甘薯WRKY基因家族鑒定及其響應莖腐病侵染的表達分析

摘要：WRKY基因家族是植物中重要的轉錄因子家族，在植物響應生物和非生物脅迫過程中起到非常重要的調控作用。通過生物信息學方法在甘薯基因組（pasi3）鑒定了84個WRKY家族基因，分布于15條染色體，編碼氨基酸數量為120～838個，等電點為4.89～10.74。系統發育樹將其分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ簇，其中Ⅱ簇又分為5個亞群（Ⅱ-a、Ⅱ-b、Ⅱ-c、Ⅱ-d、Ⅱ-e）。保守結構域顯示，IbWRKY基因具有高度保守的WRKYGQK基序，其中有11個基因的保守基序發生了變異。IbWRKY基因的啟動子中存在多個與生長發育、激素響應和應激反應相關的順式作用元件。共線性分析結果表明，甘薯與擬南芥、番茄和馬鈴薯等雙子葉植物的WRKY基因具有相似的進化歷程。IbWRKY基因在甘薯中具有顯著的組織特異性，且在生物、非生物脅迫和激素處理下表達差異顯著。73個IbWRKY基因參與了莖腐病脅迫響應，其中IbWRKY20/40/6/84等4個基因與莖腐病抗性密切相關。本研究鑒定了84個甘薯WRKY基因，并明確了其家族特征、進化和表達模式。同時，挖掘到了4個與莖腐病抗性密切相關的WRKY基因。

關鍵詞：甘薯；WRKY；莖腐病；生物信息學；表達模式

中圖分類號：S531.03；S435.311 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）21-0025-15

收稿日期：2023-10-13

基金項目：國家甘薯產業技術體系建設專項（編號：CARS-10）；廣東省科技計劃（編號：2023B0202010019）。

作者簡介：丁夏威（1998—），女，河南周口人，碩士，從事甘薯抗病遺傳育種。E-mail：dingxiawei0224@163.com。

通信作者：黃立飛，博士，研究員，從事甘薯抗病遺傳育種研究，E-mail：hlf157@163.com；鄒宏達，博士，副研究員，從事甘薯遺傳育種，E-mail：zouhongda@gdaas.cn。

甘薯［Ipomoea batatas（L.） Lam］屬旋花科（Convolvulaceae）甘薯屬 （Ipomoea），是典型的短日照作物，具有高產、適應性廣、抗逆性強、利用價值高等特點，是我國重要的糧食、飼料、工業原料和生物質能源作物，是世界七大糧食作物之一^［1］。在甘薯栽培中，經常受到不同類型的生物與非生物脅迫，導致甘薯產量和品質下降，其中由達旦提狄克氏菌（Dickeya dadantii）引起的甘薯莖腐病，是一種毀滅性的細菌性病害，為我國甘薯主產區發病面積較大、危害較嚴重的病害之一，發病嚴重時可使甘薯產量降低50%～100%^［2］。WRKY轉錄因子（WRKY transcription factors，TFs）是植物中重要的轉錄因子家族，是調控植物多種信號轉導網絡的重要組成部分^［3］，在植物響應生物和非生物脅迫過程中起到非常重要的調控作用。目前，關于WRKY轉錄因子在甘薯莖腐病信息傳導途徑中的作用知之甚少，因此，本研究依據最新公布的甘薯全基因組信息，對甘薯WRKY轉錄因子家族成員進行鑒定及分析，探究其在莖腐病脅迫下的表達模式，挖掘與抗莖腐病密切相關的WRKY基因，為解析WRKY基因在甘薯莖腐病脅迫響應信息傳導中的功能提供參考。

WRKY轉錄因子具有1～2個長度為60個氨基酸殘基的保守結構域，包括一個N端DNA結合基序WRKYGQK（分別指色氨酸、精氨酸、賴氨酸、酪氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸）和1個C端鋅指結構。根據結構特點，WRKY轉錄因子分為3個進化群：Ⅰ群包含2個WRKY結構域，鋅指結構為C2H2（C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H，X 為任意的氨基酸）；Ⅱ群只有1個WRKY結構域，鋅指結構為C2H2，Ⅱ群分為5個亞群（IIa-e）；Ⅲ群含有1個WRKY結構域，鋅指結構為C2HC（C-X7-C-X23-H-X1-C）^［4］。首個WRKY轉錄因子是從甘薯中克隆的，Ishiguro等將其命名為SWEET POTATO FACTOR 1（SPF1）^［5］。此后，WRKY轉錄因子在植物全基因組水平上得到了廣泛的鑒定，如擬南芥有72個^［6］，黃瓜有61個^［7］，番木瓜有41個^［8］，小麥有124個^［9］，玉米有125個^［10］，番茄有81個^［11］，大豆有182個^［12］，棉花有116個^［13］。研究表明，WRKY轉錄因子參與了植物的發育過程，包括衰老、次生代謝產物的生物合成、種子發育萌發等^［14-18］；也參與了調控植物多種防御脅迫反應、激素信號轉導以及病原體觸發的免疫反應^［19-20］。例如OsWRKY6直接激活OsICS1，調控水稻對白葉枯病的防御反應^［21］；過表達轉錄因子TaWRKY2增強了小麥的抗旱性并提高了產量^［22］；AtWRKY71在水楊酸（salicylic acid，SA）調節的抗病信號轉導途徑中起負調控作用^［23］；AtWRKY22對暗處理下擬南芥葉片衰老過程中起正調控作用，加速葉片的衰老^［24］；PtWRKY23基因負調控胡楊對鐵銹病菌感染的抵抗力^［25］；AtWRKY3正調控擬南芥對蕓苔鏈格孢（Alternaria brassicicola）引起的黑斑病和灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的灰霉病的防御作用^［26-27］；PlWRKY65對JA和SA信號發揮調節作用，從而增強白芍對極細鏈格孢菌（Alternaria tenuissima）的抗性^［28］。

