基于生物信息學分析潰瘍性結腸炎DNA甲基化標志物

[摘要]"目的"基于生物信息學方法分析潰瘍性結腸炎（ulcerative"colitis，UC）的DNA甲基化生物標志物。方法"采用基因表達綜合數據庫（Gene"Expression"Omnibus，GEO）的芯片數據GSE81211、GSE75214、GSE87466分析UC的差異甲基化位點和差異表達基因，得到異常甲基化修飾的差異表達基因，并進行富集分析和蛋白質互作網絡（protein-protein"interaction，PPI）分析。使用譜芯片GSE36807驗證核心基因的表達水平并繪制受試者操作特征曲線驗證核心基因診斷效能。結果"共篩選出42個高甲基化修飾低表達基因，53個低甲基化修飾高表達基因。功能富集分析顯示主要與先天免疫反應、T細胞受體信號通路、上調細胞外信號調節激酶（extracellular"regulated"kinase，ERK）1和ERK2級聯反應相關。基因富集的信號通路為細胞黏附分子和代謝途徑。結論"7個異常甲基化修飾差異表達基因SELL、SLAMF1、FCGR2A、CD86、CTLA4、CCR7、PTPRC可能是UC的潛在生物標志物及治療靶點。

[關鍵詞]"潰瘍性結腸炎；生物信息學；DNA甲基化；表觀遺傳學

[中圖分類號]"R574.6""""""[文獻標識碼]"A""""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2024.35.009

Bioinformatics-based"analysis"of"DNA"methylation"markers"in"ulcerative"colitis

HAI"Shuangshuang1，"LIU"Yihong1，"ZHAO"Haibo1，"YU"Ruimiao2

1.Department"of"Gastroenterology，"the"First"Hospital"of"China"Medical"University，"Shenyang"110000，"Liaoning，"China;"2.Department"of"Gastroenterology，"Chifeng"Hospital，"Chifeng"024000，"Inner"Mongolia，"China

[Abstract]"Objective"To"analyze"DNA"methylation"biomarkers"of"ulcerative"colitis"（UC）"based"on"bioinformatics"methods."Methods"Chip"data"from"Gene"Expression"Omnibus"（GEO），"specifically"GSE81211，"GSE75214，"and"GSE87466，"were"used"to"analyze"differentially"methylated"sites"and"differentially"expressed"genes"in"UC."This"led"to"the"identification"of"differentially"expressed"genes"with"abnormal"methylation"modifications."These"genes"were"then"subjected"to"enrichment"analysis"and"protein-protein"interaction"（PPI）"network"analysis."The"expression"levels"of"core"genes"were"validated"using"the"spectral"chip"GSE36807，"and"diagnostic"efficacy"of"these"core"genes"was"verified"by"plotting"receiver"operating"characteristic"curves."Results"A"total"of"42"genes"with"high"methylation"modifications"and"low"expression，"and"53"genes"with"low"methylation"modifications"and"high"expression"were"identified."Functional"enrichment"analysis"showed"that"these"genes"were"mainly"associated"with"innate"immune"responses，"T"cell"receptor"signaling"pathways，"and"upregulation"of"extracelluar"regulated"kinase"（ERK1）"and"ERK2"cascade"reactions."The"enriched"signaling"pathways"of"these"genes"involved"cell"adhesion"molecules"and"metabolic"pathways."Conclusion"Seven"differentially"expressed"genes"with"abnormal"methylation"modifications"SELL，"SLAMF1，"FCGR2A，"CD86，"CTLA4，"CCR7，"and"PTPRC"may"serve"as"potential"biomarkers"and"therapeutic"targets"for"UC.

[Key"words]"Ulcerative"colitis;"Bioinformatics;"DNA"methylation;"Epigenetics

潰瘍性結腸炎（ulcerative"colitis，UC）是一種慢性復發性炎癥性腸道疾病，與克羅恩病（Crohn’s"disease，CD）統稱為炎癥性腸病（inflammatory"bowel"disease，IBD），遺傳因素、環境因素、腸道微生物群和免疫系統均參與UC的病理生理過程[1]。UC的診斷基于非特異性癥狀、內窺鏡檢查和組織學特征相結合，有時很難與其他疾病區分。盡管有幾種藥物可用于治療UC，但高達15%的患者對藥物治療無反應，且容易產生并發癥。因此，迫切需要更好地了解UC的發病機制，尋找更有效的治療方法[2]。越來越多的研究表明，DNA甲基化、非編碼RNA表達和組蛋白修飾的異常表觀遺傳學改變對IBD的發生、發展發揮重要作用[2–4]。

