青稞F1真假雜種SSR標(biāo)記鑒定

摘 要：屬大麥變種之一的青稞是西藏特有的地區(qū)優(yōu)勢(shì)作物，是重要的糧食來源和飼料來源。獲得真雜種是青稞雜交育種和其他遺傳研究的重要基礎(chǔ)。為建立青稞雜種鑒定的可靠方法和探明青稞種質(zhì)資源遺傳的多樣性，試驗(yàn)從30對(duì)SSR分子標(biāo)記中篩選，得到4對(duì)條帶清晰、差異明顯、多態(tài)性好的引物，后利用4對(duì)引物對(duì)10個(gè)雜交組合后代進(jìn)行真假雜種鑒定。結(jié)果表明，引物Qingke5H225、Qingke2H050和Qingke2H053可對(duì)Vada×L94、Vada×YS213、L94×ZQ13、L94×ZQ3000、YS213×ZQ3000、YS213×ZQ13、YS133×YS213雜交組合的后代進(jìn)行真假雜種鑒別，共有9個(gè)雜交組合獲得真雜種，與形態(tài)學(xué)田間鑒定結(jié)果一致。這表明SSR分子標(biāo)記適用于鑒定青稞的真假雜種，且所需時(shí)間短、效率高，可為后續(xù)青稞育種工作奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：青稞；SSR分子標(biāo)記；引物；真假雜種

中圖分類號(hào)：S512.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B 文章編號(hào)：1674-7909（2024）18-88-4

DOI：10.19345/j.cnki.1674-7909.2024.18.020

0 引言

大麥（Hordeum vulgare L.）為禾本科大麥屬一年生草本植物，是世界第四大禾谷類作物，其總產(chǎn)量和種植面積僅次于小麥、水稻和玉米［1］，已在世界范圍內(nèi)種植數(shù)千年［2］。大麥因含有豐富的膳食纖維、β-葡聚糖等成分，可作為飼料、糧食和啤酒工業(yè)原料等，受到了人們的廣泛關(guān)注［3］。同時(shí)，大麥也是具有遺傳研究模式的作物，因?yàn)槠涫嵌扼w遺傳、存在大量的遺傳多態(tài)性、有相對(duì)較少的染色體數(shù)目（2n=14）及高度自花傳粉的作物。根據(jù)種子是否有稃，大麥可分為有稃型皮大麥和無稃型裸大麥［4］；相較于有稃型皮大麥，裸大麥籽粒的內(nèi)外稃和穎果容易分離［5］。裸大麥也被稱作青稞，屬大麥變種之一，是青藏高原及其周邊地區(qū)唯一大規(guī)模種植的糧食作物，也是重要的飼料來源。青稞已成為國(guó)內(nèi)約50%藏族人民喜愛的食物，以青稞為原料加工生產(chǎn)的青稞酒、青稞茶和其他產(chǎn)品［6］，也是廣受歡迎的綠色健康食品。除青藏高原外，在南非熱帶的干旱草原及曬鹽池到歐洲的北寒溫帶，都有青稞的蹤跡。我國(guó)西藏自治區(qū)、四川省甘孜藏族自治州、青海省、云南省及甘肅省甘南藏族自治州，都是以種植青稞為主。

目前，青稞育種主要采用傳統(tǒng)育種、單倍體育種和分子標(biāo)記輔助相結(jié)合的方法，以增加青稞的產(chǎn)量，提高青稞對(duì)多種病害的抗性。雜交育種是選育新品種的重要手段，對(duì)不同遺傳背景的親本進(jìn)行雜交，可以獲得具有雙親優(yōu)良性狀的后代。在青稞育種研究中，雜交育種被廣泛應(yīng)用于提高產(chǎn)量、增強(qiáng)抗逆性、改善品質(zhì)等方面。青稞作為一種自花授粉植物，在其雜交育種過程中，確保雜交后代的真實(shí)性是至關(guān)重要的一步。由于自花授粉的特性，以及人工去雄過程中可能存在的不徹底問題，后代往往會(huì)出現(xiàn)真雜種與假雜種混雜的情況。這不僅影響了育種效率，還可能對(duì)后續(xù)的遺傳改良和研究造成誤導(dǎo)。因此，有必要鑒定雜交后代的真實(shí)性。