甘薯WRKY基因家族的鑒定雖有報道，但選用的甘薯參考基因組（ipoBat4）為初始版本^［29］，另外，關于甘薯WRKY基因家族在莖腐病脅迫下的表達及信號傳導中的功能未見報道。本研究利用最新發布的甘薯基因組pasi3版本，對甘薯WRKY家族成員進行全基因組鑒定和生物信息學分析，探究在莖腐病脅迫下WRKY基因家族在抗莖腐病甘薯品種中的表達模式，挖掘與抗莖腐病密切相關的WRKY基因，以期為研究WRKY基因家族在甘薯抗莖腐病的功能、分子調控網絡及對莖腐病抗性機制奠定基礎，為甘薯抗性育種提供重要理論依據。

1 材料與方法

1.1 植物材料與培養方法

試驗于2023年2—6月在廣東省農業科學院白云試驗基地進行。甘薯品種為廣薯87（GS87）和心香（XX），均種植于廣東省農業科學院白云試驗基地，按照大田條件正常管理。菌株Ech36由黃立飛研究員提供，提取RNA試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司。

剪取25 cm長的甘薯健康薯苗置于無菌水中培養3～4 d。使用滅菌剪刀去除0.5 cm的莖末端制造新鮮傷口，使用D_{620 nm}=0.15的菌液接種后，分別培養0、18、30 h，分別記作T0、T18、T30。取樣為莖末端的1 cm莖段，每個處理重復3次，液氮速凍后于-80" ℃保存，備用。

1.2 甘薯WRKY基因家族的生物信息學分析

1.2.1 甘薯WRKY基因家族的鑒定、染色體定位與特征分析

在甘薯基因組數據庫Ipomoea Genome Hub（http：//sweetpotato.com/download_genome.html）中下載甘薯pasi3版本基因組文件和gff3注釋文件，通過TBtools軟件提取所有甘薯基因的CDS序列并翻譯成蛋白序列^［30］。從Pfam數據庫（http：//pfam.xfam.org）下載WRKY保守蛋白結構域（PF03106）的隱馬爾科夫（hidden markov model，HMM）模型，通過HMM模型搜索篩選甘薯基因組中的候選WRKY基因，去除不同轉錄本后，利用NBCI-CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml）、Pfam和SMART在線網站（http：//smart.embl.de/smart/batch.pl）對候選WRKY基因進行保守結構域驗證，確定甘薯WRKY基因家族成員。結合甘薯基因組注釋信息，通過TBtools繪制已染色體定位的WRKY家族成員的染色體分布圖。利用ExPASy在線網站（https：//web.expasy.org/compute_pi/）分析甘薯WRKY基因家族蛋白分子量、理論等電點、不穩定系數、脂肪系數和平均疏水指數；利用Cell-PLoc 2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）預測甘薯WRKY基因的亞細胞定位^［31］。

1.2.2 甘薯WRKY基因系統發育分析、進化樹構建與保守結構域序列分析

擬南芥WRKY蛋白序列下載于TAIR（https：//www.arabidopsis.org/）^［32］，利用MEGA 11.0軟件對擬南芥和甘薯的WRKY家族基因進行多重序列比對，通過鄰接法（NJ，neighbor-joining）法構建進化樹，Bootstrap值設置為1 000次，通過Evolview（http：//www.evolgenius.info/evolview）對進化樹進行優化。應用ClustalW軟件對甘薯WRKY蛋白進行多序列比對，使用ESPript 3（https：//espript.ibcp.fr/ESPript）軟件完成甘薯WRKY蛋白保守結構域序列分析。

1.2.3 甘薯WRKY基因保守基序分析和基因結構可視化分析

利用MEME在線工具（http：//meme-suite.org）鑒定分析甘薯WRKY蛋白序列的保守基序，保守基序個數設置為10個，其余參數為默認值。甘薯WRKY家族基因的基因結構信息提取于甘薯pasi3基因組gff3注釋文件，并通過TBtools實現甘薯WRKY家族基因聚類、蛋白保守基序及基因結構的可視化。

1.2.4 甘薯WRKY基因啟動子順式作用元件分析

利用Perl語言腳本獲取甘薯WRKY家族基因起始密碼子上游2 000 bp的核酸序列，通過PlantCARE網站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預測甘薯WRKY基因啟動子順式作用元件，使用TBtools對其進行可視化分析。

1.2.5 甘薯WRKY基因共線性分析

利用MCScanX軟件分析甘薯與馬鈴薯、番茄、擬南芥、水稻等物種WRKY基因家族中的片段重復基因和串聯重復基因^［33］，使用TBtools可視化各物種WRKY基因家族的共線性關系。

