小葉楊PsWOX11基因對側根生長發育的影響

摘要：[目的]分析小葉楊PsWOX11基因對側根生長發育的影響，為研究木本植物WOX11基因調控側根生長發育的分子作用機制提供參考。[方法]利用生物信息學方法鑒定小葉楊PsWOX11基因，并對基因、蛋白結構以及保守序列等進行分析。利用qRT-PCR技術分析PsWOX11基因組織特異性表達模式。創制轉基因植株35S：：PsWOX11（OE）和35S：：PsWOX11-SRDX（DR），分析過表達和顯性抑制PsWOX11基因對轉基因楊樹側根生長發育的影響。[結果]PsWOX11基因編碼區核苷酸序列長度為768 bp，編碼255個氨基酸殘基，在楊樹主根和側根中表達豐度相對較高。創制了7個PsWOX11過表達轉基因楊樹株系和8個顯性抑制轉基因楊樹株系，對不同基因型楊樹進行表型及顯微形態觀察發現，與非轉基因84K楊相比，過表達PsWOX11轉基因楊樹的側根長度、直徑均顯著增加，而顯性抑制轉基因楊樹表型相反。[結論] PsWOX11基因參與調控楊樹的側根的生長發育，促使側根的長度和直徑增加，該研究為進～步揭示WOX11基因參與調控小葉楊根系生長提供了參考依據。

關鍵詞：小葉楊；PsWOX11；側根；根生長；根直徑

中圖分類號：S718.46 文獻標識碼：A 文章編號：1001-1498（2024）06-0054-08

wox（ WUSCHEL-related homeobox）是植物特有的一類轉錄因子，包含由65～66個氨基酸殘基組成的同源異型結構域（ Homeodomain，HD）。不同wox成員通過在轉錄水平上調控下游靶基嗣的表達，參與植物的生長發育，包括植物胚胎建成、干細胞維持和器官發生等，還響應干旱、鹽和冷脅迫等非生物脅迫。

wox家族基因對于植物地上部分生長發育的調控研究，主要包括參與芽、莖、葉、花、果實、種子等器官、組織形成等，例如，楊樹（ PopulusalbaxP.glandulosa）PagWOX11轉錄因子通過激活促芽因子和分生組織調節因子，如PiCUC2、PiCUC3和PiWUS等基因的表達，促進芽的從頭再生。WOX4轉錄因子作為莖部形成層活性調控的樞紐，能夠響應多種激素、小肽等信號，進而維持形成層細胞的分裂和分化。煙草（NIcotiana sylvestris）NsWOX9轉錄因子通過對STF和LAM1的拮抗作用調控葉片發育，維持正確的葉片結構和模式。擬南芥（Arabidopsis thaliana）和水稻（Oryza sat/vaL japonica）WOX13轉錄因子在花序組織形成過程中被誘導表達，影響花的發育。黃瓜（Cucumis sativus L.） CsWOX9轉錄因子在發育的果實中表達，且過表達Cs WOX9導致轉基因擬南芥的角果變短。WOX2轉錄因子在胚胎發育早期的原表皮形成中發揮著重要作用，且功能相對保守。然而，對于植物地下部分，毛白楊（Populus tomentosa Carri6re） PtoWOX5a轉錄因子參與楊樹不定根的發育，過表達PtoWOX5a基因導致轉基因楊樹不定根數量增加，但長度相對減少。機械損傷誘導的生長素可以激活擬南芥AtWOX11/12基因的表達，進而調控AtLBD16和AtLBD29基因的轉錄，介導了離體葉片再生潛能細胞向根創始細胞轉變。AtWOX11/12蛋白還可以直接激活AtWOX5/7基因的表達，促進根創始細胞到根原基的轉變。水稻OsWOX11/12基因促進過表達轉基因水稻冠根分生組織的細胞增殖、伸長等，導致不定根的數量和生長增加，提高了根系生物量。

