雙歧桿菌乳桿菌三聯活菌片對慢傳輸型便秘大鼠腸道Cajal間質細胞增殖的影響

[摘要]"目的"探討雙歧桿菌乳桿菌三聯活菌片對慢傳輸型便秘（slow"transit"constipation，STC）大鼠的治療作用及相關機制。方法"SPF級Wistar成年雌性大鼠30只，采用隨機數字表法分為對照組、模型組、雙歧桿菌乳桿菌三聯活菌片低劑量組（0.270g/kg）、雙歧桿菌乳桿菌三聯活菌片中劑量組（0.540g/kg）、雙歧桿菌乳桿菌三聯活菌片高劑量組（1.080g/kg）、陽性藥（琥珀酸普蘆卡必利片）（0.180mg/kg）組，每組5只。采用鹽酸洛哌丁胺灌胃建立STC大鼠模型。造模成功后，在繼續造模的基礎上分別給予藥物灌胃，連續給藥14d。觀察并計算各組大鼠一般體征變化、糞便含水率及腸道推進率，采用HE染色觀察結腸組織病理學改變。采用免疫組織化學法檢測大鼠結腸組織中受體酪氨酸激酶（receptor"tyrosine"kinase，c-Kit），5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT），5-HT3受體（5-hydroxy"tryptamine"3"receptor，5-HT3R）和5-HT4受體（5-hydroxy"tryptamine"4"receptor，5-HT4R）的蛋白表達。結果"與對照組比較，模型組大鼠的排便次數、糞便含水量、腸道推進速度等均有所下降，大鼠腸組織中c-Kit、5-HT、5-HT3R、5-HT4R等蛋白表達水平均明顯降低（Plt;0.05）。與模型組比較，給予雙歧桿菌乳桿菌三聯活菌片干預后，雙歧桿菌乳桿菌三聯活菌片低、中、高劑量組大鼠排便頻率、糞便含水率、腸道推進率、腸組織中c-Kit，5-HT，5-HT3R和5-HT4R的蛋白表達均明顯升高（Plt;0.05）。結論"腸道益生菌制劑雙歧桿菌乳桿菌三聯活菌片可有效改善STC的作用，通過促進結腸Cajal間質細胞增殖、增加5-HT、5-HT3R、5-HT4R的蛋白表達，可能是雙歧桿菌乳桿菌三聯活菌片改善STC的重要作用機制之一。

[關鍵詞]"慢傳輸型便秘；5-羥色胺；Cajal間質細胞

[中圖分類號]"R574.8""""""[文獻標識碼]"A""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2024.35.016

Effect"of"live"combined"bifidobacterium"and"lactobacillus"tabletsnbsp;on"intestinal"Cajal"interstitial"cell"proliferation"with"slow"transit"constipation"in"rats

LIU"Liya1，2，"ZHANG"Xinran1，"WU"Yulun1，"LIU"Qihong3，4，"CHEN"Jintuan1，"XIE"Qiurong5，"WEI"Lihui5，"KE"Xiao3，4，"SHEN"Aling1

1.Academy"of"Integrative"Medicine，"Fujian"University"of"Traditional"Chinese"Medicine，"Fuzhou"350122，"Fujian，"China;""""""""2.Affiliated"Sanming"Integrated"Medicine"Hospital"of"Fujian"University"of"Traditional"Chinese"Medicine，"Sanming"353001，"Fujian，"China;"3.Department"of"Spleen"and"Stomach，"the"Second"People’s"Hospital，"Fujian"University"of"Traditional"Chinese"Medicine，"Fuzhou"350003，"Fujian，"China;"4.Fujian"Traditional"Chinese"Medicine"Spleen"and"Stomach"Clinical"Medical"Research"Center，"Fuzhou"350003，"Fujian，"China;"5.Innovation"and"Transformation"Center，"Fujian"University"of"Traditional"Chinese"Medicine，"Fuzhou"350122，"Fujian，"China

