沉默Ras同源物家族成員C對唾液腺腺樣囊性癌增殖、侵襲和遷移的影響

[摘要]目的 探討沉默Ras同源物家族成員C（RhoC）對唾液腺腺樣囊性癌（SACC）增殖、凋亡、侵襲、遷移和上皮一間充質轉化（EMT）的影響及其分子機制。方法 選擇2019年1月1日-2024年3月1日于青島市市立醫院手術切除的SACC病灶和正常唾液腺組織各27例，通過蛋白免疫印跡（Western blot）和免疫組織化學法檢測RhoC的表達水平。針對RhoC基因序列設計3條小干擾RNA（siRNA），轉染至SACC-LM和SACC-83細胞系中并評估轉染效率。通過Western blot比較RhoC、Rho相關卷曲螺旋蛋白激酶1（ROCKl）、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）、磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK）、扭曲家族bHLH轉錄因子1（TWISTI）、E-鈣黏蛋白（Ecadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）的蛋白表達水平。CCK-8實驗、流式細胞術、Transwell侵襲實驗、傷口愈合實驗分別檢測各組細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移能力的差異。生物信息學方法預測RhoC可能的上游微小RNA（miRNA）及其在SACC中的表達情況，雙熒光紊酶報告基因實驗驗證二者的結合位點。結果RhoC在SACC中的表達顯著上升（Plt;0.05）。沉默RhoC后，實驗組ROCK1、p-p38MAPK、TWIST1、N-cadherin、Vimentin的表達顯著下降，E-cadherin的表達顯著上升（Plt;0.05）；p38MAPK的表達無明顯差異（Pgt;05）；細胞增殖、侵襲和遷移能力顯著下降，凋亡率顯著上升（Plt;0.05）。miR-138-5p在SACC中低表達，miR-138-5p micmic可以顯著下調轉染RhoC野生型質粒后293T細胞的熒光素酶活性（Plt;0.05）。結論RhoC在SACC中高表達，沉默RhoC可能靶向下游ROCKl/p38MAPK/TWISTI信號通路從而抑制SACC的增殖、侵襲、遷移和EMT，同時促進其凋亡。miR-138-5p在SACC中低表達，是RhoC潛在的上游基因，二者可能存在結合位點。

[關鍵詞]唾液腺腺樣囊性癌；Ras同源物家族成員C；Rho相關卷曲螺旋蛋白激酶1；上皮-間充質轉化；mR-138-5p

[中圖分類號]R782[文獻標志碼]A[doi]10.7518/hxkq.2024.2024092

唾液腺腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）是一種常見的上皮來源的惡性腫瘤，占唾液腺惡性腫瘤的10％，占頭頸部惡性腫瘤的1％。該腫瘤具備高度神經浸潤性、極易遠處轉移等惡性標志，發生遠處轉移時10年總生存率可驟降52％。目前對于SACC的治療方法是以手術為主的綜合序列治療，但難以抑制腫瘤的擴散和復發。因此，探究SACC進展的分子機制并加以干預具有重要的臨床意義。

Ras同源物家族成員C（Ras homolog familymember C.RhoC）是一種常見的致癌基因，該基因編碼的RhoC蛋白屬于Rho GTP酶家族，可在三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）和二磷酸鳥苷（guanosine diphosphate，GDP）結合態之間切換，調節細胞骨架，影響肌動蛋白和肌球蛋白活性，從而調控細胞運動、極性和分裂等多種功能。近年來多項研究證實，RhoC既可影響Rho相關蛋白激酶（Rho-associated protein kinases，ROCK）和絲切蛋白（cofilin，CFL）等下游信號來促進腫瘤的侵襲和遷移，同時又受到miR106b、miR-93等上游基因的調控。本課題組既往研究證實該家族成員RhoA可促進SACC的惡性生物學行為，但有關RhoC對SACC影響的研究仍然較少。

本研究通過體外實驗觀察RhoC在SACC中的表達情況，采用小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）將其沉默后觀察下游信號和SACC增殖、凋亡、侵襲、遷移及上皮，間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的改變，同時通過生物信息學方法預測RhoC可能的上游微小RNA（micro RNA，miRNA），以期為SACC的分子靶向治療提供新思路。

1材料和方法

1.1材料和試劑

1.1.1組織樣本

液氮凍存的SACC標本及正常唾液腺組織各6例來自2024年1月1日-3月1日于青島市市立醫院口腔頜面外科行手術切除的6名患者。其中5例來自腮腺，1例來自腭腺。患者年齡為41～74歲，中位數為61歲；男4例，女2例。免疫組化所需SACC石蠟組織切片及正常唾液腺組織各21例，取自2019年1月1日-2024年3月1日于青島市市立醫院病理科明確診斷的21名SACC患者。其中14例來自腮腺，4例來自腭腺，3例來自舌下腺。患者年齡為41～81歲，中位數為66歲；男12例，女9例。納入標準：1）手術切除原發灶；2）術前未經放化療；3）腫瘤組織經組織病理學診斷為SACC；4）正常唾液腺組織經組織病理學檢查未見癌變。排除標準：1）原發灶已行放化療或其他非手術治療；2）既往有惡性腫瘤病史或全身伴隨其他惡性腫瘤；3）嚴重糖尿病、腎衰竭或其他系統性疾病，全身情況差，無法耐受手術者；4）臨床及病理資料不完整者。本研究已得到青島市市立醫院倫理委員會審核批準（批準號：2024-LW-023），所有患者均已知曉手術風險與標本用途，并簽署知情同意書。

