外源海藻糖對NaCl脅迫下大豆幼苗的影響

摘要：為研究外源海藻糖對NaCl脅迫下大豆幼苗生長的影響，采用葉面噴施海藻糖的方式，以中黃13為材料，在大豆幼苗長出真葉時進行NaCl脅迫（NaCl濃度為125 mmol/L），大豆幼苗復葉展開噴施不同濃度海藻糖（海藻糖濃度分別為0、5、10、20 mmol/L），研究NaCl脅迫下，噴施不同濃度海藻糖對大豆幼苗離子轉運基因、生物量、抗氧化酶活性和滲透調節物質含量的影響。結果發現，在NaCl脅迫下，大豆幼苗生長明顯受到抑制。噴施不同濃度海藻糖有利于緩解NaCl脅迫對大豆幼苗生長的抑制。其中，與鹽處理組相比，噴施10 mmol/L海藻糖顯著提高了GmsSOS1和GmCLC1基因的表達；大豆幼苗的鮮重、干重、葉面積、株高以及根長分別增加了22.7%、50.0%、86.8%、9.7%和23.0%；大豆幼苗的P_n、G_s、T_r和C_i也分別提高了69.3%、57.3%、21.5%和34.6%。此外，噴施不同濃度的海藻糖還可以提高大豆幼苗滲透調節物質的含量，提高超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性。噴施不同濃度的海藻糖還降低了大豆幼苗丙二醛（MDA）含量，提高了質膜保護能力。綜上所述，噴施海藻糖能提高大豆幼苗的耐鹽性，其中，噴施10 mmol/L海藻糖效果最為明顯，生產上可嘗試在鹽堿地大豆幼苗時期噴施海藻糖以培育大豆幼苗。

關鍵詞：大豆；鹽脅迫；抗氧化系統；滲透調節；海藻糖

中圖分類號：S565.101 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）21-0116-07

收稿日期：2024-01-04

基金項目：國家自然科學基金（編號：32172047）。

作者簡介：張學彪（1997—），男，安徽淮北人，碩士研究生，主要從事植物保護研究。E-mail：17755454356@163.com。

通信作者：莊義慶，博士，研究員，主要從事植物保護研究。E-mail：20072804@jaas.ac.cn。

大豆［Glycine max （L.） Merr.］作為我國重要的豆科作物之一，含有豐富的蛋白質和脂肪，為人類提供重要的營養^［1］。隨著全球人口的迅速增長，大豆的產量需求也在顯著增加。全球氣候變化以及灌溉方式的不合理性，導致了我國鹽堿地的面積不斷擴大，鹽脅迫已成為導致大豆產量降低和品質下降的主要非生物脅迫因素^［2］。然而大豆對鹽脅迫相對敏感，因此研究大豆的耐鹽機制對于提高產量、擴大適種范圍和保障國家糧食安全具有重要意義。

海藻糖是由兩分子葡萄糖而組成的非還原性二糖，主要存在于海藻、陸生植物和一些微生物中。特別是在植物上，通過轉入海藻糖合成相關酶基因使得作物植株表達、積累海藻糖從而獲得抗逆性，但在技術上較為復雜，對植物生長也可能造成負面的影響^［3-7］。通過外源添加海藻糖對植物生物膜、蛋白質等大分子物質具有良好的保護作用，使用上也比較靈活^［8-9］。因此，研究外源海藻糖對鹽脅迫下的大豆幼苗生長發育及其抗氧化能力的影響，可為耐鹽大豆品種選育及耐鹽大豆栽培提供理論依據，提高我國大豆產量，保障國家糧食安全。