分子標(biāo)記具有選擇中性、不受環(huán)境影響和數(shù)量龐大等特性，被廣泛用于大麥［7-10］、玉米［11］、小麥［12］和水稻［13］等農(nóng)作物的遺傳差異研究。在各種分子標(biāo)記中，簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSR）標(biāo)記具有多態(tài)性高、數(shù)量豐富和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)［7-10］，SSR是核苷酸序列的串聯(lián)排列，其中包含1～6個(gè)堿基。每個(gè)SSR位點(diǎn)上不同等位基因的重復(fù)單位數(shù)量具有高度的特異性，重復(fù)單位的序列不一定完全相同。微衛(wèi)星多態(tài)性分析法是利用基因組中存在的大量微衛(wèi)星序列，根據(jù)同一物種中微衛(wèi)星序列兩側(cè)的高度序列設(shè)計(jì)引物，通過PCR擴(kuò)增特異性，擴(kuò)增基因組DNA中的微衛(wèi)星序列；然后通過凝膠電泳測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物，觀察比較擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度變化，達(dá)到基因組DNA之間多態(tài)性分析的目的，可準(zhǔn)確快速識(shí)別F1代的雜交種。在該試驗(yàn)中，通過田間形態(tài)和SSR分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合的方法從10個(gè)青稞雜交組合中鑒定真假雜交種。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試親本材料于2023年種植在西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院3號(hào)試驗(yàn)田，2023年6—7月通過人工去雄的方法設(shè)置了多個(gè)雜交組合。同年11月獲得的種子種植于溫室內(nèi)，出苗后選取嫩葉，-80 ℃冰箱保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取

采用改良CTAB法提取DNA［14-15］。①將水浴鍋預(yù)熱至65 ℃。②將0.2 g嫩葉置于2.0 mL離心管內(nèi)，并放入研磨機(jī)研磨2 min。③在研磨好的葉片上加入CTAB提取緩沖液，在65 ℃水浴中每10 min輕微振蕩1次離心管，共3次，使其與緩沖液充分接觸。④加入 0.6 mL氯仿和異戊醇的混合液（氯仿與異戊醇體積比為24∶1），振蕩混勻30 min。⑤在12 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，取其上清液，加入0.6 mL冰異丙醇，輕輕搖晃2 min，靜置30 min，-4 ℃冰箱保存。再在12 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min后，棄上清液，加1 mL 70%乙醇洗滌沉淀2次，12 000 r/min離心10 min，保留沉淀。⑥確保離心管干燥，加入無菌水0.2 mL，后水浴加熱2 min，DNA保存在-20 ℃條件下。

1.2.2 PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系（10 μL）：上下游引物各0.5 μL，DNA模板2 μL，2×Master Mix 5 μL，dd H2O 2 μL。

PCR擴(kuò)增程序：預(yù)變性反應(yīng)5 min，變性反應(yīng)95 ℃、30 s，退火60 ℃、30 s，延伸72 ℃、1 min，再延伸72 ℃、10 min，最后4 ℃循環(huán)保存。PCR產(chǎn)物用0.8%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，用硝酸銀染色，用甲醛顯色后拍照存檔。

1.2.3 篩選SSR標(biāo)記

利用實(shí)驗(yàn)室30對(duì)SSR引物標(biāo)記對(duì)雜交組合的親本進(jìn)行初篩，篩選出差異明顯、條帶清晰及多態(tài)性好的引物。

1.2.4 鑒定雜種

利用篩選出的SSR引物，對(duì)所有雜交后代進(jìn)行鑒定，具有2種親本條帶的雜交種是真正的雜交種。

1.2.5 田間形態(tài)鑒定

在雜交后代的苗期和成株期進(jìn)行田間性狀及形態(tài)調(diào)查，記錄取樣編號(hào)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記篩選父母本多態(tài)性結(jié)果

通過30對(duì)SSR引物篩選分析10個(gè)雜交組合8個(gè)親本材料的多態(tài)性（如圖1），分析得到了4對(duì)差異明顯的引物（Qingke2H050、Qingke2H053、Qingke5H225、Qingke3H310），具體見表1，以鑒定雜交種。

2.2 雜種的分子鑒定

篩選出差異明顯的4對(duì)引物，并用至少2對(duì)引物進(jìn)行反復(fù)驗(yàn)證，檢測(cè)每個(gè)雜交組合的植株，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。雜交種鑒定結(jié)果見表2。在10個(gè)雜交組合中，沒有獲得真雜種的雜交組合占10%，獲得真雜種的雜交組合占90%，其中Vada×L94、Vada×YS213等7個(gè)組合雜交的成功率為100.0%。判斷其是否為真雜種或假雜種，是根據(jù)植株所呈現(xiàn)出的擴(kuò)增條帶來判斷的。真正的雜交種應(yīng)是共顯性的，有來自雙親的擴(kuò)增條帶（如圖2），通常假雜種只有來自母本的擴(kuò)增條帶（即無父本的條帶），這樣的假雜種需要進(jìn)一步觀察。