近年來，研究人員對wox轉錄因子的研究多集中在草本植物中，而對于林木研究較少。由于樹木生理、形態結構及生長發育等方面有著明顯的區別，所以木本植物wox家族成員的功能可能更加多元化，尤其是在影響莖段形成層活動、莖段不定根的發生和生長發育以及側根的形成等方面。楊樹是重要的速生造林樹種，也是木本植物分子生物學研究的模式樹種。小葉楊（Populus simonn Carriere）屬青揚派，是我國北方地區的主要鄉土樹種，具有抗逆性強、適應性廣、易繁殖和壽命長等特點，因其根系發達、抗性優良被廣泛用于防風固沙，改善生態環境。因此，wox家族成員可能在側根形成方面發揮著重要功能。本研究以小葉楊為研究材料，克隆和分析了小葉楊PsWOX11的基因序列和組織表達特異性，并以銀腺楊（Populus albaxP.glandulosa，‘84K’）為遺傳轉化材料，創制PsWOX11過表達和顯性抑制的轉基因楊樹，探討PsWOX11基因對側根生長發育的影響，為進一步闡明wox基因在木本植物側根發生和生長發育中的作用機制提供幫助，也為后續林木分子設計育種提供理論指導。

1材料與方法

1.1研究材料

小葉楊用于基因克隆和基因表達分析，銀腺楊用于穩定遺傳轉化和功能分析。小葉楊組培苗培養于固體培養基中，其成分包括MS基礎培養基，0.4 mg·L-1 IBA，5g·L-1瓊脂粉和20 g·L-1蔗糖，pH5.8-6.0；84K楊組培苗培養于固體培養基中，其成分包括1/2MS基礎培養基，0.05 mg·L-1 IBA，0.02 mg·L-1 NAA，5 g·L-1瓊脂粉和30 g·L-1蔗糖，pH5.8～6.0。所有植物材料均由中國林業科學研究院林木遺傳育種全國重點實驗室保存，人工氣候室條件為25℃，16 h/8h光照，黑暗，50 umol·m-2 s-1光照強度。組培苗在培養基中生長3周后，將組培苗轉入營養土（土壤：珍珠巖=3：1）中，并置于溫室繼續培養。

1.2研究方法

1.2.1基因序列分析 使用在線網站ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）分析Ps-WOX11蛋白的理化性質。利用DNAMAN軟件進行多序列比對分析，所有物種的WOX11蛋白氨基酸序列都來源于GenBank數據庫。

1.2.2基因組織表達特異性分析 利用植物總RNA提取試劑盒（TIANGEN，中國）提取3周齡小葉楊組培苗不同組織的總RNA，包括主根、側根、莖和幼葉，提取方法參照說明書。將總RNA去除基因組DNA污染后，利用PrimeScriptRT reagent Kit（TaKaRa，日本）反轉錄成cDNA，反應體系及條件參照說明書。利用Primer5軟件設計PsWOX11的定量引物PsWOX11-RT-F和PsWOX11-RT-R（表1）。利用SYBR PremixEx Taq Kit（TaKaRa，日本）定量試劑及實時熒光PCR儀器Light Cycler 480（Roche Applied Science，Penzberg，德國）進行qRT-PCR分析。選用PsActin作為內參基因，且進行3次生物學重復和3次技術重復，根據2-△△方法進行計算基因相對表達量。

1.2.3植物表達栽體構建和遺傳轉化 以小葉楊根部總RNA反轉錄成的cDNA為模板，使用PrimeSTAR HS DNA Polymerase（TaKaRa，日本）對PsWOX11基因編碼區全長序列進行擴增，將其與克隆載體pMD 19-T（TaKaRa，日本）相連接，并進行測序、比對和鑒定。以含有PsWOX11基因的pMD 19-T質粒為模板，利用GATEWAY技術，設計正向和反向引物序列（表1），擴增PsWOX11基因編碼區全長核苷酸序列，通過BP反應將其與中間載體pDNOR207相連接，再通過LR反應與強啟動子CaMV35S（Cauliflower mosaic virus 35S）融合，構建到植物過表達載體pMDC32中；同時，設計帶有EAR（ERF-associated amphiphilic repression）抑制結構域的反向引物序列（SRDX序列）（表1），與構建過表達載體同樣的方式構建顯性抑制植物表達載體。

利用農桿菌電擊轉化法，將獲得的PsWOX11基因植物過量表達載體和顯性抑制植物表達載體分別轉至農桿菌感受態細胞GV3101中（上海唯地生物技術有限公司，中國）。采用農桿菌侵染楊樹愈傷組織的遺傳轉化方法轉化84K楊，簡言之，愈傷組織經過農桿菌侵染后，置于含有200 mg·L-3特美汀和3 mg·L-1潮霉素的芽分化誘導培養基上誘導、篩選抗性芽，再將不定芽移至含有同樣濃度潮霉素和特美汀的生根培養基中誘導生根，形成完整植株。摘取幼苗葉片，提取基因組總DNA和總RNA作為模板，利用表1中引物通過PCR擴增和qRT-PCR技術對其進行分子鑒定，包括基因組DNA水平和RNA水平。