對豆科植物而言，幼苗發育階段對鹽脅迫的敏感性高于萌發時期。植株根系與土壤環境直接接觸會受到滲透脅迫，從而導致根部細胞吸收水分和營養物質受到抑制，阻礙根系的生長發育^［10］。研究表明，鹽脅迫會抑制番茄根系的生長，且隨著抑制程度的增加，番茄的生物量明顯減少。此外，孟娜等研究發現，鹽脅迫會大大降低大豆葉片中K⁺、Ca²⁺和Mg²⁺的含量，影響植株的光合速率，減少碳水化合物的積累，最終導致植物葉片逐漸變黃，甚至死亡^［11］。隨著對海藻糖研究的深入，發現海藻糖可以顯著改善植物在非生物脅迫下的抗氧化能力。例如，劉強等研究發現，在培養南蛇藤時，在NaHCO₃脅迫下，噴施海藻糖后南蛇藤葉片中的抗氧化酶的活性明顯增加，抑制脂質過氧化和膜通透性增強，改善了葉片的保護作用，緩解了NaHCO₃對南蛇藤的氧化傷害，提高了南蛇藤抗鹽脅迫的能力^［12］。汪紅玲的研究表明，外源海藻糖可提高擬南芥耐鹽能力^［13］。鄒德堂等研究發現，外源海藻糖極大地提高堿脅迫下水稻的耐堿能力，緩解堿脅迫對水稻造成的傷害^［7］。前人研究集中在海藻糖對其他植物在干旱、低溫及堿脅迫下的緩解作用^［13-16］，而對于鹽脅迫下的大豆幼苗期海藻糖的用量以及大豆幼苗影響則研究較少^［8］。本研究以大豆品種中黃13為試驗材料，通過對125 mmol/L NaCl脅迫下的大豆幼苗，噴施不同濃度的海藻糖，以研究其對大豆幼苗生理、光合以及抗逆的影響，篩選出適宜的海藻糖濃度，為在鹽堿地種植大豆或者耐鹽大豆品種選育提供一定的依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗開展時間為2023年7—11月；試驗地點為江蘇省農業科學院卓越創新中心光照培養室培養；供試材料為大豆品種中黃13，由江蘇省農業科學院經濟作物研究所提供；海藻糖購自上海源葉生物科技有限公司，其他試劑為筆者所在實驗室保存的分析純。

1.2 試驗方法

挑選籽粒飽滿、大小一致的大豆種子，利用10%次氯酸鈉消毒20 min后用去離子水沖洗5遍，然后置于25 ℃培養箱黑暗處理，進行催芽。挑選發芽一致的種子播于基質土中，于江蘇省農業科學院卓越創新中心光照培養室，培養條件25 ℃，光照時間16 h，黑暗8 h，濕度50%～60%。待真葉展開后挑選生長一致的大豆幼苗轉移到盛有0.8 L改良Hogland營養液水培盒中，保持大豆根充分浸泡在營養液中。培養至復葉展開時進行NaCl處理，根據預試驗結果，使用NaCl濃度為125 mmol/L。設置5個處理組：營養液+噴施清水（CK）、營養液+NaCl處理+噴施清水（A）、營養液+NaCl處理+噴施 5 mmol/L 海藻糖（B）、營養液+NaCl處理+噴施10 mmol/L海藻糖（C）、營養液+NaCl處理+噴施20 mmol/L海藻糖（D），每隔1 d噴施海藻糖1次。處理14 d后進行取樣。每個處理組設置3個重復。

1.3 測定指標及方法

培養14 d后取不同處理的大豆幼苗，用去離子水清洗后，用吸水紙擦干，自封袋分裝好后備用。用分析天平（BSA124S-CW，德國賽多利斯公司）測定大豆整株鮮重。用精度0.1 cm的直尺測量大豆幼苗的株高、根長，用葉面積測量儀（JC-AM-C，青島聚創環保集團有限公司）測定大豆葉片面積。將幼苗置于精密鼓風干燥箱（IBAO-150，上海施都凱儀器設備有限公司）中120 ℃殺青2 h，80 ℃烘干后測定大豆整株干重。

使用熒光定量PCR（RT-qPCR）方法，對參與大豆離子轉移類蛋白編碼基因GmSOS1和GmCLC1進行分析。在SoyBase（https：//www.soybase.org/sitemap.php）查詢基因序列，使用NCBI在線網站設計引物（表1），取NaCl處理后的大豆葉片，檢測大豆離子轉移類蛋白編碼基因GmsSOS1和GmCLC1的表達情況。提取大豆葉片RNA并反轉錄成cDNA，使用TB green premix Ex Taq染料（TaKaRa）及羅氏熒光定量PCR儀（LightCycler96，Roche，Shanghai）進行Real-time PCR反應。以GmActin為內參基因，反應程序：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40個循環，采用2^-ΔΔC_T方法測定GmsSOS1和GmCLC1基因的表達量。

各項生理生化指標測定：使用便攜式光合儀（LI-COR Inc.，Lincoln，USA）檢測大豆葉片凈光合速率、氣孔導度、胞間CO₂濃度和蒸騰速率；丙二醛（MDA）含量使用硫代巴比妥酸法測定；可溶性糖含量測定采用苯酚硫酸法；可溶性蛋白含量使用考馬斯亮藍染色法測定；超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍四唑光還原法測定；過氧化物酶（POD）活性測定使用愈創木酚法；過氧化氫酶（CAT）活性采用雙氧水法測定；抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性使用AsA比色法測定。