表觀遺傳學指在不改變遺傳信息的情況下調控基因表達的機制，包括多種調控方式，是基因型、環境和疾病之間的重要聯系。由于表觀遺傳學具有遺傳性、可逆性和動態性，更有利于調節寄主的發育、分化和功能。表觀遺傳學參與許多生理功能，如維持腸道上皮的穩態，調節免疫細胞和免疫系統等[3]。在IBD的表觀遺傳學研究中，DNA甲基化是研究最多的方向之一[4]。本研究采用DNA甲基化芯片和表達譜芯片數據集聯合分析DNA甲基化在UC發病機制中的可能作用，探索異常甲基化基因與疾病病理之間的可能聯系，尋找臨床診斷和治療的潛在靶點。

1""資料與方法

1.1""數據來源

從基因表達綜合數據庫（Gene"expression"omnibus，GEO）中下載UC的表達譜芯片GSE75214、GSE87466數據集，驗證集GSE36807數據集，DNA甲基化芯片GSE81211數據集。所有數據均來自腸道組織。

1.2""差異表達基因篩選

使用R語言中的limma包篩選GSE75214"和GSE87466數據集中的差異表達基因（differentially"expressed"gene，DEGs），篩選條件為|log2FC（差異倍數）|gt;1，調整P（P"adj）lt;0.05，繪制火山圖。使用CHAMP包對GSE81211數據集進行差異甲基化位點（DNA-methylation"profiles，DMP）分析，篩選條件|delta"beta值|gt;0.2和Padjlt;0.05，得到與健康對照相比下UC腸組織的DMP和異常甲基化基因，繪制火山圖和熱圖。將表達上調基因與低甲基化基因通過Venny軟件取交集得到低甲基化修飾下高表達基因；將表達下調基因與高甲基化基因使用Venny軟件取交集得到高甲基化修飾下低表達基因，繪制韋恩圖。

1.3""DEGs功能富集分析

使用R語言ClusterProfiler包對異常甲基化修飾DEGs進行京都基因和基因組百科全書（Kyoto"Encyclopedia"of"Genes"and"Genomes，KEGG）和基因本體（gene"ontology，GO）分析，使用org.Hs.eg.db、ggplot2包對富集分析結果進行可視化。

1.4""蛋白質互作網絡和子模塊構建

將獲取的異常甲基化修飾DEGs輸入STRING數據庫進行蛋白質互作網絡（protein-protein"interaction，PPI）分析，以最小互作評分gt;0.4分為篩選條件，下載相關數據，利用Cytoscape"3.9.1軟件進行分析并可視化，使用MCODE進行模塊劃分，篩選條件設置為MCODEgt;18、Node截斷值=0.2、Degree"截斷值=2、K值=2、最大深度=100，得到高度連通區域的子網。將MCODE子網絡基因與CytoHubba中的MCC算法的前10個基因取交集得到核心基因。

1.5""驗證核心基因的表達

驗證核心基因在GSE36807數據集中的表達水平，使用GEO在線工具GEO2R查找DEGs在腸組織中的表達量。繪制受試者操作特征（receiver"operating"characteristic，ROC）曲線驗證核心基因診斷效能。

1.6""統計學方法

采用SPSS"22.0統計學軟件對數據進行處理分析，計量資料以均數±標準差（"）表示，組間比較采用t檢驗，計數資料以例數（百分率）[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗。Plt;0.05為差異有統計學意義。將異常甲基化修飾DEGs輸入STRING在線網站，下載相關數據，導入Cytoscape軟件，繪制PPI網絡圖。

2""結果

2.1""異常甲基化DEGs篩選結果

差異基因分析流程見圖1。UC表達譜芯片GSE75214、GSE87466差異基因火山圖及DNA甲基化芯片GSE81211數據集差異甲基化位點見圖2。低甲基化修飾表達上調基因，低甲基化高表達基因53個，高甲基化低表達基因42個。

2.2""異常甲基化修飾DEGs富集分析結果

對95個異常甲基化修飾DEGs富集分析，GO分析結果顯示，異常甲基化修飾DEGs多富集在信號轉導、先天免疫反應、T細胞受體信號通路、上調細胞外信號調節激酶（extracellular"regulated"kinase，ERK）1和ERK2級聯、細胞表面受體信號通路等生物學過程中，見圖3。KEGG分析顯示基因富集的信號通路為細胞黏附分子、代謝途徑和酒精性肝臟疾病，通路間的共同基因見圖4。