1.2.6 甘薯WRKY基因在不同組織、不同脅迫和激素處理下莖的表達分析

從NCBI網站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載甘薯品種徐薯18的莖、葉、薯梗、薯塊、薯塊近端、薯塊遠端、初始膨大的貯藏根、纖維根等7種不同組織的轉錄組數據，以及3種非生物脅迫（冷、鹽和干旱）和3種激素（ABA、SA和MeJa）處理下莖的轉錄組數據（登錄號：PRJNA511028）。利用Trimmomatic軟件去除接頭和低質量的序列^［34］，然后用hisat2比對到甘薯pasi3版本基因組^［35］，接著采用featureCounts計算甘薯WRKY基因的FPKM值^［36］，并通過R語言腳本轉換為TPM值，最后利用TBtools進行表達熱圖分析。

1.3 甘薯WRKY基因家族在莖腐病菌脅迫下的轉錄組分析

1.3.1 甘薯WRKY基因在莖腐病菌侵染下的表達模式分析

基于前期課題組獲得的抗甘薯莖腐病品種廣薯87（GS87）和感病品種心香（XX）接種莖腐病菌后不同時間（0、18、30 h）的轉錄組數據（未公開），分析甘薯WRKY基因家族在甘薯應答莖腐病菌侵染過程中的表達模式。轉錄組分析同“1.2.6”節，根據log₂（FoldChange）值≥1和FDR值lt;0.05篩選差異表達的IbWRKY基因，使用TBtools繪制表達熱圖。

1.3.2 甘薯WRKY基因的qRT-PCR 驗證分析

使用植物RNA提取試劑盒（美國Omega Bio-Tek公司）提取樣本的總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳評估RNA的完整性，超微量分光光度計檢測總RNA的濃度。使用HiScript ⅡQ RT SuperMix for qPCR Sample 試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）反轉錄獲得cDNA，稀釋10倍后于-20 ℃保存備用。以甘薯WRKY基因的CDS序列為模板，利用Primer Premier 5.0軟件設計特異性引物，內參基因使用甘薯Actin（表1）。使用Bio-Rad CFX96（美國伯樂公司）熒光定量PCR儀進行實時熒光定量試驗。試劑選用SYBR（瑞士羅氏公司），按照其說明書進行操作，反應體系為10 μL，反應程序為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環。每樣品設3個生物學重復，利用2^-ΔΔC_T方法計算基因相對表達量。

1.4 數據處理與分析

采用Excel 2007進行qRT-PCR數據整理，利用GraphPad Prism 9進行數據分析及作圖。

2 結果與分析

2.1 甘薯WRKY家族基因的鑒定、染色體定位與特征分析

共檢測到84個含有完整WRKY結構域的甘薯WRKY基因，不均勻地分布在甘薯的15條單倍型染色體上，根據基因組注釋信息，依次命名為IbWRKY1～IbWRKY84（圖1）。IbWRKY主要分布在1號染色體和9號染色體，分別為10個和9個基因，占比分別為11.90%、10.71%。2、5、7號染色體各分布6個，13、14號染色體各分布7個，11、15號染色體各分布8個，4號染色體分布4個，3和8號染色體各分布3個，6、10、12號染色體各分布2個。IbWRKY編碼蛋白的大小和氨基酸數量有較大差異。IbWRKY基因家族蛋白序列的氨基酸數量為120～838個，分子量為13.19～90.73 ku，等電點為4.89～10.74，其中IbWRKY84編碼的蛋白最短，只有120個氨基酸，IbWRKY36編碼的蛋白最長，有838個氨基酸。亞細胞定位預測顯示，有73個IbWRKY位于細胞核內，11個IbWRKY位于細胞質（表2）。

2.2 IbWRKY基因家族系統發育與多序列比對分析

利用72個擬南芥WRKY基因家族蛋白序列作為參考，構建IbWRKY基因家族的系統發育進化樹。如圖2所示，IbWRKY基因家族與AtWRKY基因家族分類基本一致，可分為Ⅰ群、Ⅱ群和Ⅲ群，Ⅱ群又進一步分為Ⅱ-a、Ⅱ-b、Ⅱ-c、Ⅱ-d、Ⅱ-e 5個亞群，Ⅰ群有13個成員（占比15.5%），Ⅱ群成員最多，有58個成員（占比69.0%），Ⅲ群有10個成員（占比11.9%）。值得注意的是，IbWRKY3/22/27等3個基因不屬于已知的3個進化群，其中IbWRKY3和IbWRKY22成一簇，IbWRKY27則獨立分支。利用ClustalW軟件分析IbWRKY蛋白結構域特征，結果表明IbWRKY基因家族的核心序列中含有保守的WRKYGQK七肽基序，但是存在不同類型氨基酸的替代與缺失，其中IbWRKY3保守基序中的谷氨酰胺（Q）變成蘇氨酸（T），IbWRKY7/8/9/10/22/76/80/81保守基序的谷氨酰胺（Q）變成賴氨酸（K）；此外，12個IbWRKY蛋白序列的鋅指結構發生了缺失（圖2、圖3）。

2.3 IbWRKY基因結構和保守基序分析

利用MEME軟件結合TBtools進行WRKY家族基因聚類、蛋白保守基序及基因結構的可視化分析（圖4）。IbWRKY家族成員的Motif數量為2～7不等。84個IbWRKY基因結構域都具有Motif1，表明Motif1是IbWRKY基因家族的最保守的核心基序。Motif10是最長的基序，包含46個氨基酸，而Motif9是最短的基序，僅有6個氨基酸（表3）。同群或親緣較近的IbWRKY家族成員具有相似的保守結構，如Ⅱ群中的Ⅱ-e和Ⅱ-d亞群都具有Motif1、Motif9和Motif2。IbWRKY3/22/84僅包含1個外顯子，其他IbWRKY基因的外顯子數分布在2～12個。同一亞家族基因編碼的蛋白在結構和組成上高度相似，Ⅰ群的外顯子數量為5～12個，Ⅲ群中外顯子數量均為3個，Ⅱ-b亞群外顯子數量為4～6個。

