菊花腦WRKY基因家族生物信息學分析及其對低溫脅迫的響應特征

摘要：WRKY作為植物中最大的轉錄因子家族之一，參與植株生長過程中的各個環節，響應各種脅迫。為了探究菊花腦WRKY基因家族的進化和功能，基于已發表的RNA-Seq數據庫分析了CnWRKY在低溫脅迫響應中的表達情況，用Hmmer、NCBI-CDD軟件和Pfam數據庫得到目標基因，再用TBtools軟件分析蛋白質的理化性質，繪制進化樹，用MEME、PlantCARE分析該轉錄因子的保守基序、順式作用元件。用Hisat2、featureCounts、Trinity軟件進行菊花腦WRKY基因的組織表達分析，再用DESeq2、edgeR包進行相對基因表達量的比較。結果顯示：CnWRKY家族有72個成員，菊花腦WRKY家族基因的外顯子、內含子數量較多，CnWRKY基因上游啟動子區域存在豐富的順式作用元件，如節律控制、低溫響應以及和植物生長發育有關的調控元件，部分菊花腦WRKYs基因在葉、莖、花蕾、管狀花、舌狀花中的表達具有組織特異性，多數在莖、葉中的表達程度較明顯。 CnWRKYs在不同低溫處理下的表達量也有明顯特異性。與-5 ℃ 1 h、-5 ℃ 2 h短期低溫處理相比，CnWRKYs在4 ℃ 1 周，再于-5 ℃ 1 h、-5 ℃ 2 h的長期低溫處理下有顯著表達（Plt;0.05），其中CnWRKY55、CnWRKY63、CnWRKY38、CnWRKY31呈現顯著下調表達，推測這些基因在菊花腦抵御冷處理的過程中有關鍵作用。

關鍵詞：菊花腦；WRKY；RNA-Seq；低溫脅迫；表達分析

中圖分類號：S636.901 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）21-0047-10

收稿日期：2023-10-20

基金項目：湖北省自然科學基金一般面上項目（編號：2020CFB640）；湖北省重點研發計劃（編號：2021BBA097、2022BBA0064）。

作者簡介：何思曉（1999—），女，湖北應城人，碩士研究生，主要從事特色植物資源保護與利用方面的研究。E-mail：2583484211@qq.com。

通信作者：戴希剛，博士，副教授，主要從事園藝植物種質資源及遺傳改良與觀賞植物應用方面的研究。E-mail：xg_dai@163.com。

植物界中的WRKY轉錄因子包含豐富多樣的功能，并參與植株生長過程中的多個環節，其中包括但不限于植物的生長發育控制、對抗病原體的防御以及面對各種脅迫的適應性調控^［1］。WRKY結構域由60個左右的氨基酸殘基組成，并有1個高度維持的區域——WRKYGQK，該區域使WRKY轉錄因子具有與DNA的特殊結合能力，根據它們各自的構造特點及功能性差異，可將WRKY家族分為多個子類別，如Ⅰ、Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd、Ⅱe和Ⅲ等子類別。每個不同的子類別都有獨特的結構屬性和功能特質，比如針對DNA的結合特性、調控機制、生理過程等^［2］。

植物的自然分布與溫度緊密相關，此外溫度也會控制著季節長度并左右植物的生長和花期，太低的溫度會擾亂植物細胞的新陳代謝過程，嚴重時會降低作物產量甚至造成歉收^［3］。研究發現，WRKY轉錄因子可以直接調控與低溫適應相關的基因表達，如冷信號傳導途徑中的轉導蛋白基因、抗寒蛋白基因的表達等，從而增強植物的耐寒性^［4］。此外，一些WRKY轉錄因子還可以與其他轉錄因子或信號傳導途徑中的組分相互作用，參與低溫信號傳導網絡的調控。擬南芥中的WRKY46在低溫脅迫下被激活，并通過與其他轉錄因子（ICE1、CBFs）間的相互作用，調節抗冷性相關基因的表達，從而增強植物的耐寒性^［5］。在玉米（Zea mays）中，ZmWRKY4的相對表達量在低溫脅迫條件下顯著上調。研究發現，ZmWRKY4通過調控幾個抗冷相關基因（如ZmCOBL9、ZmDREB1A）的表達，提高了玉米植株的耐寒性^［6］。對大豆（Glycine max）的研究發現，GmWRKY27通過調控一系列與抗冷相關的基因（如GmCbf1b、GmDREB1B、GmLEA4、GmCor413IM1等）的表達，增強了大豆植株的耐寒性^［7］，此外，在蘿卜（Raphanus sativus）、甜橙（Citrus sinensis）、紅薯（Ipomoea batatas）中，WRKY家族參與了對低溫脅迫的應答^［8-10］。