2.3""異常甲基化修飾DEGs的PPI及核心基因分析

MCODE子網絡包含13個節點、138條邊，MCODE值為11.5。將10個分數最高的基因與MCODE子網絡基因取交集得到8個核心基因，分別為蛋白酪氨酸

磷酸酶受體C型（protein"tyrosine"phosphatase"receptor"type"C，PTPRC）、CD69、CD86、L-選擇素（selectin"L，SELL）、Fc伽馬受體Ⅱa"（Fc"gamma"receptor"Ⅱa，FCGR2A）、細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4（cytotoxic"T-lymphocyte"associated"protein"4，CTLA4）、C-C趨化因子受體7（C-C"motif"chemokine"receptor"7，CCR7）、信號淋巴細胞激活分子家族成員1"（signaling"lymphocytic"activation"molecule"family"member"1，SLAMF1）。8個核心基因均為低甲基化修飾基因。

2.4""驗證核心基因的表達水平及診斷效能

使用GSE36807數據集驗證8個核心基因的表達水平，7個低甲基化修飾基因在UC患者腸組織中的表達水平均高于健康對照組，差異有統計學意義（Plt;0.05），而CD69在UC患者和健康對照者的腸組織中差異無統計學意義（Pgt;0.05）。繪制ROC曲線驗證核心基因的診斷效能，曲線下面積（area"under"the"curve，AUC）為0.845～0.976，7個核心基因診斷效能較好，見圖5。

3""討論

研究表明DNA甲基化在診斷IBD中發揮重要作用，具有較高的敏感度及特異性[5]。來自腸組織的DNA甲基化標志物能較準確地區分CD和UC[6]。在兒童IBD患者的腸組織中發現特異性的DNA甲基化修飾，疾病診斷的特異性和敏感度均非常高[7]。這表明發掘IBD的特異性DNA甲基化模式具有重要的臨床意義。

本研究聯合多個芯片數據進行分析，篩選出95個具有異常甲基化修飾位點的差異表達基因，并進行PPI、GO和KEGG富集分析。異常甲基化修飾的差異表達基因多富集在信號轉導、先天免疫反應、T細胞受體信號通路、上調ERK1和ERK2級聯、細胞表面受體信號通路等生物學過程和細胞黏附分子、代謝途徑等信號通路，與之前其他UC相關的研究結果一致[8]。IBD患者的腸道先天性和適應性免疫增強，先天免疫細胞響應微生物和受損組織的信號，產生炎癥細胞因子和刺激適應性免疫系統T細胞和B細胞因子，炎癥T細胞及其促炎相關細胞因子在腸組織中的積累[9]。細胞黏附分子是細胞表面的蛋白質，負責細胞與細胞、細胞與細胞外基質之間的相互作用，參與細胞生長分化、伸展和移動、激活與信號轉導、炎癥等重要病理生理過程，如T細胞通過表達黏附分子黏附在內皮細胞上，破壞T細胞和血管內皮之間的相互作用從而阻斷T細胞浸潤治療UC[10]。因此，通過內皮細胞中黏附分子的表達來破壞免疫細胞浸潤可能是治療UC的有效策略[11]。ERK1和ERK2是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于絲裂原活化蛋白激酶家族成員，參與胞內外信號轉導，調節細胞增殖分化、蛋白質磷酸化等。UC患者炎性結腸黏膜組織可見ERK1、ERK2活化增強。在動物實驗中抑制中性粒細胞ERK1、ERK2磷酸化可改善腸道炎癥，表明ERK1、ERK2可能與UC的發病機制及疾病進展相關[12]。