[Abstract]"Objective"To"investigate"the"therapeutic"effect"and"mechanisms"of"live"combined"bifidobacterium"and"lactobacillus"tablets"on"slow"transit"constipation"（STC）"rats."Methods"A"total"of"30"SPF"grade"Wistar"adult"female"rats"were"blinded"and"divided"into"control"group，"model"group，"live"combined"bifidobacterium"and"lactobacillus"tablets"low-dose"（0.270g/kg），"live"combined"bifidobacterium"and"lactobacillus"tablets"medium"dose"group"（0.540g/kg），"live"combined"bifidobacterium"and"lactobacillus"tablets"high-dose"group"（1.080g/kg），"and"positive"drug"group"（prucalopride"succinate"tablet）"（0.180mg/kg），"with"5"rats"in"each"group."A"rat"model"of"STC"was"established"by"gavage"of"loperamide"hydrochloride."After"successful"modeling，"medication"wasnbsp;administered"by"gavage"for"14"consecutive"days"on"the"basis"of"continued"modeling."Observe"the"changes"in"general"physical"signs，"fecal"water"content，"and"calculate"intestinal"motility"in"each"group"of"rats."Using"HE"staining"to"observe"pathological"changes"in"colon"tissue，"immunohistochemical"methods"were"used"to"detect"the"protein"expression"of"receptor"tyrosine"kinase"（c-Kit），"5-hydroxytryptamine"（5-HT），"5-hydroxytryptamine"3"receptor"（5-HT3R），"and"5-hydroxytryptamine"4"receptor"（5-HT4R）"in"rat"colon"tissue."Results"Compared"with"control"group，"frequency"of"defecation，"fecal"water"content"and"intestinal"propulsion"speed"of"STC"model"rats"were"significantly"decreased."The"expression"levels"of"proteins"such"as"c-Kit，"5-HT，"5-HT3R，"and"5-HT4R"in"intestinal"tissues"were"significantly"reduced"in"STC"model"rats."Compared"with"STC"model"group，"rats"treated"with"low，"medium"and"high"doses"of"live"combined"bifidobacterium"and"lactobacillus"tablets"and"positive"drug"groups"showed"a"significant"increase"in"bowel"frequency，"fecal"water"content，"and"intestinal"motility"after"intervention."Compared"with"STC"model"group，"frequency"of"defecation，"fecal"water"content，"intestinal"propulsion"rate"and"protein"expression"of"c-Kit，"5-HT，"5-HT3R"and"5-HT4R"in"rat"intestinal"tissues"were"significantly"increased"after"intervention"of"live"combined"bifidobacterium"and"lactobacillus"tablets"low，"medium"and"high"dose"groups."Conclusion"This"study"confirms"that"probiotic"preparation"live"combined"bifidobacterium"and"lactobacillus"tablets"effectively"improves"slow"transit"constipation"by"promoting"the"proliferation"of"Cajal"interstitial"cells"in"the"colon，"increasing"the"expression"of"5-HT，"5-HT3R，"and"5-HT4R，"enhancing"intestinal"peristalsis，"and"achieving"the"therapeutic"effect"on"STC"rats.

[Key"words]"Slow"Transit"constipation;"5-Hydroxytryptamine;"Cajal"interstitial"cells

便秘是一種常見的胃腸道疾病，慢傳輸型便秘（slow"transit"constipation，STC）發病機制復雜，常發生在大腸功能障礙，傳輸時間延長，結果導致患者排便困難、大便硬結、便意減少等臨床表現[1-2]。長期STC可增加大腸癌患病風險，誘發心腦血管性疾病[3-4]。目前對STC的治療一般使用瀉藥、促腸動力藥等對癥治療，短期內效果顯著。長期服用效果欠佳[5]。