2.4 IbWRKY基因啟動子順式作用元件分析

除去轉錄起始位點的核心啟動子區域的 TATA-box、CAAT-box外，IbWRKY順式作用元件可分為3類：激素響應元件、脅迫響應元件和生長發育調節元件（圖5）。激素響應元件包括生長素IAA（TGA-element，TGA-box，AuxRR-core，AuxRE）、脫落酸ABA（ABRE）、赤霉素GA（TATC-box，GARE-motif，P-box）、茉莉酸甲酯MeJa（CGTCA-motif，TGACG-motif）和水楊酸SA（TCA-element）。脅迫響應元件包括干旱誘導（MBS）、傷口反應（WUN-motif）、厭氧誘導（ARE、GC-motif）、防御與應激響應（TC-rich repeats）和低溫響應（LTR）。生長發育調節元件包括種子特異性調控（RY-element）、玉米醇溶蛋白代謝調控（02-site）、分生組織表達（CAT-box）和胚乳表達（GCN4_motif）。有些IbWRKY基因包含多個順式作用元件，例如：IbWRKY39/56有多個干旱和低溫響應元件（MBS，LTR），IbWRKY16/35/67有多個MeJa（CGTCA-motif，TGACG-motif）和SA（TCA-element）激素響應元件，可與多種逆境相關的反式作用因子結合調控甘薯抗逆基因的表達。

2.5 IbWRKY基因共線性分析

共線性分析共檢測到8組，涉及了15個WRKY基因的片段復制事件，分別為IbWRKY6/36、IbWRKY11/18、IbWRKY29/32、IbWRKY41/75、IbWRKY42/74、IbWRKY50/53、IbWRKY50/77、IbWRKY53/77（圖6-A），可見IbWRKY基因的進化主要由片段復制事件驅動。如圖6-B所示，甘薯12個WRKY基因與擬南芥15個WRKY基因存在11種共線性關系，甘薯34個和31個WRKY基因分別與馬鈴薯、番茄存在39種和34種共線性關系，而與單子葉植物水稻之間沒有發現同源基因對，且共線性較差。除此之外，IbWRKY4/16/20/40/51/55和其他3種雙子葉植物都存在著共線性（圖6-C）。

2.6 IbWRKY基因在不同甘薯組織，以及冷、熱、鹽與激素脅迫下的表達分析

84個IbWRKY中有20個基因在7種組織中表達量極低或不表達，其他64個IbWRKY基因至少在一種組織中表達（圖7）。IbWRKY16/50基因在莖組織中特異性表達，且表達量高于其他組織，IbWRKY5/18/40/5/62在根和莖組織中均高表達，這些基因可能是根和莖組織生長發育所必需的。12個IbWRKY基因在6種脅迫下表達量極低或不表達，其他72個IbWRKY基因在至少1種脅迫中表達。干旱和鹽脅迫下，WRKY基因的差異表達不顯著，但在冷脅迫下有6個差異表達基因，其中IbWRKY6/18/30/42上調，IbWRKY45/61下調（表4）。除此之外，ABA處理的莖有9個IbWRKY差異表達基因（7個上調，2個下調），SA處理的莖有8個IbWRKY差異表達基因（7個下調，1個上調），而MeJa處理的莖有14個差異表達基因（11個下調，3個上調），可見WRKY基因在甘薯莖的冷脅迫下發揮著重要作用。

2.7 甘薯WRKY基因家族在莖腐病菌侵染下的表達模式分析

去除表達量介于0～1之間的基因，繪制了73個IbWRKY基因表達熱圖（圖8）。莖腐病菌脅迫下的WRKY基因表達呈現以下特征：IbWRKY16/18/21/27/30/40/42/53/62基因初期表達量高，但隨著侵染時間的延長表達量逐漸降低，并且在抗病品種中表達量高于感病品種；IbWRKY59/63基因隨著侵染時間的延長表達量都逐漸增加，并且在抗病品種中的表達量高于感病品種；IbWRKY48/58/77在接種早期高表達，而在18 h和30 h則不表達；部分WRKY基因接種前后表達無變化。

以接種0 h為對照組（T0-GS87、T0-XX），分析抗病品種廣薯87和感病品種心香在18 h、30 h處理下的IbWRKY差異表達基因。如圖9-A所示，接種18 h后，廣薯87差異表達IbWRKY基因有46個（19個上調，27個下調），心香差異表達IbWRKY基因有40個（19個上調， 21個下調）。接種30 h后，廣薯87差異表達IbWRKY基因有45個（17個上調，28個下調），心香差異表達IbWRKY基因有40個（18個上調，22個下調）。因此受莖腐病菌侵染， 抗性品種廣薯87在轉錄水平調動更多的差異表達IbWRKY基因響應侵染。對甘薯2個品種接種莖腐病菌后的差異表達IbWRKY基因進行Venn圖分析（圖9-B），接種18 h后抗性品種廣薯87中的IbWRKY基因數目為46個，其中6個為廣薯87特異表達基因；感病品種心香有40個IbWRKY基因，其中5個是心香特異表達基因。在接種后30 h后，廣薯87的IbWRKY基因減少1個，而心香未發生改變，其中10個為廣薯87特異表達基因，4個為心香特異表達基因，共有基因25個。由此可見，同一品種特異差異表達基因和2個品種間共同的差異表達基因可能是導致2個品種對莖腐病菌侵染后抗性差異的原因。