1.4 數據處理

使用Microsoft Excel 2021進行數據處理，用SPSS 25.0統計，Duncan’s新復極差法進行單因素方差分析（α=0.05），用Origin Lab進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫下離子轉移類蛋白編碼基因GmsSOS1和GmCLC1的表達情況

如圖1所示，在鹽脅迫下，噴施不同濃度的海藻糖明顯促進了GmsSOS1和GmCLC1基因的表達，其中C處理組的GmsSOS1和GmCLC1基因表達量較A處理組顯著提高（Plt;0.05）。結果表明，海藻糖能夠促進GmsSOS1和GmCLC1基因的表達，提高大豆轉移離子的能力，從而緩解鹽脅迫造成的影響。

2.2 不同濃度海藻糖對NaCl脅迫大豆幼苗表型的影響

如圖2所示，正常營養液中生長的大豆幼苗旺盛、莖葉繁茂、葉面積較大，而NaCl脅迫下的大豆幼苗生長明顯受到抑制，植株矮小，葉片較小。與A處理相比，隨著海藻糖濃度的升高，大豆幼苗受到的NaCl脅迫明顯緩解，但表型上仍弱于CK處理。

2.3 不同濃度海藻糖對鹽脅迫大豆幼苗生物量的影響

為了探究海藻糖對NaCl脅迫下大豆幼苗生長情況的影響，本研究測定了外源海藻糖對NaCl脅迫下中黃13幼苗的鮮重、干重、葉面積、株高以及根長生物量，結果如表2所示。與對照（CK）相比，NaCl脅迫處理（A）顯著降低了大豆幼苗的鮮重、干重、葉面積、株高以及根長（Plt;0.05）。其中，與CK處理相比，A處理下大豆幼苗鮮重、干重、葉面積、株高及根長分別減少了37.1%、33.3%、50.2%、25.3%和20.9%。

與A處理相比，外源海藻糖處理C處理顯著提高了NaCl脅迫下大豆幼苗的鮮重、干重、葉面積、株高以及根長，各項指標的增加幅度分別為22.7%、50.0%、86.8%、9.7%和23.0%。由此可見，NaCl脅迫明顯會抑制大豆幼苗的生物量，與NaCl脅迫相比較，外源海藻糖雖然能顯著增加NaCl脅迫下大豆幼苗的生物量積累（Plt;0.05），但仍然低于CK。

2.4 海藻糖對鹽脅迫大豆幼苗葉片MDA含量的影響

為了研究外源海藻糖對NaCl脅迫下大豆幼苗膜氧化損傷的影響，本研究測定了大豆幼苗葉片中MDA含量，結果如圖3所示。與CK相比較，A處理顯著增加了大豆幼苗葉片中MDA含量（Plt;0.05），增加了39.4%。由此可見，NaCl脅迫對大豆幼苗葉片造成的膜脂過氧化損傷更嚴重。

與A處理相比，外源海藻糖顯著降低了MDA的含量（Plt;0.05），且隨著海藻糖濃度的增加，B、C、D處理分別降低了15.1%、30.1%、23.5%。由此可見，外源海藻糖會降低NaCl脅迫下大豆幼苗葉片中的MDA含量。

2.5 海藻糖對鹽脅迫大豆幼苗光合參數的影響

為了探究外源海藻糖對NaCl脅迫下大豆幼苗光合作用的影響。本研究測定了外源海藻糖對NaCl脅迫下大豆幼苗的光合參數，結果如表3所示。與CK相比較，A處理的P_n、G_s、T_r和C_i分別減少了43.6%、38.4%、24.4%和31.5%。由此可見，NaCl脅迫會抑制大豆幼苗的光合作用。

與A處理相比，外源海藻糖C處理顯著提高了NaCl脅迫大豆葉片的P_n、G_s、T_r和C_i（Plt;0.05），P_n、G_s、T_r和C_i分別提高了69.3%、57.4%、21.5%和34.6%。由此可見，雖然外源海藻糖提高了NaCl脅迫下大豆幼苗的光合參數，但仍然顯著低于CK處理（Plt;0.05）。