雙歧桿菌乳桿菌三聯活菌片是常用人體腸道正常活菌藥物之一，包含保加利亞乳桿菌、長型雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌，是一種腸道益生菌制劑，臨床常用于腸道菌群調節，改善患者腸道菌群紊亂的臨床癥狀。既往研究表明，口服益生菌聯合不同藥物通過改善腸道蠕動和腸道菌群分布等作用改善功能性便秘，可能與Cajal間質細胞（interstitial"cells"of"cajal，ICC）損傷、腸道微生物失調、腸神經系統功能障礙等多種機制的改變相關[6-8]。因此，本研究擬采用鹽酸洛哌丁胺混懸液灌胃給藥構建STC模型大鼠，檢測各組大鼠排便情況、胃腸動力改變、ICC損傷等指標，探討雙歧桿菌乳桿菌三聯活菌片對STC大鼠結腸運動功能的影響及其機制研究，為雙歧桿菌乳桿菌三聯活菌片臨床治療STC提供相關依據。

1""材料與方法

1.1""實驗動物

30只雌性無特定病原體（specific"pathogen"free，SPF）級Wistar成年實驗大鼠[北京華阜康生物科技股份有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（京）2019-0008]，體質量（150±20g）。所有動物均飼養在福建中醫藥大學實驗動物中心SPF級中，恒溫溫度20～22℃，相對濕度控制在40%～60%，室內保持12h晝夜交替，所有實驗動物自由飲食飲水。30只Wistar大鼠采用隨機數字表法分為對照組、模型組、雙歧桿菌乳桿菌三聯活菌片低劑量組、雙歧桿菌乳桿菌三聯活菌片中劑量組、雙歧桿菌乳桿菌三聯活菌片高劑量組、陽性藥（琥珀酸普蘆卡必利片）組，每組5只。除對照組大鼠不進行造模處理外，其余各組大鼠均用鹽酸洛哌丁胺3mg/kg混懸液大鼠灌胃7d進行造模處理。觀察到造模后大鼠排便次數和排便量減少為造模成功。造模成功后，給予雙歧桿菌乳桿菌三聯活菌片低（0.27g/kg）、中（0.54g/kg）、高劑量（1.08g/kg）灌胃干預，陽性藥組使用琥珀酸普蘆卡必利片（0.18mg/kg）配制混懸液灌胃給藥，對照組和模型組給予同等劑量生理鹽水灌胃處理，所有干預措施均連續給藥14d。本研究經福建中醫藥大學動物倫理委員會批準（動物實驗倫理批準號：FJTCM"IACUC2022018）。

1.2""藥物和儀器

鹽酸洛哌丁胺膠囊（批準文號：國藥準字H10910085，生產單位：西安楊森制藥有限公司，規格：2mg）；雙歧桿菌乳桿菌三聯活菌片（批準文號：國藥準字S19980004，生產單位：內蒙古雙奇藥業股份有限公司，規格：0.5g）；琥珀酸普蘆卡必利片（批準文號：國藥準字H20183482，生產單位：江蘇豪森藥業集團有限公司，規格：2mg）；5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）和5-HT4受體（5-"hydroxytryptamine"4"receptor，5-HT4R）購自武漢BIOSS公司，5-HT3受體（5-hydroxy"tryptamine"3"receptor，5-HT3R）購自美國SAB公司，受體酪氨酸激酶（receptor"tyrosine"kinase，c-Kit）抗體購自武漢Proteintech公司。石蠟包埋機和石蠟切片機均購自湖北錦源醫療科技有限公司，半自動化正立式顯微鏡購自德國徠卡公司。