為了進一步分析抗感品種之間的差異表達基因，以感病品種心香0、18、30 h 3種處理作為對照，與抗病品種廣薯87對應的處理進行比較，獲得3個比較組（T0-XX _vs _T0-GS87，T18-XX_ vs _T18-GS87，T30-XX_ vs _T30-GS87）的差異表達基因韋恩圖（圖9-C），差異表達基因隨著接種時間的延長而增加，接種30 h的特異表達基因高于0 h和18 h，其中有6個（IbWRKY6/9/16/20/40/84）基因在3個時間點共有。上調基因數量隨著接種時間延長先降低再增加，而下調基因則一直增加，共同差異表達上調基因IbWRKY20/40，差異表達上調基因為IbWRKY6/84（圖9-D、圖9-E）。受莖腐病菌侵染，2個品種之間的IbWRKY基因在不同的時間點表達明顯不同。

2.8 甘薯WRKY基因的qRT-PCR 驗證分析

共同差異表達上調基因IbWRKY20/40在抗病品種上調表達，在感病品種下調表達；共同差異表達下調基因IbWRKY6/84在抗病品種下調表達，感病品種上調表達。對4個IbWRKY基因進行qRT-PCR 驗證分析見圖10，IbWRKY20/40在抗病品種上調表達，表達量高于感病品種；而IbWRKY6/84在抗病品種下調表達，感病品種上調表達，4個基因的表達特征與轉錄組結果相一致。因此，IbWRKY20/40/6/84基因在甘薯響應莖腐病菌的侵染過程發揮重要作用。

3 討論與結論

轉錄因子通過自我調節和調控下游靶基因表達，在植物生長和對非生物脅迫的響應中起著至關重要的作用^［37-38］。植物中WRKY基因家族數量龐大，目前167種植物的WRKY基因家族已被鑒定，其中已報道的單子葉植物玉米125個、水稻103個^［39］、香蕉164個^［40］；雙子葉植物擬南芥中有72個，番茄有81個等。畢楚韻等利用甘薯基因組版本（ipoBat4）鑒定出82個WRKY基因，其中12號、14號染色體分布WRKY基因最多，平均為11個^［29］。杜泰峰等在甘薯二倍體近緣野生種Ipomoea trifda鑒定出82個itfWRKY基因^［41］。本研究基于最新發布的甘薯基因組（pasi3）版本中共鑒定了84個IbWRKY成員，比先前版本報告多了2個WRKY基因，并發現1號和9號染色體上WRKY基因數量最多，獲得了更加準確的甘薯WRKY基因家族信息。

鑒定的84個IbWRKY基因都包含WRKY保守結構域，其中11個IbWRKY高度保守結構域發生了變異，10個從WRKYGQK變異為WRKYGKK，1個從WRKYGQK變異為WRKYGTK。在單子葉植物水稻中，部分OsWRKY蛋白的氨基酸序列發生變異，突變為WRRY、WSKY、WKRY、WVKY或WKKY^［42］。在雙子葉植物大豆中，發現GmWRKY6和GmWRKY21含有WRKYGKK基序，但是不能與W-box 結合^［43］。煙草中NtWRKY12具有WRKYGQK基序，可以特異性結合序列 TTTTCCAC，而不是正常的W-box ^［44］。因此，推測WRKYGQK基序的變異可能導致與W-box的結合能力顯著降低甚至完全喪失，或者它可以與其他新基序結合并產生新功能。

在擬南芥和花生中，WRKY基因擴增主要通過串聯復制發生^［45-46］。而在本研究中有8對基因在甘薯WRKY基因家族發生片段重復。甘薯與擬南芥、馬鈴薯、番茄等3個雙子葉植物分別有15對、39對、34對同源基因對，而與單子葉植物的水稻沒有同源基因對，表明這些同源基因對可能是在雙子葉和單子葉植物分化后形成的。WRKY家族各成員的保守基序數量和種類不同，但同一亞族蛋白質成員的保守基序和種類大致相同，具有相似的結構和生物學功能。Motif1是IbWRKY基因家族的核心保守結構域。深入分析內含子和外顯子的結構特征是基因家族進化過程中的關鍵步驟^［47］。IbWRKY基因家族不同進化群具有不同數量的外顯子，其中Ⅱ群成員外顯子數量較多，表明在進化過程中，Ⅱ群WRKY基因的分子結構保守，有利于蛋白質多樣性引起的進化^［48］。

WRKY轉錄因子可以通過與下游基因中相應的順式作用元件特異性結合，調控目的基因在特定時空的表達，參與多種代謝途徑和脅迫響應過程，從而增強植物對環境的適應性^［49］。例如棉花GhWRKY25過度表達降低了對干旱的耐受性并增加了耐鹽性^［50］，VbWRKY32正向調節冷反應基因的轉錄水平，從而維持膜穩定性并提高馬鞭草在冷脅迫下的生存能力 ^［51］。本研究甘薯WRKY轉錄因子的上游發現了豐富的順式作用元件，這些元件可與脫落酸、茉莉酸、水楊酸、干旱、低溫等脅迫有關的作用因子結合，調控甘薯抗逆基因的表達和響應。大部分IbWRKY基因在干旱、冷、鹽脅迫下表達，尤其在冷脅迫下，4個IbWRKY差異表達基因正向調控甘薯對冷脅迫的誘導。WRKY轉錄因子在非生物脅迫中的功能通常與防御相關的植物激素有關。ABA可以通過減弱OsWRKY5對其下游基因OsMYB2的抑制來提高耐旱性^［52］ 。AtWRKY39通過協同參與SA和JA信號通路來響應高溫^［53］。在ABA、SA、MeJa 3種激素處理下，IbWRKY18/30/40/45等4個差異表達基因下調，只有IbWRKY17上調表達。