本研究最終篩選出SELL、SLAMF1、FCGR2A、CD86、CTLA4、CCR7、PTPRC"7個有異常甲基化修飾位點的差異表達基因可能與UC密切相關。SELL是一種I型跨膜糖蛋白和細胞黏附分子，在大多數循環白細胞中表達，參與白細胞運輸的調節，介導許多白細胞-內皮相互作用。SELL在UC中的研究較少，在正常和病理條件下，淋巴細胞遷移到胃腸黏膜形成腸道相關淋巴組織是由MAdCAM-1介導的，這種淋巴細胞歸巢系統參與慢性炎癥性胃腸道疾病的發病機制[13]。MAdCAM-1的表達與內鏡下UC嚴重程度相關，與黏膜炎癥和隨后的復發有關，可作為UC復發和治療效果的標志物[14]。SLAMF1調節多種免疫細胞的激活和分化，因此參與先天性和適應性免疫反應的調節和互聯。有報道稱SLAMF1在診斷為UC的前幾年上調，高度預測UC的診斷，能夠表征UC的臨床前全身炎癥[15]。FCGR2A是UC的易感基因，全基因組關聯研究分析結果顯示FCGR2A變體可改變其編碼的抗體受體FCGR2A對IgG的結合親和力[16]。在UC患者的結腸黏膜中，FCGR2A調控IgG免疫復合物，誘導NLRP3和反應性氧依賴性的白細胞介素-1β和中性粒細胞募集趨化因子的產生[17]。CD86是一種在抗原呈遞細胞上表達的分子，提供T細胞活化和生存所需的共刺激信號，阻斷CD86可有效抑制T細胞應答，在啟動免疫應答中發揮重要作用。抑制樹突狀細胞（dendritic"cell，DC）表面抗原呈遞細胞-Ⅱ和CD86表達，能夠恢復結腸炎小鼠模型中TH17/Treg比值，改善小鼠UC[18]。CTLA4是T細胞上的一種跨膜受體，目前在腫瘤治療中作為免疫檢查點的研究非常豐富。CTLA4被認為與許多自身免疫性疾病相關，表達水平與免疫細胞浸潤呈正相關，具有基因多態性，可增加UC風險[19]。CCR7被報道為新的UC易感識別位點，可能參與白細胞的快速募集和不恰當的保留導致腸道慢性炎癥。使用布拉酵母菌可顯著降低表達CCR7的IBD"骨髓DC，抑制T細胞共刺激和炎癥相關遷移和DC動員，促進上皮恢復[20]。PTPRC可調節調節T細胞和巨噬細胞之間的相互作用，增加促炎細胞因子產生，在先天免疫系統中起著至關重要的作用。此外，PTPRC被鑒定為肝腎纖維化疾病中表達改變的潛在重要基因，并可能參與IBD纖維化途徑的早期激活或纖維化和炎癥的重疊[21]。這7個異常甲基化修飾的差異表達基因參與調節免疫反應，可能在UC的發病機制中起作用，AUC為0.845～0.976，具有良好診斷效能，或能作為診斷UC的生物標志物。

本研究存在一定的不足。本研究使用的樣本量較小，未進行相關實驗驗證。綜上，本研究基于生物信息學進行聯合分析，篩選出7個異常DNA甲基化修飾的核心基因，分析了可能影響UC發生、發展的信號通路，為研究UC的DNA甲基化生物標志物及發病機制提供選擇。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

[參考文獻]

[1] SU"H，"CHIU"Y，"CHIU"C，"et"al."Inflammatory"bowel"disease"and"its"treatment"in"2018："Global"and"Taiwanese"status"updates[J]."Formos"Med"Assoc，"2019，"118（7）："1083–1092.

[2] KAPLAN"G."The"global"burden"of"IBD："From"2015"to"2025[J]."Nat"Rev"Gastroenterol"Hepatol，"2015，"12（12）："720–727.

[3] VENTHAM"N，"KENNEDY"N，"NIMMO"E，"et"al."Beyond"gene"discovery"in"inflammatory"bowel"disease："The"emerging"role"of"epigenetics[J]."Gastroenterology，"2013，"145（2）："293–308.

[4] NOBLE"A，"NOWAK"J，"ADAMS"A，"et"al."Defining"interactions"between"the"genome，"epigenome，"and"the"environment"in"inflammatory"bowel"disease："Progress"and"prospects[J]."Gastroenterology，"2023，"165（1）："44–60.

[5] MCDERMOTT"E，"RYAN"E，"TOSETTO"M，"et"al."Dna"methylation"profilingnbsp;in"inflammatory"bowel"disease"provides"new"insights"into"disease"pathogenesis[J]."Crohns"Colitis，"2016，"10（1）："77–86.

[6] TAHARA"T，"HIRATA"I，"NAKANO"N，"et"al."Comprehensive"DNA"methylation"profiling"of"inflammatory"mucosa"in"ulcerative"colitis[J]."Inflamm"Bowel"Dis，"2017，"23（1）："165–173.