菊花腦（Chrysanthemum nankingense）為菊科菊屬植物，也被叫作菊花葉、菊花菜，經常作為一種常見蔬菜出現在人們的餐桌上，具有清涼降火的作用^［11］。菊花腦適宜在溫暖的環境中生長，氣溫過低會導致其生長停滯或減緩，還會增加細菌、真菌侵染的風險，使植株遭受凍傷，影響品質，降低產量^［12］。本研究擬使用生物信息學手段確認菊花腦WRKY基因家族成員，了解其結構、保守序列及表達模式，此外，本研究擬對CnWRKY在低溫環境下的表達模式進行分析，篩選出可能在低溫響應中發揮作用的CnWRKYs基因，從而為后續研究菊花腦如何響應低溫脅迫提供基礎，并為相關抗寒育種工作提供關鍵性理論支持。

1 材料與方法

1.1 菊花腦WRKY家族成員的鑒定及序列分析

本研究所用目標基因組來源自http：//210.22.121.250：8880/asteraceae/download/downloadPage^［13］。用HMMER軟件構建WRKY蛋白（PF03106）的隱馬爾可夫模型（HMM）來檢索目標物種的全基因組蛋白數據庫，再用Pfam數據庫、NCBI CDD-Search數據庫，從上述篩選出的潛在WRKY蛋白中去除不含有WRKY結構區域的蛋白，最終得到CnWRKY家族基因^［14］。用TBtools工具估測CnWRKY家族成員蛋白質的等電點、相對分子量等理化性質^［15］。

1.2 系統發育樹的構建

擬南芥的全基因組序列源自NCBI，具體參考已發表的文章^［16］，共獲得53個擬南芥WRKY序列，用MEGA 7.0軟件將鑒定的菊花腦CnWRKY與擬南芥WRKY蛋白進行雙向比對，用鄰接法構建菊花腦與擬南芥的進化樹。

1.3 基因結構和序列分析

從上述數據中獲得菊花腦CnWRKY的相關數據，并將其導入TBtools中，對其進行結構分析。提取CnWRKY上端2 000 bp堿基片段，導入PlantCARE中進行分析^［17］。將CnWRKY家族導入在線分析工具MEME中，設置結構域數量為5，將結果文件導入Tbtools中進行繪制^［18］。

1.4 菊花腦WRKY基因的組織表達分析

從菊花腦基因組數據庫中獲得不同組織或器官（莖、葉、花蕾、盤狀花和舌狀花）的轉錄組數據^［19］，用Hisat2軟件將轉錄組數據比對到參考基因組上以構建index，用featureCounts軟件對轉錄組數據進行表達定量，再用Trinity軟件合并表達矩陣，得到經TPM、TMM標準化的值^［20］，然后用TBtools軟件進行基因組織表達的可視化。

1.5 菊花腦WRKY基因響應低溫脅迫的表達分析

在NCBI中下載菊花腦在低溫脅迫下的原始 RNA-Seq 數據（編號：SRR1237217、SRR1237587、SRR1237609、SRR1237610和SRR1237611）^［19］。利用featureCounts軟件進行計算。對照組（CK）為 22 ℃；處理組RA為4 ℃ 1周；處理組RB1為 -5 ℃ 1 h；處理組RB2為-5 ℃ 2 h；處理組RC1為4 ℃ 1周，再于-5 ℃ 1 h；處理組RC2為4 ℃ 1周，再于-5 ℃ 2 h。進行上述處理后，進行基因表達的可視化。