WRKY轉錄因子家族在植物生長過程中具有免疫調控的功能，而這種免疫調控功能既可以正向調控也可以反向調控^［54］。擬南芥AtWRKY25在水楊酸介導的紫丁香假單胞菌（P. syringae）防御反應中起負調控作用^［55］。辣椒CaWRKY58受青枯病菌誘導后下調表達，而CaWRKY6和CaWRKY40則在抗青枯病菌中起正調控作用^［56-57］。本研究抗感莖腐病品種下調基因數量均多于上調基因，且在接種初期，抗病品種的基因表達量要高于感病品種，此外IbWRKY20和IbWRKY40在抗病品種表達上調，且表達量高于感病品種，而IbWRKY6、IbWRKY84卻表達下調，在感病品種表達量高于抗病品種。據報道IbWRKY6、IbWRKY20和IbWRKY40的同源基因AtWRKY4、AtWRKY48和AtWRKY40在擬南芥響應細菌病原體丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）抗性過程中起負調控作用^［58-60］。過表達IbWRKY84的同源基因AtWRKY75，作為GA介導的信號通路的新組成部分，積極調節擬南芥開花^［61］。通過qRT-PCR試驗，證實了轉錄組數據的可靠性。因此，這些差異表達基因可能參與甘薯的抗病反應過程。

綜上所述，本研究基于甘薯基因組pasi3版本鑒定分析了WRKY基因家族，鑒定了84個IbWRKY基因，全部位于15條染色體上。IbWRKY基因分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ群，其中Ⅱ群又分為5個亞群。啟動子順式作用元件預測，IbWRKY基因參與甘薯的生長發育、激素響應與逆境脅迫響應過程。初步挖掘到IbWRKY20、IbWRKY40、IbWRKY6和IbWRKY84等4個基因與抗莖腐病密切相關，為WRKY基因克隆、功能分析以及在莖腐病抗病過程中的調控網絡模式研究提供基礎。

參考文獻：

［1］馬代夫，李 強，曹清河，等. 中國甘薯產業及產業技術的發展與展望［J］. 江蘇農業學報，2012，28（5）：969-973.

［2］黃立飛，羅忠霞，房伯平，等. 甘薯莖腐病的研究進展［J］. 植物保護學報，2014，41（1）：118-122.

［3］Pédron J，Chapelle E，Alunni B，et al. Transcriptome analysis of the Dickeya dadantii PecS regulon during the early stages of interaction with Arabidopsis thaliana［J］. Molecular Plant Pathology，2018，19（3）：647-663.

［4］Eulgem T，Rushton P J，Robatzek S，et al. The WRKY superfamily of plant transcription factors［J］. Trends in Plant Science，2000，5（5）：199-206.

［5］Ishiguro S，Nakamura K. Characterization of a cDNA encoding a novel DNA-binding protein，SPF1 that recognizes SP8 sequences in the 5′ upstream regions of genes coding for sporamin and beta-amylase from sweet potato［J］. Molecular amp; General Genetics，1994，244（6）：563-571.

［6］Dong J X，Chen C H，Chen Z X. Expression profiles of the Arabidopsis WRKY gene superfamily during plant defense response［J］. Plant Molecular Biology，2003，51（1）：21-37.

［7］Chen C H，Chen X Q，Han J，et al. Genome-wide analysis of the WRKY gene family in the cucumber genome and transcriptome-wide identification of WRKY transcription factors that respond to biotic and abiotic stresses［J］. BMC Plant Biology，2020，20（1）：443.

［8］楊 敏，周陳平，楊 護，等. 番木瓜WRKY轉錄因子家族基因鑒定及其響應短孢炭疽菌侵染的表達分析［J］. 西北農林科技大學學報（自然科學版），2022，50（5）：127-138，154.

［9］Ye H，Qiao L Y，Guo H Y，et al. Genome-wide identification of wheat WRKY gene family reveals that TaWRKY75-A is referred to drought and salt resistances［J］. Frontiers in Plant Science，2021，12：663118.

［10］Zhang T，Tan D F，Zhang L，et al. Phylogenetic analysis and drought-responsive expression profiles of the WRKY transcription factor family in maize［J］. Agri Gene，2017，3：99-108.

［11］Huang S X，Gao Y F，Liu J K，et al. Genome-wide analysis of WRKY transcription factors in Solanum lycopersicum［J］. Molecular Genetics and Genomics，2012，287（6）：495-513.

［12］Bencke-Malato M，Cabreira C，Wiebke-Strohm B，et al. Genome-wide annotation of the soybean WRKY family and functional characterization of genes involved in response to Phakopsora pachyrhizi infection［J］. BMC Plant Biology，2014，14：236.

［13］Dou L L，Zhang X H，Pang C Y，et al. Genome-wide analysis of the WRKY gene family in cotton［J］. Molecular Genetics and Genomics，2014，289（6）：1103-1121.

