3種楊樹HSFB1基因CDS遺傳多樣性和系統演化分析

摘要：[目的]基于HSFB1基因，從CDS水平探討銀白楊、響葉楊和中國山楊不同群體的遺傳多樣性、系統發育關系以及群體遺傳變異與適應異質環境之間的關系。[方法]提取HSFB1基因在各楊樹樣本中的CDS序列，并對各CDS序列分別進行遺傳多樣性、中性檢驗和單倍型分析。[結果]HSFB1基因在銀白楊群體中的單倍型多樣性和核苷酸多態性最低，在響葉楊和西南山楊群體中較低，在北方山楊和中部山楊群體中最高。各楊樹群體中該基因的中性檢驗結果均不顯著。CDS1系統發育樹顯示，外類群首先分枝為響葉楊和中國山楊，銀白楊則聚于末端。CDS2單倍型分析顯示，北方與中部山楊群體單倍型種類豐富，西南山揚、響葉楊和銀白楊群體單倍型種類相對較少。[結論]不同楊樹物種和群體在應對我國復雜多變的地理環境和氣候條件的過程中體現出不同的適應和演化特征。

關鍵詞：銀白楊；響葉楊；中國山楊；HSFB1；遺傳多樣性；單倍型網絡

中圖分類號：S792.11；Q941+.2 文獻標識碼：A 文章編號：1001-1498（2024）06-0112-09

楊屬（Populus）植物在北半球有廣泛的自然分布，在南半球熱帶地區（如非洲、南美洲）也有少量分布。楊屬物種及其雜交種因其生長迅速，壽命長，適應性強，便于營養繁殖，是林業和園林綠化中的重要樹種，同時也是木材生產、造紙和其他木制品生產行業的重要植物原材料，具有巨大的生態和經濟價值。中國楊樹資源十分豐富，幾乎遍及全國各地，人工林面積居世界之首。白楊組（Sect.Populus）楊樹在我國分布范圍最廣，從寒溫帶針葉林區到亞熱帶常綠闊葉林區，從溫帶草原和荒漠區到青藏高原高寒植被區均有生長，是研究楊樹適應性性狀演化的理想材料嘲。

銀白楊（Populus alba L.）、響葉楊（PopuIusadenopoda Maxim）和中國山楊（Populusdavidiana Dode）是我國白楊組楊樹的幾種代表性物種。銀白楊原產于新疆，于東北、華北、西北和西藏等地區皆有栽培，耐寒抗旱，但不耐濕熱；響葉楊主要集中分布于東南地區，喜光，喜溫暖濕潤，耐寒性較差；中國山楊分布廣泛，呈現出從東北到華中到西南的方向性分布，耐寒冷、耐干旱貧瘠土壤。不同的環境和氣候條件塑造了不同地區楊樹物種和群體在耐熱性方面的差異。

隨著全球氣候變暖，高溫脅迫通過抑制光合作用，影響蛋白質和膜的穩定性，誘導活性氧（ROS）的積累，改變植物激素的產生和信號轉導等不利作用，已成為影響植物代謝和生長發育的主要環境脅迫之一。在此情況下，植物也進化出了相應的高溫響應機制。植物熱激轉錄因子（HSFs）通過調控熱響應基因的表達，在植物熱應激反應中發揮著關鍵作用。根據序列相似性和寡聚化結構域的結構特征將植物的HSFs分為A、B、C三族，當前的研究主要集中于A族基因，對B族和C族基因的研究相對缺乏。HSFB1是B旅的一個重要基因，是植物在高溫脅迫下耐熱性增強的關鍵調節因子之一，有助于植物承受極端溫度的同時保持正常的細胞功能。

CDS序列（coding sequence）是指在基因組DNA中能夠編碼蛋白質的序列，對CDS序列的比較研究有助于揭示基因的功能、變異與演化。本研究利用白楊組3種楊樹（銀白楊、響葉楊和中國山楊）在中國不同地理分布區的樣本，對各群體HSFB1基因的CDS序列進行遺傳多樣性、單倍型網絡和系統發育等分析，探討銀白楊、響葉楊和中國山楊群體遺傳結構和進化關系，解析群體遺傳變異與環境異質性的關系，并為進一步研究楊樹的耐熱機制以及后續耐高溫楊樹種的培育提供重要的科學理論基礎。