用featureCounts軟件得到reads count矩陣，用DESeq2、edgeR軟件進行不同樣本間的差異表達基因比較。根據不同低溫相對于對照的4種處理，分析不同組織間WRKYs的表達差異，分別為RA對CK、RB1對CK、RB2對CK、RC1對CK、RC2對CK^［21］。

2 結果與分析

2.1 菊花腦WRKY家族成員

從蛋白數據庫中共鑒定到86個潛在的CnWRKY蛋白，去除不含有WRKY結構域的蛋白，剩余的72個蛋白即為WRKY蛋白，根據位置將其命名為CnWRKY1～CnWRKY72（表1）。CnWRKY編碼蛋白質的長度為 81～678 aa，相對分子量為9.46～74.49 ku，等電點預測值為4.84～10.16，其中35個蛋白為酸性蛋白，37個蛋白為堿性蛋白，脂溶系數為26.66～72.43，不穩定系數均大于40，親水系數都小于0，說明72個CnWRKY蛋白均為不穩定的親水性蛋白。

為了研究CnWRKY和擬南芥WRKY（AtWRKY）蛋白的進化關系，構建了系統發育樹（圖1）。結果表明，72個CnWRKY蛋白被聚為3個亞家族，與AtWRKY蛋白的樹形拓撲結構和分類結果一致。同時，CnWRKY蛋白可分為Ⅰ、Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd、Ⅱe和Ⅲ類別。20個CnWRKY蛋白被歸類為Ⅰ類，共31個CnWRKY蛋白是Ⅱ類，21個CnWRKY被歸類為Ⅲ類。根據擬南芥WRKY亞族的分類結果，Ⅱ類中的CnWRKY進一步可被細分為5個亞族，包括組Ⅱa（4）、Ⅱb（8）、Ⅱc（7）、Ⅱd（6）和Ⅱe（6）。

2.2 菊花腦WRKY基因的結構和啟動子

本研究分析了CnWRKY編碼的mRNA的結構，發現它們包含2～9個CDS（編碼序列）區域（圖2），其中CnWRKY21編碼的mRNA最特殊，包含3個UTR（非翻譯區），CnWRKY的長度、內含子數量不同，其中內含子數量為2～9個；內含子最多的是CnWRKY23，有9個；有8個基因（CnWRKY54、CnWRKY25、CnWRKY71、CnWRKY49、CnWRKY62、CnWRKY37、CnWRKY13、CnWRKY48）只有1個內含子，可能與進化過程中內含子數量的變化有關。同一亞家族的大多數CnWRKY含有的內含子數量相同，例如groupⅡ-b亞家族的CnWRKY7、CnWRKY8、CnWRKY52、CnWRKY51、CnWRKY55都含有4個內含子，group Ⅲ亞家族的CnWRKY57、CnWRKY35、CnWRKY63、CnWRKY67和CnWRKY11都含有2個內含子，說明CnWRKY家族具有相似的進化和擴張進程。

通過分析CnWRKY上游的2 000 bp片段，本研究共篩選出15種順式作用元件，順式作用元件種類豐富，50個含有厭氧誘導元件，47個含有節律控制元件，32個含有MYB結合位元件，23個含有脅迫響應元件，18個有生長激素響應元件，17個有低溫響應元件等，說明CnWRKY基因在菊花腦響應和適應各種環境壓力中扮演著重要角色。

2.3 菊花腦WRKY蛋白的保守基序

如圖4所示，在CnWRKY蛋白上發現了5個更為保守的基序，每個蛋白保守基序的數量為1～6個，其中Motif 1、Motif 2、Motif 3出現的次數較多，基本出現在所有CnWRKY蛋白中，說明它們在CnWRKY蛋白的結構域中具有重要功能。Motif 1、Motif 5基本都在N端，Motif 2、Motif 3基本都在C端，Motif 4在N端、C端都有分布。此外，位于1個亞簇的CnWRKY蛋白具有相似的基序組成，例如groupⅠ亞家族包含全部Motif，group Ⅲ亞家族包含Motif 1、Motif 2、Motif 3，groupⅡ a與groupⅠ均包含Motif 1、Motif4、Motif 5，group Ⅲ與groupⅡb均包含Motif 2。