［14］Gu L J，Dou L L，Guo Y N，et al. The WRKY transcription factor GhWRKY27 coordinates the senescence regulatory pathway in upland cotton （Gossypium hirsutum L.）［J］. BMC Plant Biology，2019，19（1）：116.

［15］Zhang S C，Li C，Wang R，et al. The Arabidopsis mitochondrial protease FtSH4 is involved in leaf senescence via regulation of WRKY-dependent salicylic acid accumulation and signaling［J］. Plant Physiology，2017，173（4）：2294-2307.

［16］Duan S W，Wang J J，Gao C H，et al. Functional characterization of a heterologously expressed Brassica napus WRKY41-1 transcription factor in regulating anthocyanin biosynthesis in Arabidopsis thaliana［J］. Plant Science，2018，268：47-53.

［17］Ding Z J，Yan J Y，Li G X，et al. WRKY41 controls Arabidopsis seed dormancy via direct regulation of ABI3 transcript levels not downstream of ABA［J］. The Plant Journal，2014，79（5）：810-823.

［18］Jiang W B，Yu D Q. Arabidopsis WRKY2 transcription factor mediates seed germination and postgermination arrest of development by abscisic acid［J］. BMC Plant Biology，2009，9：96.

［19］Chen L G，Song Y，Li S J，et al. The role of WRKY transcription factors in plant abiotic stresses［J］. Biochimica et Biophysica Acta，2012，1819（2）：120-128.

［20］Tsuda K，Somssich I E. Transcriptional networks in plant immunity［J］. New Phytologist，2015，206（3）：932-947.

［21］Choi C，Hwang S H，Fang I R，et al. Molecular characterization of Oryza sativa WRKY6，which binds to W-box-like element 1 of the Oryza sativa pathogenesis-related （PR） 10a promoter and confers reduced susceptibility to pathogens［J］. New Phytologist，2015，208（3）：846-859.

［22］Gao H M，Wang Y F，Xu P，et al. Overexpression of a WRKY transcription factor TaWRKY2 enhances drought stress tolerance in transgenic wheat［J］. Frontiers in Plant Science，2018，9：997.

［23］王其娟，陳利鋼，余迪求. 過表達AtWRKY71影響植物對病原菌Pseudomonas syringae的抗性［J］. 植物分類與資源學報，2015，37（5）：577-585.

［24］Zhou X，Jiang Y J，Yu D Q. WRKY22 transcription factor mediates dark-induced leaf senescence in Arabidopsis［J］. Molecules and Cells，2011，31（4）：303-313.

［25］Levée V，Major I，Levasseur C，et al. Expression profiling and functional analysis of Populus WRKY23 reveals a regulatory role in defense［J］. New Phytologist，2009，184（1）：48-70.

［26］Zheng Z Y，Qamar S A，Chen Z X，et al. Arabidopsis WRKY33 transcription factor is required for resistance to necrotrophic fungal pathogens［J］. Plant Journal，2006，48（4）：592-605.

［27］Birkenbihl R P，Diezel C，Somssich I E. Arabidopsis WRKY33 is a key transcriptional regulator of hormonal and metabolic responses toward Botrytis cinerea infection［J］. Plant Physiology，2012，159（1）：266-285.

［28］Wang X，Li J J，Guo J，et al. The WRKY transcription factor PlWRKY65 enhances the resistance of Paeonia lactiflora（herbaceous peony） to Alternaria tenuissima［J］. Horticulture Research，2020，7：57.

［29］畢楚韻，黃小芳，王和壽，等. 甘薯全基因組WRKY轉錄因子的基因鑒定與逆境脅迫表達分析［J］. 西北農林科技大學學報（自然科學版），2021，49（9）：30-44.

［30］Chen C J，Chen H，Zhang Y，et al. TBtools：an integrative toolkit developed for interactive analyses of big biological data［J］. Molecular Plant，2020，13（8）：1194-1202.

［31］Chou K C，Shen H B. Cell-PLoc：a package of Web servers for predicting subcellular localization of proteins in various organisms［J］. Nature Protocols，2008，3（2）：153-162.

［32］Lamesch P，Berardini T Z，Li D H，et al. The Arabidopsis information resource （TAIR）：improved gene annotation and new tools［J］. Nucleic Acids Research，2012，40：1202-1210.

［33］Wang Y P，Tang H B，Debarry J D，et al. MCScanX：a toolkit for detection and evolutionary analysis of gene synteny and collinearity［J］. Nucleic Acids Research，2012，40（7）：e49.

［34］Bolger A M，Lohse M，Usadel B. Trimmomatic：a flexible trimmer for Illumina sequence data［J］. Bioinformatics，2014，30（15）：2114-2120.

［35］Kim D，Paggi J M，Park C，et al. Graph-based genome alignment and genotyping with HISAT2 and HISAT-genotype［J］. Nature Biotechnology，2019，37（8）：907-915.

［36］Liao Y，Smyth G K，Shi W. Feature counts：an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features［J］. Bioinformatics，2014，30（7）：923-930.

［37］Geethalakshmi S，Barathkumar S，Prabu G. The MYB transcription factor family genes in sugarcane （Saccharum sp.）［J］. Plant Molecular Biology Reporter，2015，33（3）：512-531.

