噴施氨基酸對紫米產量和花青素含量的影響

摘要：探究葉面噴施不同類型氨基酸對紫米產量和花青素含量的影響，以期為紫米提質增效提供技術支撐和理論依據。以紫米滇香紫1號為研究對象，通過大田試驗，在抽穗期與灌漿期葉面噴施蒸餾水（CK）、苯丙氨酸（Phe）、脯氨酸（Pro）和γ-氨基丁酸（GABA），分析各處理對紫米產量、加工品質和花青素含量的影響。采用高效液相質譜聯用技術結合主成分分析和偏最小二乘判別分析等多元統計分析方法對不同處理樣品進行非靶向代謝組學分析。結果表明，外源噴施氨基酸可提高紫米產量和品質。與CK相比，噴施氨基酸顯著增產6.35%～12.70%（Plt;0.05）；整精米率增幅為2.99%～7.34%，其中GABA處理整精米率最高，為67.12%；出糙率增幅3.73%～5.20%，其中Phe處理出糙率最高達75.81%。噴施氨基酸能促進花青素合成，尤其是Phe處理，能顯著提高矢車菊-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-蕓香糖和芍藥素-3-O-葡萄糖苷的含量。代謝組學共鑒定出175個代謝物，包括氨基酸15個、苯型烴類6個、脂類6個、核苷類33個、有機酸類71個、有機雜環33個和其他代謝物11個。京都基因與基因組百科全書富集圖發現噴施氨基酸可以顯著提高氨基酸和核苷酸類代謝。說明抽穗期與灌漿期噴施氨基酸能夠提高紫米產量和品質，是紫米提質增效的有效措施。

關鍵詞：紫米；氨基酸；花青素；代謝組學

中圖分類號：S511.04 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）21-0091-06

收稿日期：2023-10-17

基金項目：云南現代農業綠色關鍵技術創新與平臺建設項目（編號：202102AE090053）。

作者簡介：涂國青（1998—），女，碩士研究生，云南昭通人，研究方向為水稻產量與品質。E-mail：1095415590@qq.com。

通信作者：徐玖亮，博士，副教授，主要從事養分管理與作物品質研究。E-mail：jlxu9@cau.edu.cn。

紫米含有豐富的花青素和兒茶素等強抗氧化化合物^［1-2］，抗氧化能力是普通大米的4～8倍。具有抗氧化、抗炎抗癌等作用^［3-6］。由于品種、氣候、施肥等原因導致紫米產量低、抗性差、口感不佳、轉色不均、花青素含量低等問題^［7］。研究表明，有機無機肥配施對紫米增產不顯著^［8］。葉面噴施氨基酸能提高香米結實率、千粒重和籽粒代謝活性，從而提高香米產量和改善品質^［9］，因此，葉面噴施不同氨基酸對紫米產量、品質的影響試驗具有重要研究意義。數據顯示，云南省紫米平均產量只有 5.6 t/hm^2［10］。盧浩宇等為提高紫米產量，設計了不同施肥梯度和施肥配比，發現總施氮量150 kg/hm²，化肥減量50%配施有機肥能提高紫米產量，但是紫米產量也只達到了4 077 kg/hm²且處理間紫米品質差異不顯著^［8］。氨基酸肥能顯著提高蔬菜、果樹、粳稻的產量，但噴施氨基酸肥在紫米的研究工作中鮮有文獻報道^［11-13］。花青素賦予紫米重要的營養價值，紫米花青素是植物新陳代謝過程產生的類黃酮物質^［14］，花青素廣泛存在于植物表皮細胞的液泡中，是一種水溶性色素，一般呈橙色、紅色和藍色^［15］。通過不同產地紫米花青素含量比較分析得出，云南墨江紫米花青素含量顯著低于陜西漢中紫米花青素含量^［16］。植物本身氨基酸濃度很低，需要從氨基酸合成途徑中高度誘導次生代謝產物來提高花青素含量^［17］。前人研究在芒果和蘆筍試驗中發現外源添加苯丙氨酸可以提高苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性和花青素含量^［18-19］。噴施氨基酸葉面肥能夠提高其他作物產量和品質，但噴施氨基酸對紫米產量和品質的影響尚不清楚。通過大田試驗，探討噴施不同種類氨基酸對紫米產量和花青素含量的影響，利用非靶向代謝組學技術揭示氨基酸調控紫米花青素含量的機制，為紫稻米提供營養品質方面的理論依據與生產指導。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗田位于云南省西雙版納州勐海縣曼根村曼莊小組（100.23°E，21.95°N）；屬熱帶、亞熱帶西南季風氣候，海拔1 700 m，年平均氣溫18.7 ℃，年均降水量1 341 mm。試驗地小區面積100 m² （10 m×10 m），每個處理3次重復。試驗地耕層土壤pH值為5.6，有機質含量33.1 g/kg，速效磷含量21.0 mg/kg，速效鉀含量146 mg/kg，全氮含量 1.9 g/kg。2022年水稻移栽到收獲時間為2月8日至7月20日，全生育期共162 d。