1材料與方法

1.1樣本采集與DNA測序

對中國自然分布的3種白楊組楊樹進行了野外采樣，橫跨南北，涵蓋16個省、自治區、直轄市。采集了銀白楊4個種群的27個個體、響葉楊4個種群的28個個體和中國山楊27個種群的104個個體（其中包含北方山楊8個種群的30個個體，中部山楊9個種群的29個個體，以及西南山楊10個種群的45個個體），利用全球定位系統測量并記錄各樣本經緯度信息。采集嫩葉，經硅膠迅速干燥后于冰箱-80℃保存，用于提取3種楊樹的總DNA，檢測合格后委托北京貝瑞基因生物技術公司進行基因組重測序，并對原始數據進行質控和初步處理。

1.2測序數據處理與HSFB1基因cos序列提取

基于本研究組正在進行的2項研究，獲得了27個銀白楊個體、28個響葉楊個體和104個中國山楊個體的基因組重測序數據，使用BWA軟件（v0.7.17）分別與各自物種的參考基因組進行比對（銀白楊yiYChr.fa、響葉楊yiXChr，fa和歐洲山楊Potra02_genome.fasta），輸出的結果文件（.bam）使用samtools軟件（v0.1.19）和bdtools軟件（v1.14）進行處理，最終得到每個采樣個體的基因組全長序列文件（.fa）。

于NCBI數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nihgov/）獲取擬南芥HSFB1基因（AT4G36990）的蛋白質序列，利用BLASTp軟件（v2.14.1）分別與銀白楊、晌葉楊、歐洲山楊（Populus tramula L.）以及毛果楊（Populus trichocarpa Torr＆Gray ex Hook.）（后續分析用作外類群）的蛋白質序列進行比對。基于最佳比對結果，可獲得HSFBI基因在上述4種楊樹中對應的基因號。利用基因組注釋文件（銀白楊y.gene，gff3、響葉楊x.gene.gff3、歐洲山楊Potra02_genes，gff和毛果楊Ptrichocarpa_444_v3.1.gene.gff3）查找和獲取該基因在各楊樹基因組所在的位置和CDS區間，并使用gffread軟件（v0.12.7）從上一步獲得的銀白楊、響葉楊和中國山楊每個采樣個體的基因組序列文件以及毛果楊參考基因組序列文件中提取HSFB1基因的CDS序列，最后對4種楊樹所有個體的同一CDS序列進行合并，用于后續的分析。

1.3遺傳多樣性、中性檢驗和單倍型分析

單倍型多樣性（H）和核苷酸多樣性（π）是衡量物種遺傳多樣性的2個重要指標，其值越大，表明群體的遺傳多樣性越豐富。借助DnaSP軟件（v6.12.03），基于HSFB1基因的每個CDS序列合并文件，對銀白楊、響葉楊和中國山楊各群體中該基因的CDS多態性進行分析：計算單倍型數量（Nh）、單倍型多樣性（Hd）、核苷酸多態性（π）、多態性位點數量（S）、Watterson's多態性估值（Bw）、最小重組事件（Rm）。還計算了Tajima's D值、Fu and Li's P and D'值以進行中性檢驗，從CDS水平探測銀白楊、響葉楊和中國山楊的群體歷史動態及其在適應環境和分化過程中的自然選擇信號。

以毛果楊為外類群，利用MEGA11軟件的鄰域連接（NJ）法，對HSFB1基因的每個CDS分別進行單倍型系統發育樹構建，以分析不同楊樹群體之間的聚類情況和進化關系。使用Network 10.2軟件的中間連接（MJ）法構建單倍型網絡圖，并根據銀白楊、響葉楊和中國山楊群體的采樣信息和各采樣點單倍型種類及數量，繪制單倍型地理分布比例圖。