[7] HOWELL"K，"KRAICZY"J，"NAYAK"K，"et"al."DNA"methylation"and"transcription"patterns"in"intestinal"epithelial"cells"from"pediatric"patients"with"inflammatory"bowel"diseases"differentiate"disease"subtypes"and"associate"with"outcome[J]."Gastroenterology，"2018，"154（3）："585–598.

[8] XAVIER"R，"PODOLSKY"D."Unravelling"the"pathogenesis"of"inflammatory"bowel"disease[J]."Nature，"2007，"448（7152）："427–434.

[9] GEREMIA"A，"BIANCHERI"P，"ALLAN"P，"et"al."Innate"and"adaptive"immunity"in"inflammatory"bowel"disease[J]."Autoimmun"Rev，"2014，"13（1）："3–10.

[10] WEST"N，"HEGAZY"A，"OWENS"B，"et"al."Oncostatin"M"drives"intestinal"inflammation"and"predicts"response"to"tumor"necrosis"factor-neutralizing"therapy"in"patients"with"inflammatory"bowel"disease[J]."Nat"Med，"2017，"23（5）："579–589.

[11] VERSTOCKT"B，"VETRANO"S，"SALAS"A，"et"al."Sphingosine"1-phosphate"modulation"and"immune"cell"trafficking"in"inflammatory"bowel"disease[J]."Nat"Rev"Gastroenterol"Hepatol，"2022，"19（6）："351–366.

[12] SAHA"K，"SUBRAMENIUM"GANAPATHY"A."Autophagy"reduces"the"degradation"and"promotes"membrane"localization"of"occludin"to"enhance"the"intestinal"epithelial"tight"junction"barrier"against"paracellular"macromolecule"flux[J]."Crohns"Colitis，"2023，"17（3）："433–449.

[13] DEKRIJGER"M，"WILDENBERG"M，"MOOKHOEK"A，"et"al."Expression"of"MAdCAM-1"and"gut-homing"T"cells"in"inflamed"pouch"mucosa[J]."Crohns"Colitis，"2021，"15（9）："1491–1499.

[14] UCHIYAMA"K，"TAKAGI"T，"MIZUSHIMA"K，"et"al."Mucosal"addressin"cell"adhesion"molecule"1"expression"reflects"mucosal"inflammation"and"subsequent"relapse"in"patients"with"ulcerative"colitis[J]."Crohns"Colitis，"2023，"17（5）："786–794.

[15] BERGEMALM"D，"ANDERSSON"E，"HULTDIN"J，"et"al."Systemic"inflammation"in"preclinical"ulcerative"colitis[J]."Gastroenterology，"2021，"161（5）："1526–1539.

[16] MCGOVERN"D，"GARDET"A，"T?RKVIST"L，"et"al."Genome-wide"association"identifies"multiple"ulcerative"colitis"susceptibility"loci[J]."Nat"Genet，"2010，"42（4）："332–337.

[17] CASTRO"T，"DENNISON"T，"FERDINAND"J，"et"al."Anti-commensal"IgG"drives"intestinal"inflammation"and"type"17"immunity"in"ulcerative"colitis[J]."Immunity，"2019，"50（4）："1099–1114.

[18] ZHENG"K，"JIA"J，"YAN"S，"et"al."Paeoniflorin"ameliorates"ulcerative"colitis"by"modulating"the"dendritic"cell-"mediated"TH17/Treg"balance[J]."Inflammopharmacology，"2020，"28（6）："1705–1716.

[19] SASSON"S，"SLEVIN"S，"CHEUNG"V，"et"al."Interferon-"gamma-producing"CD8+"tissue"resident"memory"T"cells"are"a"targetable"hallmark"of"immune"checkpoint"inhibitor-nbsp;colitis[J]."Gastroenterology，"2021，"161（4）："1229–1244.

[20] THOMAS"S，"METZKE"D，"SCHMITZ"J，"et"al."Anti-"inflammatory"effects"of"saccharomyces"boulardii"mediated"by"myeloid"dendritic"cells"from"patients"with"Crohn’s"disease"and"ulcerative"colitis[J]."Am"J"Physiol"Gastrointest"Liver"Physiol，"2011，"301（6）："1083–1092.

[21] JERALA"M，"HAUPTMAN"N，"KOJC"N，"et"al."Expression"of"fibrosis-related"genes"in"liver"and"kidney"fibrosis"in"comparison"to"inflammatory"bowel"diseases[J]."Cells，"2022，"11（3）："314.

（收稿日期：2024–07–04）

（修回日期：2024–10–28）