1.2 試驗設計

供試紫米品種為滇香紫1號。當地常規肥料用量為N含量180 kg/hm²，P₂O₅含量75 kg/hm²，K₂O含量90 kg/hm²。氮肥運籌為基肥∶分蘗肥∶穗肥=4∶3∶3。磷、鉀肥均分2次施用，基追比為1∶1。本試驗的肥料用量與當地常規施肥相同，分別在抽穗期與灌漿期噴施葉面氨基酸肥［苯丙氨酸（Phe）、脯氨酸（Pro）、γ-氨基丁酸（GABA）］，蒸餾水為對照（CK），氨基酸純氮濃度均為1.25 mmol/L，用量是300 L/hm²，每個處理設3個重復。成熟期收獲后，放置陰涼通風處風干，直至水分達到13.5%，計算結實率、千粒重和產量。

1.3 試劑與儀器設備

苯丙氨酸、脯氨酸、γ-氨基丁酸、色譜級乙腈、甲醇、色譜級乙酸銨、磷酸二氫鈉、磷酸（北京雪杰特科技有限公司）；冷凍干燥機（FD-1A-50，北京博醫康公司）；超低溫冰箱（DW-86 L 388，海爾公司）、分析天平（BT 1245，德國Sartorious公司）；恒溫水浴鍋（HH.S11-4，北京長安科學儀器廠）；離心機（CR 22 g，日本HITACHI公司）；LC-MS儀器，色譜柱。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品前處理

按照GB 1350—2009《稻谷》進行水稻籽粒脫殼、碾磨，測定糙米率和整精米率等。

1.4.2 水稻測產方法

水稻成熟期在每個小區內數30穴水稻的有效穗數，取得平均值后，每個小區取接近平均數的5穴水稻帶回室內數每穗粒數，計算結實率、千粒重等產量構成因子。水稻成熟時實收測產并放置陰涼通風處風干，直至水分達到13.5%左右。

1.4.3 花青素提取

紫米置于球磨儀中振動研磨3 min，過80目篩，-20 ℃避光保存。稱取40 mg紫米粉末置于提取管中，4 mL 70%乙醇（水與鹽酸的體積比為29∶1）作為提取劑，混勻振蕩30 s后超聲 30 min，-20 ℃ 靜置過夜，取2 mL上清液過 0.22 μm 尼龍膜至-80 ℃冰箱保存備用。

1.4.4 代謝物提取

稱取100 mg粉末樣品置于EP管中，加入1.5 mL預冷提取液（甲醇∶乙醇∶水的體積比=4∶4∶2），渦旋振蕩30 s后冰浴中超聲1 h，在4 ℃條件下，16 000 g離心10 min，取上清液過0.22 μm尼龍膜至-80 ℃冰箱保存備用。花青素標品配制標準溶液，以橫坐標為標品峰面積，縱坐標為濃度繪制標準曲線。

1.4.5 代謝組分分析

采用Nexera X2LC-30AD高效液相色譜進行樣品分離，色譜柱為C18色譜柱（ACQUITY UPLC BEH C 18（1.7 μm×2.1 mm×100 mm，Waters）。流動相：A液為95%水（5%乙腈，含20 mmol/L乙酸銨），B為乙腈。柱溫為 40 ℃，流速0.3 mL/min，進樣量5 μL。色譜分離條件：0～1 min，5%B；1～14 min，B液從5%線性變化到35%；15～17 min，B液維持65%；17～17.1 min，B液從65%線性變到5%；17.1～20 min，B液維持5%。采用QTRAP 5500質譜儀在正/負離子模式下進行質譜分析。正離子模式：ESI電子噴霧電壓 5 500 V（正離子模式）或-4 500 V（負離子模式）；毛細管溫度550 ℃；離子源加熱輔助氣40 psi；氣簾氣50 psi。