1.3""檢測指標與病理觀察

末次給藥后，集中收集每組大鼠當天藥物干預后6h以內的糞便數量并拍照記錄，電子天平稱重，烘烤后稱重計算糞便含水率（%）＝（濕糞質量–干糞質量）/濕糞質量×100%。實驗結束前，用10%活性炭配置混懸液灌胃大鼠，每只用量3ml，10min后麻醉大鼠并取材，分離腸系膜并取出全部小腸組織，測量活性炭的距離和小腸全長，計算小腸推進率＝活性炭距離/小腸全長×100%。分離并取出全部大腸組織，拍照記錄。蘇木精-伊紅染色觀察組織病理改變。分離大腸遠端約0.5cm×0.5cm組織，去除糞便固定后包埋切片，脫蠟脫水后進行蘇木精核染，分化后伊紅復染，梯度脫水后封片。100倍鏡下觀察并獲取圖像。將大鼠大腸組織切片脫蠟、脫水后，3%的過氧化氫孵育、正常血清封閉、滴加相應的一抗抗體（5-HT、5-HT3R、5-HT4R、c-Kit）溶液，放置4℃環境中孵育過夜。二抗抗體室溫孵育，加入鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液室溫孵育后，新鮮配置二氨基聯苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）顯色處理，經封固后在400倍鏡下觀察獲取圖像并對陽性表達面積進行分析。

1.4""統計學方法

采用SPSS"26.0統計學軟件對數據進行處理分析，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（"）表示，組間比較采用t檢驗，不符合正態分布的數據以中位數（四分位間距）[M（Q1，Q3）]表示，組間比較采用秩和檢驗，計數資料以例數（百分率）[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2""結果

2.1""各組大鼠的基本情況比較

在實驗過程中，對照組大鼠精神活躍，進食規律，毛發光澤，排便正常。模型組大鼠出現精神煩躁，易怒，毛發失去光澤，排便次數和排便量與對照組相比明顯下降，證實造模成功。雙歧桿菌乳桿菌三聯活菌片及陽性藥物治療組大鼠精神狀態轉

好、排便增加。實驗結束后，觀察各組大鼠結腸大體觀，發現模型組大鼠結腸遠端中仍留有多粒糞便，藥物治療后結腸內糞便數量減少，見圖1。

2.2""各組大鼠的排便次數、糞便含水率和腸道推進率比較

與對照組比較，模型組的排便次數、糞便含水率和腸道推進率均明顯下降（Plt;0.05）；與模型組比較，雙歧桿菌乳桿菌三聯活菌片各劑量組和陽性藥組的排便次數、糞便含水率和腸道推進率均得到改善（Plt;0.05），見表1。

2.3""各組大鼠大腸病理改變情況的比較

對照組大鼠腸組織黏膜層細胞排列規則有序，無明顯炎性浸潤。模型組腸組織黏膜出現損傷，炎性浸潤，腺體消失。與模型組比較，雙歧桿菌乳桿菌三聯活菌片各劑量組和陽性藥組可見黏膜層結構較完整，黏膜損傷程度有明顯改善，腺體結構有所恢復。見圖2。

2.4""各組大鼠大腸組織中c-Kit蛋白表達的比較

與對照組比較，模型組大鼠c-Kit蛋白表達呈明顯降低趨勢（Plt;0.05）。與模型組比較，雙歧桿菌乳桿菌三聯活菌片干預后除低劑量組外，其余各組大鼠腸組織的c-Kit蛋白表達均升高（Plt;0.05）。見圖3。

與對照組比較，模型組大鼠5-HT、5-HT3R、5-HT4R蛋白表達呈降低趨勢（Plt;0.05）。與模型組比較，雙歧桿菌乳桿菌三聯活菌片干預后除低劑量組外，其余各劑量組大鼠腸組織中5-HT、5-HT3R、5-HT4R表達均升高（Plt;0.05）。見圖4。

3""討論

STC主要以結腸的傳輸功能障礙、腸內容物傳輸緩慢所致的便秘，受精神壓力大、飲食結構改變、環境改變等多種因素影響，發病率呈上升趨勢，嚴重者導致腸道黏膜的損傷，腸道通透性增加，促發多種疾病[1-2]。