2.6 海藻糖對鹽脅迫大豆幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

為了研究外源海藻糖對NaCl脅迫下大豆幼苗抗氧化酶的影響，本研究測定了外源海藻糖對NaCl脅迫下大豆幼苗中的SOD、POD、CAT和APX活性的影響，結果如圖4所示。與CK處理相比，NaCl脅迫提高了大豆幼苗葉片抗氧化酶活性，可能是大豆幼苗對NaCl脅迫的應激反應。隨著噴施海藻糖濃度的增加，大豆幼苗的抗氧化酶活性不斷增加，其中，與A處理組相比，C和D這2個處理組增加效果最為明顯，這表明，外源海藻糖可增加NaCl脅迫下大豆葉片中抗氧化酶活性，加速活性氧的清除，從而提高大豆幼苗的抗脅迫能力。

2.7 海藻糖對鹽脅迫大豆幼苗葉片滲透調節物質的影響

為了研究外源海藻糖對NaCl脅迫下大豆幼苗滲透調節物質的影響，本研究測定了大豆幼苗葉片中的可溶性蛋白和可溶性糖含量，結果如圖5所示。與CK相比較，A處理顯著增加了大豆幼苗葉片中可溶性蛋白含量（Plt;0.05），增加了16.9%。與A處理相比，外源海藻糖處理大豆葉片中可溶性蛋白含量增加了21.4%～28.4%。由此可見，外源海藻糖顯著增加大豆幼苗葉片中可溶性蛋白含量（Plt;0.05）。

如圖5所示，與CK相比，A處理組顯著降低了大豆葉片中可溶性糖含量（Plt;0.05），降低了14.2%。與A處理相比，外源海藻糖處理大豆葉片中可溶性糖含量增加。其中，C處理顯著（Plt;0.05）增加了17%。由此可見，適宜濃度外源海藻糖顯著增加大豆幼苗中可溶性糖含量（Plt;0.05）。

綜上，外源海藻糖提高了植株糖類化合物的儲備及可溶性蛋白含量，以抵抗鹽的脅迫，進而緩解鹽脅迫對植株造成的損傷。

3 討論

3.1 海藻糖對鹽脅迫大豆幼苗離子轉移類蛋白編碼基因和生物量的影響

海藻糖是由兩分子葡萄糖組成的非還原性糖，隨著對海藻糖研究的深入，關于外源添加海藻糖對提高作物生長和抗逆性的研究日益增多^［17-19］。有文獻報道，外源海藻糖（15 mg/L）能顯著緩解甘蔗在干旱條件下（30% PEG 6000）的生長^［9］。噴施 15 mmol/L 海藻糖可顯著提高水稻在高溫條件下穗分化期的每穗粒數、千粒重和結實率，從而提高籽粒產量^［20］。本研究中，外源噴施10 mmol/L海藻糖增加了NaCl脅迫下鮮重、干重、葉面積、株高以及根長生物量，表明外源海藻糖能夠緩解NaCl脅迫對大豆幼苗的生長抑制。

植株對鹽脅迫的應激反應是一個復雜的生物學而過程，其中主要的耐鹽機制分為4類：離子穩態平衡、滲透調節、活性氧平衡以及其他形態結構的適應^［21］。不同品種的大豆表現的耐鹽性能力和上述機制有關。其中，研究最多的是參與Na⁺轉運的蛋白編碼基因（GmsSOS1）和參與Cl^-轉運的蛋白編碼基因（GmCLC1）^［21-22］。植株通過陽離子/質子交換系統，將Na⁺排除體外或者液泡外，減少Na⁺在植株體內的積累。有研究發現，GmsSOS1可以降低Na⁺積累，增強抗氧化酶的活性，從而緩解鹽脅迫造成的損傷。GmCLC1在許多植物中被發現，將GmCLC1基因轉到煙草中，顯著提高了煙草的耐鹽能力，降低了植株葉片中Cl^-的積累，說明GmCLC1編碼的蛋白能夠提高增強植株的耐鹽性^［22］。

與低溫和干旱條件造成的脅迫不同，鹽脅迫對植物生長發育的抑制是長期存在的^［23-25］。植物的根系作為與鹽脅迫環境直接接觸的器官，最先受到滲透脅迫，從而抑制根系細胞對水分和營養物質的吸收^［10］。此外，鹽脅迫會對植物造成離子毒害，影響植物的光合作用，嚴重影響植物的生長發育，甚至會造成植物的死亡。有研究發現，豌豆幼苗在 35～140 mmol/L NaCl脅迫下，會造成植株株高和根長生長緩慢^［26］。50～200 mmol/L NaCl脅迫下，甜菜的葉面積、葉片及根系的鮮重和干重隨著NaCl濃度的增加而降低^［20］。本研究中，與對照相比，125 mmol/L NaCl脅迫顯著降低了大豆幼苗的鮮重、干重、葉面積、株高以及根長生物量（Plt;0.05）。結果表明，NaCl脅迫會抑制植株生長發育，造成大豆幼苗生物量的積累減少。