1.4.6 數據處理

對原始峰值提取、奇異點剔除、基線校準、峰對齊、反褶積分析、峰識別、峰面積整合等。所得結果進行核糖醇校正，并將校正后的數據導入MS Office Excel中。然后利用SIMCA-P+23軟件進行主成分分析并利用SPSS 20對數據進行差異性分析，利用MS Office Excel 2019、Origin 2019、R語言軟件對數據結果進行作圖。所有數據都是用Microsoft Excel 2007和方差分析軟件進行處理和統計分析的。

2 結果與分析

2.1 噴施氨基酸對紫米產量及產量構成因子的影響

由表1可知，噴施氨基酸顯著提高紫米產量（Plt;0.05），Phe、Pro和GABA處理分別增產6.35%、14.29%和12.70%，各氨基酸處理中以Pro處理的產量最高。各處理間有效穗數和穗粒數無顯著差異。氨基酸處理顯著提高了紫米結實率，Phe、Pro、GABA處理結實率分別顯著增加5.04%、6.00%、3.84%，千粒重依次增加0.9、0.7、0.3 g。

2.2 噴施氨基酸對紫米出糙率和整精米率的影響

由圖1可知，各氨基酸處理的出糙率均顯著高于CK，增幅為3.73%～5.20%，其中Phe處理出糙率最高，為75.81%，較CK高3.75百分點，不同氨基酸處理之間出糙率無顯著差異。各氨基酸處理整精米率均高于CK，增幅為2.99%～7.34%，其中GABA處理整精米率最高，為67.12%，較CK增加4.59百分點，不同氨基酸處理之間整精米率無顯著差異。

2.3 噴施氨基酸對紫米花青素成分的分析

花青素是紫米中重要的功效成分，采用 UPLC-ESI-MS進行一級質譜和二級質譜鑒定并對標準品進行比對得出， 滇香紫1號主要花青素成分為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-蕓香糖和芍藥素-3-O-葡萄糖苷（圖2）。

矢車菊素-3-O-葡萄糖苷是滇香紫1號最主要的花青素，其含量在85.5～115.3 μg/g之間。噴施氨基酸顯著提高了矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量，Phe、Pro、GABA處理較CK分別提高29.8、10.7、14.1 μg/g。Phe處理較Pro、GABA處理分別顯著提高17.1、15.7 μg/g。矢車菊素-3-O-蕓香糖含量相對較低，在6.2～8.5 μg/g之間，3種氨基酸處理較CK分別顯著提高2.3、1.4、1.2 μg/g，氨基酸處理之間無顯著差異。芍藥素-3-葡萄糖苷含量在32.3～45.6 μg/g之間，3種氨基酸處理較CK分別顯著提高13.3、4.2、6.1 μg/g。Phe處理較Pro、GABA處理分別顯著提高了9.1、7.2 μg/g。噴施氨基酸顯著提高了滇香紫1號中的花青素含量，其中Phe處理效果最為顯著（圖3）。

2.4 代謝通路分析

通過MRM Analyzer（R）代謝物原始數據進行定性和定量分析，共鑒定出175個代謝物，包括氨基酸15個、苯型烴類6個、脂類6個、核苷類33個、有機酸類71個、有機雜環33個、其他代謝物11個。通過對樣本進行偏最小二乘法分析，判別不同氨基酸處理樣本之間差異度大小，尋找差異代謝物。數據分析結果（圖4）表明，CK與噴施氨基酸肥處理間充分分散，說明不同處理間代謝物存在差異。初步篩選出不同處理間顯著差異的代謝物，選取VIPgt;1且Plt;0.05的代謝物。篩選出45個代謝物，包括7個氨基酸、9個核苷類化合物、16個有機酸及其衍生物及其他13個代謝物。

滿足student’s t檢驗Plt;0.05、VIPgt;1的代謝物為顯著性差異代謝。篩選出45個代謝物，包括7個氨基酸、9個核苷類化合物、16個有機酸及其衍生物、13個其他代謝物。根據篩選出的顯著性差異代謝表達量制成聚類分析熱圖，結果顯示，Phe處理促進苯丙氨酸、吡哆醛、肌醇、谷氨酸鹽、磷酸氧化酶、天冬氨酸、賴氨酸、谷胱甘肽、賴氨酸、尿酸、半胱氨酸、谷氨酰胺等代謝活性。其中，苯丙氨酸是花青素合成的主要前體代謝物，表明外源噴施苯丙氨酸能夠誘導苯丙氨酸合成，從而提高紫米中的花青素含量（圖5）。Pro處理提高了肌酸酐代謝，GABA處理提升了苯丙氨酸、精氨酸和谷氨酰胺活性。相比Pro、GABA處理，Phe處理提高了氨基酸和核苷酸類代謝。