2結果

2.1HSFB1基因CDS水平的遺傳多樣性和群體結構

4種楊樹與擬南芥蛋白質序列比對的最佳結果顯示，HSFB1基因在銀白楊、響葉楊、歐洲山楊和毛果楊中對應的基因號分別為evm.model.Chr07.389、evm.modeI.Chr07.416、Potra2n7e 16268.1和Potri.007G043800.1.p。4種楊樹的基因組注釋文件（gff3）皆顯示HSFB7基因位于第7號染色體，含有2個CDS區。對該基因2個CDS序列在銀白楊、響葉楊和3個中國山楊群體中的遺傳變異分析的結果如表1。

核苷酸多態性（π）顯示，在物種間，銀白楊中HSFB7基因2個CDS序列π的均值（π=0.001 2）略低于響葉楊（π=0.0016），明顯低于中國山楊（π=0.004 2）。而在中國山楊物種內部，西南山楊（π=0.002 5）lt;中部山楊（π=0.0071）lt;北方山楊（π=0.007 4）；考慮多態性位點數量的Watterson's多態性（θw）也表現出類似的趨勢，但銀白楊（θw=0.001 7）高于響葉楊（θw=0.000 9）。總的來看，在物種水平上，銀白楊和響葉楊群體HSFB1基因的CDS具有相對較低的遺傳多樣性，中國山楊遺傳多樣性更高。在種內群體水平上，西南山楊群體遺傳多樣性水平低，北方地區和中部地區的中國山楊群體遺傳多樣性水平較高。

中性檢驗結果顯示（表1），從物種水平進行比較分析發現，銀白楊HSFB1基因CDS序列的Fu and Li's D*and P為正，Tajfma's D為負；響葉楊的Tajima'sD和Fu and Li'sP為正，D*為負；中國山楊整體的Tajima's D和Fu and Li'sD'and P檢驗結果表現一致均為負值。據此本研究推測，響葉楊和銀白楊有經歷瓶頸效應的可能性，而中國山楊更可能經歷了擴張。在中國山楊種內進行比較分析發現，北方山楊群體的Tajima's D和Fu and Li's F*檢驗值為負，但Fu and Li's D*檢驗值為正；中部山楊群體的Tajima's D和Fu and Li'sD'and P檢驗結果均為負；西南山楊群體的Fuand Li's D*andF+為正，Tajima's D為負。這說明中部山楊和北方山楊群體可能處于擴張階段，西南山楊群體有經歷瓶頸效應的可能性。若中性檢驗Tajima's D值與Fu and Li's D'and P值均顯著背離0，則說明序列中的核苷酸位點變化偏離中性模型，但檢驗結果均不顯著。此外，重組分析表明，山楊群體最小重組事件大小（Rm）為1～3，而銀白楊和響葉楊群體中未有重組事件發生，表明這2種楊樹群體重組水平很低。

2.2HSFB1基因CDS序列的單倍型分析

單倍型檢測結果表明（表1），在3種楊樹共5個群體中，HSFB1基因CDS1單倍型多樣性最豐富的是北方山楊（Hd=0.775），單倍型多樣性最低的是響葉楊（ Hd=0.507）。CDS2單倍型最豐富的仍為北方山楊（Hd=0.865），單倍型最為單一的為銀白楊（Hd=0），只有1種單倍型。

以毛果楊為外類群，借助MEGA11構建的系統發育樹顯示，HSFB1基因的2個CDS序列具有不同的樹狀拓撲結構。變異位點較多的CDS1系統發育樹（圖1A）顯示出清晰的群體結構：與外類群距離均等分為兩大枝，一枝為響葉楊個體，另一枝為其他2種楊樹的所有個體，而該支又進一步分為中國山楊所有個體一枝（北方、中部和西南個體均隨機分布），銀白楊個體一枝聚于末端。這說明銀白楊、響葉楊和中國山楊3種楊樹的HSFB1基因CDS1序列之間存在明顯的分化，但中國山楊內部無明顯分化。CDS2序列由于變異位點較少（5個群體變異位點數平均值小于5），系統發育樹皆聚為一枝（圖1B），無明顯分布規律，說明這3種楊樹分化不明顯，仍共享基因庫。