1.2.4轉基因植株側根表型鑒定 選取大小一致（高度約3 cm，帶有2～3片幼葉）的非轉基因84K楊、PsWOX11基因過表達和顯性抑制的轉基因楊樹頂端，分別扦插于1/2 MS固體培養基中培養3周，觀察PsWOX11對側根長度的影響，并截取距離根尖頂端相同距離（1 cm）的側根進行橫切解剖，統計側根直徑。每次試驗至少設置3個生物學重復，每個基因型楊樹至少包含10株個體。

1.2.5數據統計 使用軟件IBM SPSS Statistics23對統計的數據進行分析，使用f檢驗法分析差異顯著水平。

2結果與分析

2.1PsWOX11基因克隆和序列分析

根據小葉楊基因組信息（http：//www.populus-superpangenome.com/species/Populus__ simonii），從小葉楊中克隆了一個wox基因，其全長編碼區核苷酸序列長度為768 bp，可編碼255個氨基酸殘基，該蛋白的分子量約為28.12 kDa，等電點為5.69。多序列比對顯示，不同物種的核苷酸和氨基酸序列相似性較高，編碼的WOX11蛋白質序列在N端都有一個高度保守的61個氨基酸殘基組成的同源盒結構域，其中該基因與毛果楊PtWOX11基因的核苷酸序列相似度為99.61％，蛋白質序列相似度為99.22％，與84K楊PagWOX11基因的核苷酸序列相似度為98.31％，蛋白質序列相似度為97.25％（圖1），因此命名為PsWOX11。

2.2PsWOX11基因組織表達特異性分析

為探究PsWOX11基因在小葉楊不同組織中的表達情況，分別提取生長3周齡小葉楊組培苗的主根、側根、莖和幼葉的總RNA，采用qRT-PCR技術進行檢測。結果表明，PsWOX11基因在各個部位巾均有不同程度的表達，尤其在主根和側根中表達量較高，在葉片及莖段中也有一定的表達量，相對較低（圖2）。

2.3PsWOX11轉基因楊樹的獲得

為了進一步研究PsWOX11基因在楊樹側根生長發育中的作用，構建了植物過表達載體35S：：PsWOX11和顯性抑制表達載體35S：：PsWOX11-SRDX（圖3A、B），采用農桿菌侵染楊樹愈傷組織的遺傳轉化方法轉化84K楊，經過誘導、再生培養，再通過抗生素篩選和基因組DNA分子檢測鑒定陽性轉基因植株，共鑒定了過表達轉基因株系7個（OE1-OE7）和顯性抑制轉基因株系8個（SRDX1-SRDX8）（圖3C、D）。利用qRT-PCR檢測PsWOX11基因在各轉基因和非轉基因84K楊中的相對表達水平，結果顯示，與非轉基因84K楊相比，PsWOX11在各轉基因株系中的相對表達量水平均有不同程度的提高，表明PsWOX11基因已成功轉入84K楊中，并能夠過量表達。其中，PsWOX11基因在過表達轉基因株系OE1和OE3中的表達量分別是非轉基因84K楊的14.4和12.1倍，在顯性抑制轉基因株系SRDX2和SRDX6中的表達量分別是非轉基因84K楊的10.2和13.1倍（圖3E），選擇該4個轉基因株系用于后續的表型比較和功能分析。

2.4轉基因植株側根表型分析

選取大小一致（高度約3 cm，帶有2～3片幼葉）的非轉基因84K楊、過量表達（OE1和OE3）和顯性抑制PsWOX11基因（SRDX2和SRDX6）的轉基因楊樹頂端，將其分別扦插在1/2 MS固體培養基中，置于人工氣候室內培養3周后，觀察PsWOX11基因對側根生長發育的影響，包括側根長度以及直徑等。與非轉基因84K楊相比，過表達轉基因楊樹的每條主根上所有側根的總長度（LLR）明顯增加，均顯著高于非轉基因84K楊46.4％和41.2％，而顯性抑制轉基因楊樹相對較小，均顯著低于非轉基因84K楊48.1％和41.9％（圖4）。以上結果表明，PsWOX11基因促進了轉基因楊樹側根的生長，增加了側根長度。