2.4 菊花腦WRKY的組織表達分析

用菊花腦數據庫中已發表的RNA-Seq數據分析菊花腦不同部位CnWRKY的表達水平。結果顯示，有66個CnWRKY至少在1個檢測組織中表達，CnWRKY7、CnWRKY13、CnWRKY16、CnWRKY18、CnWRKY53、CnWRKY68基因在上述組織中均未檢測到，其中8個CnWRKY基因未在花蕾中發現，6個CnWRKY基因未在管狀花中找到，9個CnWRKY基因未在莖中檢測到，9個CnWRKY基因未在舌狀花中觀察到，9個CnWRKY基因未在葉中發現（圖5）。出現上述結果的原因可能是存在偽基因或這類基因僅在特定發育階段或環境下才會被激活。有32個CnWRKY在莖中有較明顯的表達，29個CnWRKY在葉中具有高的表達水平，23個CnWRKY在花蕾中明顯表達，16個CnWRKY在舌狀花中有高表達，17個CnWRKY在管狀花中具有較高的表達［lg（TPM+TMM+1）gt;1］。CnWRKY基因在莖、葉中的相對表達量較高（圖5）。

2.5 低溫脅迫下菊花腦WRKY基因的表達

利用菊花腦數據庫中已發表的RNA-Seq數據分析菊花腦在不同冷脅迫處理中CnWRKY的表達水平。結果顯示，有63個CnWRKY至少在1個檢測樣品中表達（TPM+TMMgt;0），其中CnWRKY9、CnWRKY14、CnWRKY16、CnWRKY18、CnWRKY25、CnWRKY35、CnWRKY42、CnWRKY67、CnWRKY6 9個基因在冷脅迫中均未檢測到，CnWRKY6、CnWRKY18、CnWRKY68在菊花腦不同部位的組織中也未檢測到， 可能由于存在假基因或者這些基因只在特定環境下表達。在4 ℃、1周冷脅迫處理組RA中，有23個CnWRKY基因具有較高的相對表達量，在-5 ℃ 1 h處理組的RB1中，有30個CnWRKY基因具有較高的相對表達量，在處理組RB2中，有31個CnWRKY基因具有較高的相對表達量。在處理組RC1中，有25個CnWRKY基因具有較高的相對表達量，處理組RC2檢測到25個CnWRKY基因具有較高的相對表達量。總體上看，一些CnWRKY可能在菊花腦應對低溫脅迫中起著顯著作用。

當基因豐度的差值倍數達2倍或以上，且Plt;0.05時，該基因為候選差值基因。對處理組與對照組進行組間兩兩比較，并繪制火山圖（圖7），共檢測到4個WRKY基因有顯著下調，在CK vs RA中，CnWRKY38、CnWRKY55、CnWRKY63下調表達，相對表達量受到顯著抑制；在CK vs RC1中，CnWRKY63、CnWRKY31顯著下調表達；在CK vs RC2中，CnWRKY38、CnWRKY63、CnWRKY31顯著下調表達；在CK vs RB-1、RB-2中，并未發現CnWRKY表現出顯著差異表達，表明CnWRKY家族參與了冷馴化后對零下低溫的響應，該結果與任麗萍對菊花腦低溫響應基因的研究結果^［22］一致，即CnWRKY38、CnWRKY63、CnWRKY31、CnWRKY55在葉、花蕾中的相對表達量較高，可能與葉、花蕾對低溫脅迫更敏感有關。

3 討論與結論

近年來，隨著測序技術的不斷發展，對WRKY的研究已經深入到許多作物中，包括擬南芥、綠豆、香樟和菊芋等^［23-25］，然而目前尚未見關于菊花腦CnWRKY基因的報道。為了系統地闡述菊花腦WRKY基因家族，鑒定出72個包含完整結構域的菊花腦WRKY家族基因，在這些CnWRKY基因家族編碼的蛋白質中，所有蛋白均為不穩定蛋白、親水蛋白，并且有35個為酸性蛋白， 37個為堿性蛋白，這些性質與蛋白的功能有密切關系。