本研究采用國內外較為公認的洛哌丁胺溶液灌胃方法建立STC"模型大鼠，其機制是作用于腸壁阿片受體，阻止膽堿和前列腺素釋放，從而抑制腸蠕動，延長腸道內容物通過時間，促進水、電解質等吸收，導致動物腸轉運時間延長，糞便數量和含水量減少，出現便秘癥狀[9-10]。本實驗給予鹽酸洛哌丁胺發現大鼠排便次數明顯減少、大便干燥、小腸推進減緩，均符合STC的主要病理特點[11-12]。研究證實口服益生菌改善腸道微生態平衡、調節腸道正常蠕動，改變大便性狀，有利排出。雙歧桿菌乳桿菌三聯活菌片，三種活菌含量較高，可使科酵解寡糖產生乙酸和乳酸，調節腸道菌群分布，可產生多種有機酸促進水分分泌，緩解便秘的產生[6，13]。琥珀酸普蘆卡必利是一種常見胃腸促動藥，是5-HT4R激動劑，常用于STC研究中作為陽性對照藥物，對腸道神經系統有較強的特異性，對整個腸胃道的刺激相對較小，在保證治療效果的同時大幅降低不良反應的發生[14]。本研究雙歧桿菌乳桿菌三聯活菌片不同劑量組和琥珀酸普蘆卡必利片陽性藥物組給予模型大鼠灌胃干預后，大鼠排便數量和糞便含水率均有所增加，促進小腸蠕動，提示雙歧桿菌乳桿菌三聯活菌片能有效促進STC大鼠排便，改善便秘情況，與陽性藥組效果接近。

研究表明，ICC細胞損傷是STC的發病機制之一，ICC是與胃腸運動密切相關一種特殊間質細胞。ICC的減少和功能障礙可導致結腸活動減少，阻斷腸神經系統和平滑肌細胞間信息傳遞，導致平滑肌細胞收縮力降低，造成結腸運動障礙和腸內容物傳輸延遲[15-17]。c-Kit是ICC的特異性標志物，在胃腸道中主要由肥大細胞和ICC表達[18]。本研究中，與對照組比較，STC模型大鼠腸組織中c-Kit的表達下降，而不同劑量雙歧桿菌乳桿菌三聯活菌片組干預后表達升高，說明雙歧桿菌乳桿菌三聯活菌片干預后ICC細胞數量增加，可能是緩解便秘的原因之一。5-HT是一種單胺型神經遞質，主要位于腸胃道的嗜鉻細胞中，參與腸蠕動的調節。與胃腸道關系較為密切的5-HT相關受體主要是5-HT3R、5-HT4R，分布于腸神經元上，介導黏膜下的內在感覺神經元激活，釋放乙酞膽堿或鈣蛋白基因相關肽等，使第二信使神經元產生慢興奮突觸后電位，最終激發腸壁的蠕動反射，引起胃腸道平滑肌收縮，促進腸道蠕動，引起排便[12]。本研究模型組大鼠腸組織中5-HT、5-HT3R、5-HT4R的表達均明顯低于對照組，而不同劑量雙歧桿菌乳桿菌三聯活菌片組干預后表達升高，說明雙歧桿菌乳桿菌三聯活菌片可通過5-HT與5-HT3R、5-HT4R特異性結合，參與腸蠕動調節，發揮治療便秘的作用。但雙歧桿菌乳桿菌三聯活菌片干預后通過增加c-Kit及5-HT、5-HT3R、5-HT4R蛋白表達發揮治療作用的深入機制有待進一步實驗探討。

本研究證實腸道益生菌制劑雙歧桿菌乳桿菌三聯活菌片可有效改善STC，可能的機制是通過促進STC大鼠結腸組織ICC的增殖、增加5-HT及5-HT3R、5-HT4R的表達，增強腸道蠕動，最終達到治療的效果。為雙歧桿菌乳桿菌三聯活菌片治療便秘提供實驗室依據。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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