-miR-130b-3p的表達顯著高于增殖期（Plt;0.05）；在肌內脂肪細胞中，圖4-B可知，gga-miR-130b-3p在分化期的表達極顯著高于增殖期（Plt;0.01），在分化4 d達到高峰，且至6 d時維持高表達量。

2.5" gga-miR-130b-3p靶基因預測及功能分析

由圖5可知，通過不同在線軟件預測到的gga-miR-130b-3p靶基因個數，TargetScan為557個，miRDB為994個，miRmap為1 625個，3個軟件預測結果的交集靶基因為70個。

由70個靶基因的GO功能富集分析結果（圖6）可知，靶基因主要富集于生物學過程分類中的細胞內信號轉導、河馬信號的負調控、信號轉導、早期內體等過程；細胞組分分類中的早期內吞體膜、粘連結點、溶質：質子逆向轉運蛋白活性、電壓門控氯通道活動；分子功能分類中的Tau蛋白激酶活性、肝

素結合、胰島素受體結合、無序的結構域特異性結合、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、金屬氨基肽酶活性等。KEGG pathway富集分析結果（圖7）表明，靶基因主要富集到代謝途徑（HPRT1、UXS1、MAT2B）、mTOR信號通路（ULK2、RRAGD、GRB10）、自噬-動物（ULK2、RRAGD、ATG16L1、PRKACB）、內吞作用（SNX2、STAM、CLTC）等途徑中。

3" 討論

本研究結果表明，在肝臟組織中，gga-miR-130b-3p在S3系雞和隱性白羽雞中表達規律有所差異，S3系雞gga-miR-130b-3p在肝臟中的表達量始終高于隱性白羽雞，在腹脂組織中，0～2 W隱性白羽雞gga-miR-130b-3p的表達量高于S3系雞。在腿肌組織中gga-miR-130b-3p的表達量8 W以前S3系雞高于隱性白羽雞，這可能是早期發育中隱性白羽雞腿肌的脂肪沉積早于S3雞。綜上所述，gga-miR-130b-3p參與了脂肪沉積的過程，且在不同品種中參與脂肪調控的時間及充當的角色均是不同的。gga-miR-130b-3p在體外腹脂和肌內脂肪細胞增殖期均顯著低于分化后期，推測gga-miR-130b-3p主要在脂肪細胞分化期起調控作用。有文獻研究報道，miR-130b通過靶向PPAR-γ抑制人原代前脂肪細胞和3T3-L1小鼠脂肪細胞中脂肪生成［17］，miR-130b-3p能夠以胞外囊泡的形式進入到脂肪細胞中，并且能夠抑制豬前體脂細胞的脂肪分化［18］；miR-130b-3p通過靶向KLF3抑制山羊肌內脂肪細胞分化［19］；miR-130b 通過靶向肉牛PPARG和CYP3U2的 1′UTR 直接影響脂肪細胞分化［20］；在家兔中miR-130b抑制前體脂肪細胞分化；在雞肝癌細胞中，INSIG1基因下調導致ACSL1、MTTP-L、ApoB、ApoVLDLII基因表達及甘油三酯及甘油含量顯著降低，miR-130b-3p直接靶向INSIG1基因［21］。因此推測，miR-130b-3p可能參與了家禽和哺乳動物的脂肪代謝過程，此外，miR-130b-3p對脂肪細胞分化和脂肪細胞增殖也具有重要作用。

gga-miR-130b-3p通過不同的靶基因在不同物種的相關性狀中發揮作用，如何準確預測靶基因是研究miRNA功能的難點和重點問題。本研究采用3種預測軟件共篩選到70個預測靶基因，顯著富集在代謝途徑、mTOR等信號通路，其中富集在mTOR信號通路里的ULK2和Grb10與脂肪代謝密切相關。ULK2調節脂肪細胞的脂質代謝和葡萄糖攝取［22］；Grb10通過抑制mTORC1磷酸化依賴反饋促進脂肪分解和產熱［23］，通過對小鼠模型的研究發現Grb10蛋白可以促進大腦中瘦素（Leptin）的活性，Grb10直接與神經元上的瘦素受體結合，形成復合物，增強瘦素信號，有助于減少食物攝入，增加能量消耗［24］。gga-miR-130b-3p對優質肉雞腹脂和肌內脂肪沉積的具體作用及其靶向基因的鑒定，在后期的研究中將會進一步通過體外功能試驗來證實。

4" 結論

gga-miR-130b-3p在不同發育階段的肝臟、腹脂和腿肌組織中存在差異表達模式。推測gga-miR-130b-3p對雞脂肪代謝的調控主要是通過mTOR通路來實現，ULK2和Grb10將是重點關注的靶基因。

參考文獻：

［1］Zerehdaran S，Vereijken A L J，van Arendonk J A M，et al. Estimation of genetic parameters for fat deposition and carcass traits in broilers［J］. Poultry Science，2004，83（4）：521-525.

［2］Lu J，Shen Y，Wu Q F，et al. The birth and death of microRNA genes in Drosophila［J］. Nature Genetics，2008，40（3）：351-355.