利用擬南芥中AtWRKY蛋白序列和系統發育關系，將72個菊花腦CnWRKY成員分為：Ⅰ、Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd、Ⅱe和Ⅲ亞家族，各組分別有20、4、8、7、6、6、21個CnWRKY基因，保守基序分析表明，絕大多數CnWRKY蛋白含有的特征基序構成不同，如Ⅰ類成員特征序列為Motif 5。Ⅱa特征基序是 Motif 4，Ⅱb和Ⅲ類成員大多包含 Motif 1、Motif 2、Motif3，保守基序種類不同說明這些成員在進化歷程中產生了不同程度的變異，這可能與WRKY家族分類及功能調控有關。在基因結構、蛋白保守域分析分類中，各個亞簇成員間都有類似的保守域結構，這與前人研究的另外作物中WRKY結構類似^［26］。本研究對CnWRKY啟動子區域進行深入分析，發現一系列參與脅迫相關的作用元件。如：厭氧誘導元件、節律控制元件、MYB結合元件、茉莉酸響應元件、 參與防衛和脅迫響應元件等。這些發現進一步揭示了CnWRKY基因的表達可能受到多種因素的調控，包括光、激素和逆境等。同時這些順式作用元件的存在也暗示了CnWRKY基因可能在植物的生長、 發育及抗逆等方面發揮重要作用。

WRKY轉錄因子在植物生長發育中有著特別的調控機制，為了探究菊花腦WRKY基因在生長發育期間的應答機制，本研究對72個菊花腦WRKY基因在5個組織（花蕾、舌狀花、葉、莖和管狀花）中的表達情況進行系統分析，結果顯示有44個菊花腦WRKY基因在各組織中均有表達，因此推測這 44個基因可調控菊花腦的整個生長發育過程，其中CnWRKY32、CnWRKY38、CnWRKY55、CnWRKY56、CnWRKY57、CnWRKY63、CnWRKY70在菊花腦葉中的表達量較高；CnWRKY1、CnWRKY10、CnWRKY27、CnWRKY33在菊花腦莖中的表達量較高，CnWRKY29、CnWRKY31在花蕾中有較高的表達量，CnWRKY67僅在花蕾組織細胞中表達，在其他組織中未見表達，說明CnWRKY67主要調控花蕾的形態建成，在擬南芥研究中發現AtWRKY1基因僅在根和花組織中表達，在其他中未見表達，枸杞（Lyciumbarbarum）中的LbWRKY3在根部表達量遠高于花部，并且隨著植株生長，它的表達會逐漸增高^［27］。

在遭受生物及非生物脅迫抗性中WRKY在不同組織細胞中承擔的生理功能不同，其表達量也存在差異。在擬南芥中發現，AtWRKY25、AtWRKY26和AtWRKY33在低溫環境下能被快速誘導激活，4 ℃低溫下24 h，AtWRKY25 與AtWRKY26的表達量逐漸增高，AtWRKY33的表達為先增加后降低直至消失^［28］。AtWRKY25的同源基因CnWRKY38（基于系統進化分析）在4 ℃ 1周和-5 ℃ 1 h的冷處理中顯著下調。在對油棕的研究發現，WRKY1和WRKY7在長期的低溫馴化過程中比短時間冷脅迫表達量高，說明WRKY1、WRKY7對油棕抗寒性構成發揮調控作用^［29］。吳玲利等研究發現大部分CoWRKY基因參與油茶抗逆脅迫響應，其中CoWRKY11、CoWRKY14、CoWRKY20、CoWRKY29 和 CoWRKY56在不同逆境下快速誘導表達^［30］。本研究發現，有63個CnWRKY參與菊花腦低溫脅迫響應，其中CnWRKY38、CnWRKY63、CnWRKY55、CnWRKY31在長期低溫（4 ℃ 1周）處理中顯著表達，對菊花腦耐低溫起著調控作用。

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