利用KEGG數據庫對差異代謝物進行代謝通路富集分析，45個差異代謝物主要分布在11條代謝途徑中，分別是精氨酸合成、苯丙氨酸代謝、三羧酸循環、精氨酸和脯氨酸代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、嘌呤代謝、β-丙氨酸代謝、淀粉和蔗糖代謝、硫胺素合成、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝和嘧啶代謝。說明不同處理氨基酸代謝的差異主要來自于這11個代謝途徑，其中嘧啶代謝是造成不同處理代謝差異的主要原因（圖6）。

3 討論

3.1 噴施氨基酸對紫米產量及構成因子的影響

氨基類葉面肥能夠為作物提供大量的營養，這些營養通過葉面被直接吸收，調節碳、氮平衡，有效改善作物體內生理生化過程和營養狀態^［20］。目前，國內外對噴施氨基酸或氨基酸肥料展開了許多研究，施用氨基酸或者氨基酸肥料能夠顯著提高水稻、蔬菜、水果、烤煙和大豆等作物產量和品質^［21-24］。本試驗結果表明，噴施苯丙氨酸、脯氨酸和γ-氨基丁酸均能對紫米生長起到促進作用，提高紫米產量和品質，與前人研究結果一致。噴施氨基酸能夠促進植株對氮的吸收和生長，提高氮的轉運效率，進而提高水稻產量^［25］。尤其是在水稻生長后期，如抽穗和灌漿期適量補氮能夠延緩植株衰老，促進干物質積累及光合產物向穗部轉移^［26］。從產量構成因素來看，各氨基酸處理對結實率有增加作用，噴施氨基酸能夠誘導氮代謝酶活性來增加葉片氮濃度，氮素代謝酶的誘導和葉片吸收的氨基酸直接用于蛋白質合成是水稻結實率增加的主要因素^［25］。千粒重增加的原因可能是噴施氨基酸提高了籽粒庫生理活性，促進養分吸收轉運，進而從源吸收積累更多同化物來提高水稻千粒重，實現高產^［26-27］。

3.2 噴施氨基酸對紫米品質的影響

外源噴施氨基酸是提高稻米品質的重要手段，本研究中噴施氨基酸對紫米出糙率和整精米率均有顯著提升，其中Phe處理的出糙率最高，GABA處理整精米率最高。氨基酸是含氮的小分子化合物，不同種類氨基酸在不同品種體內具有不同的生理效應，如宋聰等研究發現，噴施谷胺酰胺顯著提高五優稻4號（又名稻花香2號）的加工品質^［9］。氮能夠有效調控花青素的合成，前人研究氮對擬南芥、蘋果、葡萄中花青素含量的影響發現，低氮脅迫能夠促進花青素合成^［28-30］。但在紫米施氮研究中發現，施氮會促進花青素的合成^［31］。本研究發現，噴施氨基酸能顯著提高紫米中的花青素含量，其中噴施苯丙氨酸（Phe）效果最為顯著。植物花青素合成屬于次級代謝產物黃酮類的分支途徑，苯丙氨酸是花青素合成的直接前體，在一系列酶的催化下形成花青素^［32］。紫米中苯丙氨酸含量與花青素含量呈顯著正相關關系^［33］。通過代謝組學顯示，外源噴施氨基酸顯著提高氨基酸合成代謝途徑，如精氨酸、脯氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，尤其是苯丙氨酸代謝，提高了花青素合成前體物質苯丙氨酸含量，從而促進花青素積累。也有可能由于噴施氨基酸后促進籽粒糖分合成和積累，誘導花青素合成酶表達活性，進而促進花青素合成。

4 結論

試驗通過噴施不同種類氨基酸發現，3種氨基酸處理均能提高紫米產量和促進花青素積累。Phe、Pro和GABA這3種氨基酸處理分別增產6.35%、14.29%和12.70%。Phe處理促進花青素積累效果最顯著，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-蕓香糖、芍藥素-3-O-葡萄糖苷的含量分別較CK提高了29.8、2.3、13.3 μg/g。因此在紫米實際生產中可根據環境因素、肥料成本、品質需求等因素綜合考慮，噴施適當氨基酸實現紫米增產增效目標。

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