［3］Leone V，Langella C，Esposito F，et al. miR-130b-3p upregulation contributes to the development of thyroid adenomas targeting CCDC6 gene［J］. European Thyroid Journal，2015，4（4）：213-221.

［4］Zhou D B，Zhang L Y，Sun W W，et al. Cytidine monophosphate kinase is inhibited by the TGF-β signalling pathway through the upregulation of miR-130b-3p in human epithelial ovarian cancer［J］. Cellular Signalling，2017，35：197-207.

［5］Ahn S，Kwon A，Huh Y H，et al. Tumor-derived miR-130b-3p induces cancer-associated fibroblast activation by targeting SPIN90 in luminal A breast cancer［J］. Oncogenesis，2022，11（1）：47.

［6］Shui Y F，Yu X J，Duan R，et al. miR-130b-3p inhibits cell invasion and migration by targeting the Notch ligand Delta-like 1 in breast carcinoma［J］. Gene，2017，609：80-87.

［7］Chan C K，Pan Y H，Nyberg K，et al. Tumour-suppressor microRNAs regulate ovarian cancer cell physical properties and invasive behaviour［J］. Open Biology，2016，6（11）：160275.

［8］Wang Y C，Yao X H，Ma M，et al. miR-130b inhibits proliferation and promotes differentiation in myocytes via targeting Sp1［J］. Journal of Molecular Cell Biology，2021，13（6）：422-432.

［9］Song D，Zhang Q，Zhang H，et al. miR-130b-3p promotes colorectal cancer progression by targeting CHD9［J］. Cell Cycle，2022，21（6）：585-601.

［10］Lu Q，Liu T Y，Feng H J，et al. Circular RNA circSLC8A1 acts as a sponge of miR-130b/miR-494 in suppressing bladder cancer progression via regulating PTEN［J］. Molecular Cancer，2019，18（1）：111.

［11］Wang Y C，Li Y Y，Wang X Y，et al. Circulating miR-130b mediates metabolic crosstalk between fat and muscle in overweight/obesity［J］. Diabetologia，2013，56（10）：2275-2285.

［12］Wagschal A，Najafi-Shoushtari S H，Wang L F，et al. Genome-wide identification of microRNAs regulating cholesterol and triglyceride homeostasis［J］. Nature Medicine，2015，21（11）：1290-1297.

［13］Fu M J，Wang B，Chen X，et al. MicroRNA gga-miR-130b suppresses infectious bursal disease virus replication via targeting of the viral genome and cellular suppressors of cytokine signaling 5［J］. Journal of Virology，2017，92（1）：e01646-e01617.

［14］Nawaz A H，Lin S D，Wang F J，et al. Investigating the heat tolerance and production performance in local chicken breed having normal and dwarf size［J］. Animal，2023，17（3）：100707.

［15］Guillaume J. The dwarfing gene dw：its effects on anatomy，physiology，nutrition，management.its application in poultry industry［J］. Worlds Poultry Science Journal，1976，32（4）：285-305.

［16］Burnside J，Liou S S，Zhong C，et al. Abnormal growth hormone receptor gene expression in the sex-linked dwarf chicken［J］. General and Comparative Endocrinology，1992，88（1）：20-28.

［17］Lee E K，Lee M J，Abdelmohsen K，et al. miR-130 suppresses adipogenesis by inhibiting peroxisome proliferator-activated receptor γ expression［J］. Molecular and Cellular Biology，2011，31（4）：626-638.

［18］何洪炳，蔡明成，梁小虎，等. miR-130b靶向PPARγ抑制家兔前體脂肪細胞分化［J］. 畜牧獸醫學報，2017，48（11）：2076-2083.

［19］范彩紅，楊" 磊，楊" 瀾，等. miR-130b-3p靶定AMPK基因抑制糖饑餓誘導的宮頸癌細胞自噬性死亡［J］. 實用醫學雜志，2022，8（1）：31-37.

［20］Ma X Y，Wei D W，Cheng G，et al. Bta-miR-130a/b regulates preadipocyte differentiation by targeting PPARG and CYP2U1 in beef cattle［J］. Molecular and Cellular Probes，2018，42：10-17.

［21］Yue Y X，Liu Z M，Zhang K，et al. Functional and miRNA regulatory characteristics of INSIG genes highlight the key role of lipid synthesis in the liver of chicken （Gallus gallus）［J］. Poultry Science，2023，102（2）：102380.

［22］Ro S H，Jung C H，Hahn W S，et al. Distinct functions of Ulk1 and Ulk2 in the regulation of lipid metabolism in adipocytes［J］. Autophagy，2013，9（12）：2103-2114.

［23］Liu M L，Bai J L，He S J，et al. Grb10 promotes lipolysis and thermogenesis by phosphorylation-dependent feedback inhibition of mTORC1［J］. Cell Metabolism，2014，19（6）：967-980.

［24］Liu H L，He Y，Bai J L，et al. Hypothalamic Grb10 enhances leptin signalling and promotes weight loss［J］. Nature Metabolism，2023，5（1）：147-164.