3.2 海藻糖對鹽脅迫大豆幼苗葉片MDA含量的影響

當植物遇到鹽脅迫時，鹽脅迫會造成植物產生滲透脅迫，大量的Na⁺和Cl^-會進入植株體內后引起離子毒害，會產生大量的ROS，從而導致膜脂過氧化，破壞膜結構的功能性和完整性，導致滲透物質增多，MDA含量升高^［27］。MDA含量可作為生物膜損傷嚴重程度的指標，反映生物體在逆境脅迫環境下受到損傷程度。本研究中，高濃度外源海藻糖顯著降低了鹽脅迫下大豆葉片中MDA的含量。結果表明，海藻糖緩解了鹽脅迫下大豆葉片中的損傷。

3.3 海藻糖對鹽脅迫大豆幼苗光合參數的影響

植物生長發育所需的能量和物質主要來源于光合作用。植物對光能的吸收和轉化效率降低，主要是由于鹽脅迫，造成葉片氣孔關閉，水分蒸騰量減少，二氧化碳吸收受阻，從而抑制植物生長。Shu等研究發現，鎘脅迫下玉米葉片的光合作用嚴重受到抑制，外源氯化血紅素可提高植株的光合速率，進而提高玉米對鎘脅迫的耐受性^［27］。低溫條件下，外源噴施40 mmol/L海藻糖，顯著提高了草莓的光合速率^［5］。本研究結果表明，隨著海藻糖濃度的升高，大豆幼苗的P_n、G_s、T_r和C_i總體升高，說明外源海藻糖有利于提高大豆幼苗的光合能力，增強大豆幼苗對鹽的耐受性。

3.4 海藻糖對鹽脅迫大豆幼苗葉片抗氧化酶系統及滲透調節物質的影響

當植物遇到逆境脅迫環境時，體內會產生大量ROS，引起一系列生化反應，SOD、POD、CAT和APX通過協同作用來提高植物的抗逆性，防止機體發生氧中毒。海藻糖因其特殊的結構（由兩分子葡萄糖通過α-糖苷鍵連接而成非還原性糖）對外界環境變化的感知不敏感，因此對植物而言，具有良好的抗逆效果^［9，27］。在植物遭遇逆境時，海藻糖會通過提高氧化能力和維持滲透壓平衡的方式來增強植物的抗逆能力^［9］。

抗氧化酶是植物十分重要的酶，對于清除植物體內的活性氧等有害物質具有重要意義。有研究發現，外源海藻糖通過提高NaCl脅迫下黑果腺肋花楸幼苗生長SOD、POD和CAT活性，增加滲透調節物質（可溶性蛋白、可溶性糖）含量，增強黑果腺肋花楸幼苗抵抗鹽的脅迫能力^［28］。何丹研究發現，噴施海藻糖可提高高溫脅迫下小麥幼苗的耐熱性^［3］。本研究中，外源海藻糖增強了NaCl脅迫下大豆幼苗葉片中的SOD、POD活性^［3］。結果表明，外源海藻糖可以通過增強抗氧化酶活性、增加滲透調節物質來維持NaCl脅迫造成的大豆幼苗葉片中的氧化還原平衡。

可溶性蛋白、可溶性糖是2種重要的滲透調節物質。研究發現，外源噴施海藻糖會明顯提高鹽脅迫下水稻中的滲透調節物質含量^［6］。本研究發現，外源海藻糖會提高NaCl脅迫下大豆幼苗中可溶性蛋白、可溶性糖的含量。這表明，海藻糖通過提高植物體內可溶性蛋白、可溶性糖的含量來維持植物的滲透平衡，從而提高植物對鹽的耐受性。

4 結論

施用外源物質是緩解植株受到非生物脅迫最常用、簡單和高效的一種方法，已經報道的有CaCl₂^［29］、乙烯^［30］、褪黑素^［20］、水楊酸^［14］、海藻糖^［31］等物質，均能夠提高植物對鹽脅迫的抗性。鹽脅迫下，海藻糖在一定程度上可以提高大豆幼苗離子轉移基因的表達、抗氧化酶的活性、滲透調節物質含量，同時，降低MDA含量，促進大豆幼苗生長，起到緩解鹽脅迫對大豆幼苗的損傷作用。

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