2.3 田間形態(tài)學(xué)鑒定

雜交后代在出苗期和成株期的形態(tài)介于雙親形態(tài)之間，這種種間形態(tài)差異較大的雜交組合通過形態(tài)觀察很容易判斷真假雜交種。例如，雜交組合YS213與ZQ13的雜種后代形態(tài)與父本一致，為真雜種；雜交組合ZY865與YS213的雜種后代形態(tài)與母本一致，為假雜種。可以從株型、株高、棱葉片姿勢(shì)等形態(tài)差異來進(jìn)行區(qū)分。但是若雜交后代種間形態(tài)差異較小，則很難通過形態(tài)觀察來鑒別真假雜種，可以利用分子標(biāo)記技術(shù)來鑒定親本間形態(tài)差異較小的雜交組合后代。

3 結(jié)論和討論

雜交育種是培育青稞新品種的重要途徑。真雜種和去雄不完全或閉花受精造成的假雜種需要通過雜種真實(shí)性鑒定來區(qū)分，因?yàn)槿斯とバ鄄粡氐谆蛟陔s交過程中受外來花粉的污染，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生一定比例的自交后代。形態(tài)分析是鑒定雜交種最簡(jiǎn)單、最直接的方法。一般情況下，株型、株高、葉片姿勢(shì)、穗姿勢(shì)等形態(tài)差異可以作為青稞田間形態(tài)鑒定的依據(jù)，但這些方法需要比較親本與子代之間的差異，周期長(zhǎng)，不能快速大量判斷雜交后代的雜種真實(shí)性，可能會(huì)受到環(huán)境條件等外部因素的影響，導(dǎo)致結(jié)果產(chǎn)生誤差。因此，可以使用SSR分子標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證。試驗(yàn)在形態(tài)對(duì)比的基礎(chǔ)上，從遺傳學(xué)角度利用分子技術(shù)對(duì)青稞雜交組合后代中的真假雜種進(jìn)行鑒定，不會(huì)受環(huán)境的影響，準(zhǔn)確度更高，數(shù)據(jù)更加真實(shí)。SSR分子標(biāo)記具有共顯性，可區(qū)分雜合基因和純合基因位點(diǎn)，重復(fù)性和穩(wěn)定性好，技術(shù)簡(jiǎn)單，只需要使用1對(duì)SSR引物就能準(zhǔn)確鑒定雜交后代［16-18］。

分子標(biāo)記輔助育種是當(dāng)前青稞育種的主要趨勢(shì)。分子標(biāo)記輔助育種主要包括鑒定雜交組合后代的真假雜交種、鑒定作物種質(zhì)資源、構(gòu)建遺傳圖譜、研究作物的遺傳多樣性及定位目的基因。在作物從野生種轉(zhuǎn)變?yōu)樵缙隈Z化的遺傳資源，再轉(zhuǎn)變?yōu)楝F(xiàn)代栽培種的過程中［19］，其遺傳變異性大大降低，導(dǎo)致遺傳基礎(chǔ)單一化、許多潛在有用的基因丟失［20］。栽培種、野生大麥及原始地方品種都具有豐富的遺傳變異性，可以作為作物遺傳改良的種質(zhì)資源［21］。利用常規(guī)雜交、回交育種及分子標(biāo)記等手段，可將目標(biāo)基因或基因組片段引入現(xiàn)代育種材料中，選育出更多抗病、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的品種［22］。

試驗(yàn)對(duì)多個(gè)青稞雜交后代進(jìn)行全生育期形態(tài)學(xué)鑒定與SSR分子標(biāo)記鑒定，將形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果與SSR分子標(biāo)記鑒定結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)兩者在鑒定青稞真假雜種的結(jié)果上具有高度的一致性。這表明SSR分子標(biāo)記技術(shù)能夠用于青稞真假雜種的鑒定，這2種方法相互印證，提高了鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

4 結(jié)束語

綜上所述，真假雜種的鑒定是青稞育種的重要環(huán)節(jié)，利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)鑒定青稞雜種比傳統(tǒng)鑒定方法更具優(yōu)勢(shì)，對(duì)加快青稞品種選育具有重要作用。

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作者簡(jiǎn)介：尤佳潔（1998—），女，碩士生，研究方向：青稞栽培與育種。

通信作者：卓嘎（1971—），女，本科，副教授，研究方向：青稞高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培。