［38］Sun W J，Ma Z T，Chen H，et al. Myb gene family in potato （Solanum tuberosum L.）：genome-wide identification of hormone-responsive reveals their potential functions in growth and development［J］. International Journal of Molecular Sciences，2019，20（19）：4847.

［39］Ramamoorthy R，Jiang S Y，Kumar N，et al. A comprehensive transcriptional profiling of the WRKY gene family in rice under various abiotic and phytohormone treatments［J］. Plant amp; Cell Physiology，2008，49（6）：865-879.

［40］Jia C H，Wang Z，Wang J Y，et al. Genome-wide analysis of the banana WRKY transcription factor gene family closely related to fruit ripening and stress［J］. Plants，2022，11（5）：662.

［41］杜泰峰，侯夫云，秦 楨，等. 甘薯近緣野生種三淺裂野牽牛WRKY基因家族的生物信息學分析［J］. 分子植物育種，2021，19（3）：730-745.

［42］王東姣，張 暢，闕蓓蓓，等. 甘蔗栽培種WRKY基因家族鑒定及其在黑穗病菌脅迫下的表達分析［J］. 福建農林大學學報（自然科學版），2022，51（1）：1-14.

［43］Zhou Q Y，Tian A G，Zou H F，et al. Soybean WRKY-type transcription factor genes，GmWRKY13，GmWRKY21，and GmWRKY54，confer differential tolerance to abiotic stresses in transgenic Arabidopsis plants［J］. Plant Biotechnology Journal，2008，6（5）：486-503.

［44］van Verk M C，Pappaioannou D，Neeleman L，et al. A novel WRKY transcription factor is required for induction of PR-1a gene expression by salicylic acid and bacterial elicitors［J］. Plant Physiology，2008，146（4）：1983-1995.

［45］lker B，Somssich I E. WRKY transcription factors：from DNA binding towards biological function［J］. Current Opinion in Plant Biology，2004，7（5）：491-498.

［46］Song H，Wang P F，Lin J Y，et al. Genome-wide identification and characterization of WRKY gene family in peanut［J］. Frontiers in Plant Science，2016，7：534.

［47］Yang Y，Liu J，Zhou X H，et al. Identification of WRKY gene family and characterization of cold stress-responsive WRKY genes in eggplant［J］. PeerJ，2020，8：e8777.

［48］Hu W J，Ren Q Y，Chen Y L，et al. Genome-wide identification and analysis of WRKY gene family in maize provide insights into regulatory network in response to abiotic stresses［J］. BMC Plant Biology，2021，21（1）：427.

［49］楊旭妍，趙 爽，馬天意，等. 三個甘藍WRKY基因的克隆及其對非生物脅迫的表達［J］. 生物技術通報，2023，39（11）：261-269.

［50］Liu X F，Song Y Z，Xing F Y，et al. GhWRKY25，a group Ⅰ WRKY gene from cotton，confers differential tolerance to abiotic and biotic stresses in transgenic Nicotiana benthamiana［J］. Protoplasma，2016，253（5）：1265-1281.

［51］Wang M Q，Huang Q X，Lin P，et al. The overexpression of a transcription factor gene VbWRKY32 enhances the cold tolerance in Verbena bonariensis［J］. Frontiers in Plant Science，2020，10：1746.

［52］Lim C，Kang K，Shim Y，et al. Inactivating transcription factor OsWRKY5 enhances drought tolerance through abscisic acid signaling pathways［J］. Plant Physiology，2022，188（4）：1900-1916.

［53］Li S J，Zhou X，Chen L G，et al. Functional characterization of Arabidopsis thaliana WRKY39 in heat stress［J］. Molecules and Cells，2010，29（5）：475-484.

［54］Eulgem T，Somssich I E. Networks of WRKY transcription factors in defense signaling［J］. Current Opinion in Plant Biology，2007，10（4）：366-371.

［55］Zheng Z Y，Mosher S L，Fan B F，et al. Functional analysis of Arabidopsis WRKY25 transcription factor in plant defense against Pseudomonas syringae［J］. BMC Plant Biology，2007，7：2.

［56］Wang Y N，Dang F F，Liu Z Q，et al. CaWRKY58，encoding a group Ⅰ WRKY transcription factor of Capsicum annuum，negatively regulates resistance to Ralstonia solanacearum infection［J］. Molecular Plant Pathology，2013，14（2）：131-144.

［57］Cai H Y，Yang S，Yan Y，et al. CaWRKY6 transcriptionally activates CaWRKY40，regulates Ralstonia solanacearum resistance，and confers high-temperature and high-humidity tolerance in pepper［J］. Journal of Experimental Botany，2015，66（11）：3163-3174.

［58］Lai Z B，Vinod K，Zheng Z Y，et al. Roles of Arabidopsis WRKY3 and WRKY4 transcription factors in plant responses to pathogens［J］. BMC Plant Biology，2008，8：68.

［59］Xing D H，Lai Z B，Zheng Z Y，et al. Stress-and pathogen-induced Arabidopsis WRKY48 is a transcriptional activator that represses plant basal defense［J］. Molecular Plant，2008，1（3）：459-470.

［60］Chen H，Lai Z B，Shi J W，et al. Roles of Arabidopsis WRKY18，WRKY40 and WRKY60 transcription factors in plant responses to abscisic acid and abiotic stress［J］. BMC Plant Biology，2010，10：281.

［61］Zhang L P，Chen L G，Yu D Q. Transcription factor WRKY75 interacts with DELLA proteins to affect flowering［J］. Plant Physiology，2018，176（1）：790-803.