為進一步揭示PsWOX11基因在楊樹側根生長發育中的作用，選擇培養3周的非轉基因84K楊、過量表達和顯性抑制PsWOX11基因的轉基因楊樹的側根，截取距離根尖頂端相同距離（1 cm）的側根進行橫切解剖分析，結果發現，三者側根的內部結構沒有明顯的差異，但是過表達PsWOX11轉基因楊樹的側根直徑明顯大于非轉基因84K楊，高達37.7％和30.4％，而顯性抑制PsWOX11轉基因楊樹相反，顯著低于非轉基因84K楊27.1％和25.1％，（圖5）。以上結果表明，PsWOX11基因影響了轉基因楊樹的側根直徑，促進了側根徑向生長。

3討論

根系是高等植物的重要營養器官，水分、養分的吸收利用以及干旱、鹽等非生物脅迫的耐受性等諸多生命活動在不同程度上都依賴根系的生長發育。側根是植物根系的重要組成部分，它們從主根或不定根上側向生長出來，對于形成龐大的植物支根系統具有重要意義。

側根的發生是一個復雜的生物學過程，受多種植物內源激素和環境因素所調控，并有多種轉錄因子參與整個過程中，其中不同wox轉錄因子家族成員在調控側根的生長發育過程中發揮著重要作用。例如，擬南芥AtWOX14基因在側根形成的早期特異性地表達，woxf4突變株系表現出初生根生長遲緩。AtWOX7以糖依賴的方式影響側根的發育，過表達AtWOX7基因能夠直接抑制AtCYCD6;1基因的表達，進而調節側根的發育，導致側根原基數量減少，恰恰相反，wox7突變體側根原基的數量顯著增加。在楊樹中，過表達和顯性抑制WOX11轉基因楊樹的側根數量明顯減少剛，但是過表達該基因后，轉基因植株的側根總長度明顯高于非轉基因84K楊。與以上wox基因家族成員相比，小葉楊PsWOX11基因與毛果楊、84K楊WOX11基因的核苷酸、蛋白質序列相似度極高，但部分氨基酸殘基的不同可能導致基因在影響側根發生和生長發育方面功能上的差異。小葉楊PsWOX11基因與84K楊PagWOX11基因在根和葉中表達高于莖中，尤其在主根和側根中組織特異性表達豐度相對較高，而毛白楊PtoWOX11基因僅限于根中表達，且在不定根根冠后的小區域有表達。當這些基因在轉基因84K楊中表達時都能促進不定根的發生和生長，表明這些WOX11基因在調控不定根發育過程中有保守的功能。本研究中小葉楊PsWOX11基因也直接影響著轉基因植株根系的生長發育，過表達PsWOX11轉基因楊樹中每條主根上側根的長度明顯高于非轉基因84K楊，而顯性抑制轉基因楊樹的表型恰恰相反，研究結果與PagWOX11基因基本一致刪，表明PsWOX11基因調控了側根的生長發育。

另外有研究發現，PtoWOX5a和PtoWUSa參與了毛白楊不定根和側根的發育，過表達兩基因均會導致轉基因植株不定根數量增加，長度減少，且不定根和側根根尖腫脹變大。水稻QHB/OsWOX5基因的qhb突變體植株無法形成S型側根，僵切除根尖后產生的L型側根數量增加，且在輕度干旱脅迫條件下，OsWOX10基因在qhb突變體的側根原基中表達量增加，進一步研究發現QHB通過負調控OsWOX10來抑制側根直徑的增加。在本研究中，過表達PsWOX11轉基因楊樹的側根直徑明顯大于非轉基因84K楊，而顯性抑制PsWOX11轉基因楊樹相反，表明PsWOX11基因影響了轉基因楊樹的側根直徑發育。然而，PsWOX11基因受哪些上游轉錄因子調控、PsWOX11蛋白與哪些蛋白相互作用，PsWOX11蛋白又調控哪些下游相關基因的表達，進而調控側根的生長發育，包括側根根尖細胞分裂和分化，細胞的大小以及管胞直徑與胞壁厚度等，其具體上、下游分子調控機制尚不清楚，有待進一步探究，這些研究結果也將有助于深入了解楊樹側根生長發育機理，為后續林術分子設計育種提供理論指導。

4結論

本研究從小葉楊中克隆了一個wox基因家族成員PsWOX11，與毛果楊和黑楊WOX11具有較高的氨基酸序列相似性，在楊樹主根和側根中表達量相對較高，能夠參與調控楊樹的側根的生長和發育，促使側根長度和直徑增加。以上研究結果表明，PsWOX11基因參與小葉楊根系生長發育，對木本植物根系生長具有重要的影響，但其分子作用調控機制有待進行深入解析。