為進一步探究HSFB1基因CDS2序列在銀白楊、響葉楊、中國山楊群體中的變異和演化的模式，結合采樣信息本課題組繪制了單倍型地理分布比例圖，并構建了單倍型網絡圖（圖2）。除外類群毛果楊的單倍型H1外，CDS2共鑒定出17種單倍型。其中，銀白楊群體為單一單倍型H10；響葉楊群體中存在2個不同的單倍型H10和H18，H10占比更大（57.14％）；北方山楊群體中檢測到11種不同單倍型H3-H8，H10，H13-H16，其中H5（21.67％）、H10 （16.67％）和H4 （16.67％）為主要的單倍型；中部山楊群體中檢測到12種單倍型H2-H6，H8-H13，H17，其中H10（ 44.83％）和H8（15.52％）為主要單倍型；西南山楊群體種中存在4種單倍型H2，H6，H8和H10，其中H2占比最大（90.00％）。總的來看，最常見的2種單倍型（頻率gt;25％）為：H10（ 38.75％）和H2（26.86％）。H10為唯一一個在銀白楊、響葉楊、中國山楊所有群體中均有分布的單倍型，H6，H8，H10為中國山楊內部共享的3種單倍型。H18為響葉楊特有單倍型，H7、H14、H15和H16為北方山楊特有的4種單倍型，H9、H11、H12和H17為中部山楊特有的4種單倍型，銀白楊和西南山楊無特有單倍型。

最后，Network構建的單倍型網絡圖顯示（圖2），外類群H1首先與H10相連，以H10為中心又分別衍生出其他單倍型，可分為3個譜系，說明H10最為古老。3種中部山楊特有單倍型（H11、H12、H17）都先與北方山楊特有單倍型H14相連后再與單倍型H10相連，而西南山楊中占比極大的H2單倍型依次通過中部山楊特有單倍型H12、北方山楊特有單倍型H14與單倍型H10相連。據此，本研究推測H10為祖先單倍型。以上結果為中國山楊起源于北方地區，逐漸向南方擴散和遷移的推論提供了又一個有力的證據。

3討論

遺傳多樣性是生物經歷長期演化過程的產物，反映了物種或群體適應外部環境因素變化的能力。熱激轉錄因子HSFB1是植物應對高溫脅迫的重要的調節因子之一。研究表明，其作為轉錄共激活，抑制子負向調控熱誘導基因的表達，從而正向調控耐熱性獲得，在提高植物耐熱性方面起著重要作用。利用我國白楊組3種代表性楊樹的5個天然群體共159個采樣個體，對HSFB1基因的2個CDS序列進行了遺傳多樣性分析。結果顯示，銀白楊的單倍型多樣性（Hd）和核苷酸多態性（π）最低，響葉楊和西南山楊較低，北方山楊和中部山楊最高（表1），與前人的研究結果一致，也符合廣域種一般比窄域種遺傳多樣性更高這一理論，以及山楊分布的高海拔山區受農業生產等人類活動擾動少的現實情況。不同楊樹群體間遺傳多樣性表現出明顯差異，這可能是受到不同地區的環境條件和氣候特征，如溫度、濕度、海拔、光照等因素的影響，群體經歷自然選擇發生局部適應的結果。Tajima's D和Fu and Li's D'andP中性檢驗結果顯示，中部山楊和北方山楊群體可能處于擴張階段，而響葉楊、銀白楊和西南山楊群體有經歷瓶頸效應的可能性。群體擴張有助于遺傳多樣性的提高，而瓶頸效應則會降低遺傳多樣性，這與上文北方和中部山楊群體遺傳多樣性高，響葉楊、銀白楊和西南山楊群體遺傳多樣性低的結果相對應。但中性檢驗均不顯著，這與Hou Z等人的對中國山楊和銀白楊的研究結果一致。

HSFB1基因的CDS1系統發育樹顯示，銀白楊、響葉楊和中國山楊物種間存在顯著分化，銀白楊和中國山楊親緣關系更近；而CDS2單倍型分析表明，3種楊樹中單倍型H10頻率最高且分布最廣泛，單倍型網絡圖顯示其與外類群相連且位于網絡中心，為最古老的祖先單倍型。銀白楊群體中僅一種單倍型H10，這可能與群體內變異程度和環境壓力有極大關系。干旱化和沙漠化等惡劣環境因素可能導致了銀白楊群體的遺傳漂變和瓶頸效應，導致遺傳多樣性減少，單一單倍型的形成可能是銀白楊群體長期適應沙漠環境的結果。此外，繁殖方式也會極大影響遺傳多樣性。對印度喜瑪偕爾邦肯瑙爾地區的銀白楊群體結構和遺傳多樣性的研究發現，該地區銀白楊群體的遺傳多樣性很低，這與本研究的結果類似。在該研究期間，未觀察到任何開花現象只存營養繁殖，且觀察雜合度（Ho）小于預期雜合度（He）說明群體中存在近交現象。無性繁殖是楊樹物種的一個共同特征，銀白楊的根蘗繁殖在某些地區也較為普遍。由于銀白楊種子萌發期和幼苗期需要較多的降水，本研究推測新疆地區的天然銀白楊群體更偏向無性繁殖，這是新疆地區銀白楊遺傳多樣性低和單倍型單一的另一個可能原因；響葉楊群體只有2種單倍型H10和H18，且H18為特有單倍型。在當前的全球氣候模型中，植物對熱脅迫的代謝適應能力仍然較弱，高溫環境對楊樹生長發育的限制較大，如夏季高溫可顯著影響青楊（Populus cathayana Rehder）的生長和光合作用，毛白楊（Populus tomentosa Carr.）的可變剪切過程受高溫影響嚴重。然而響葉楊在東南地區夏季炎熱多雨的情況下生長良好，故推測新變異H18在響葉楊對亞熱帶季風氣候的適應上，特別是在高溫脅迫下耐熱性的提升方面，具有極及其關鍵的作用；而中國山楊群體則擁有最多的單倍型種類，其中北方山楊和中部山楊明顯豐富于西南山楊。在北方，除了中國東北的長白山以及朝鮮半島2個公認的溫帶針闊混交林冰期避難所，Wang J等人對香楊（Populus koreana Rehder）的最新研究又發現大興安嶺北部避難所的存在。避難所群體往往擁有更高的遺傳多樣性，多個避難所之間的基因流又使得遺傳多樣性分布格局更加復雜。本研究顯示，北方山楊的遺傳多樣性和單倍型多樣性最高，這與ZHAO D等人的研究結果一致，其原因很可能是北方山楊是避難所群體，且中國山楊的遷移路線是從北向南；H2單倍型在兩南山楊中占比極大（90％），在中部山楊中占比較小，而在北方山楊樣本中未發現存在，這說明H2是高原環境的優勢單倍型。高海拔對楊樹群體結構有重要影響，Li J等人對圓葉楊（Populus rotundifolia Griff.）和XiangX等人對青葉楊（Populus cathayana Rehder）的研究證明，高海拔環境可以通過選擇壓力加速物種和群體分化。推測，云貴高原和青藏高原的特殊環境同樣促進了西南山楊群體的適應性進化，塑造了其獨特的單倍型特征。

4結論

本研究基于HSFB1基因CDS序列構建的系統發育樹與單倍型網絡圖顯示，銀白楊、響葉楊和中國山楊在物種水平上分化顯著，中國山楊具有更高的遺傳多樣性，說明其具有較廣泛的適生范圍。不同楊樹不同群體的單倍型數量、優勢單倍型和特有單倍型不盡相同，說明各楊樹群體為適應我國復雜多變的地理環境和氣候條件而經歷了不同的演化過程，特別是響葉楊的特異性變異可能是其獲得對高溫高濕良好耐受性的關鍵原因。目前我國黑楊派楊樹栽培品種，北方品種移植至南方栽培，會逐漸表現出不適應，甚至死亡的情況。在全球變暖的大背景下，未來研究還需要擴寬到更多的楊屬類群，對楊樹的耐熱機制進行進一步探究，并對植物耐熱性基因展開更多挖掘和分析，為楊屬物種遺傳多樣性保護和利用提供理論支持。