1.1.2細胞系

人SACC-LM細胞系購自武漢尚恩生物技術有限公司；人SACC-83細胞系購自武漢普諾賽生命科技有限公司；人胚胎腎細胞293 （HEK293T）購自美國模式培養物集存庫。

1.1.3其他材料

RPMI-1640培養基、青，鏈霉素、0.25％胰蛋白酶（Thermo Fisher公司，美國）；胎牛血清（BI公司，以色列）；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（Amersco公司，美國）；SteadyPure通用型RNA提取試劑盒、Evo M-MLV反轉錄預混型試劑盒、SYBR GreenPro Taq HS預混型實時定量聚合酶鏈式反應（real-time quantitative polymerasechain reachon，RT-qPCR）試劑盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）；siRNA-RhoC（上海吉瑪公司）；引物磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）、RhoC（上海生工生物工程有限公司）；抗RhoC、抗Rho相關卷曲螺旋蛋白激酶1（Rho-associated coiled-coil containing protein kinase 1，ROCKl）、抗p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38-MAPK）、抗磷酸化p38MAPK （p-p38MAPK）、抗GAPDH （Cell Signaling Technology公司，美國）；抗扭曲家族bHLH轉錄因子1（twist family bHLHtranscription factor 1，TWISTl）、抗E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、抗N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、抗波形蛋白（Vimentin）、辣根過氧化物酶二抗（Ab-cam公司，英國）；CCK-8試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；流式細胞術試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；TransweU小室（Conung公司，美國）。

1.2實驗方法

1.2.1SACC細胞培養

將SACC-LM和SACC-83細胞置于含10％胎牛血清和1％青-鏈霉素的4mL RPMI-1640培養基中，并于37℃、5％CO2的恒溫培養箱中培養。細胞密度達80％-90％后，棄原培養液，PBS沖洗，加入2 mL胰酶消化3min后，加入等體積完全培養基終止消化，1000 r/min離心5min后，棄上清液，加入完全培養基重懸成單細胞懸液，最后以1：3比例傳代。

1.2.2RhoC在SACC中的表達測定

向分別盛放有6例SACC標本和正常唾液腺組織的研缽中加入液氮并反復研磨直至均勻，粉末置于1.5 mL無菌EP管并于-80℃下保存，提取總蛋白后采用Western blot檢測RhoC在SACC標本和正常唾液腺組織中的表達。采用一步法配膠，上樣量每孔5 uL，Marker 2.5 uL。120V電泳時間1h，400 mA轉膜時間30 min，TBST洗膜3次后5％脫脂牛奶封閉。加入一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入二抗室溫搖床孵育1h。TBST洗膜3次后顯影，拍照并分析灰度值。以GADPH為內參，RhoC抗體配制濃度為1：1 000，GAPDH抗體配制濃度為1：5 000。將免疫組化所需的SACC標本和正常唾液腺組織各21例蠟塊于實驗前一日進行切片、烘片。實驗當日脫蠟后采用乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）修復液修復，過氧化物阻斷劑阻斷10 min，PBS清洗，5％山羊血清封閉15-20 min，加入RhoC-抗（配制濃度1： 400）于37℃恒溫箱處理1h，PBS清洗3次后加入PV-6000二抗避光處理20 min，加入DAB顯色液，蘇木素染色細胞核，脫水并封片。顯微鏡下統計著色率和著色強度，RhoC以細胞核和（或）細胞質出現黃色或棕褐色為陽性表達。統計著色率時，0-5％記0分，6％-25％記1分，26％-50％記2分，51％-75％記3分，76％-100％記4分。統計著色強度時，不著色記0分，淡黃色記1分，黃色記2分，棕褐色記3分。將著色率與著色深度得分相加，總和0-1分記為陰性（-），2-3分記為弱陽性（+），4-5分記為陽性（++），6-7分記為強陽性（+++）。其中弱陽性、陽性和強陽性均視為陽性。

1.2.3轉染siRNA及效率測定

根據RhoC基因序列設計3條siRNA和1條陰性對照（表1）。嚴格按照說明書進行操作，于轉染實驗前24 h將處于對數生長期且適量傳代的SACC細胞以密度為2x10個／孔接種于6孔板。待細胞生長至60％～80％時開始轉染。取1.5 mL無菌EP管2支，分別加入200 uL RPMI-1640無血清培養基，再分別加入GP-transfect-Mate轉染試劑和RNA oligo各7.5 uL，靜置5 min后，將GP-trans-fect-Mate培養基混合物滴加至RNA oligo培養基混合物中，再次靜置15-20 nun后，立刻轉染。6孔板每孔采用PBS沖洗后，加入上述轉染試劑混合物與1 585 uL RPMI-1640完全培養基，至反應終體系為2 000LiL，RNA oligo終濃度為75 nmol·L-1。恒溫培養箱培養24 h后，RT-qPCR測RhoC的表達水平。使用SteadyPure通用型RNA提取試劑盒于各組細胞中提取總RNA，去除基因組DNA并以紫外分光光度儀檢測RNA純度及濃度后，采用EvOM-MLV反轉錄預混型試劑盒行逆轉錄，各組均取2 u互補DNA為模板，SYBR GreenPro Taq HS預混型qPCR試劑盒處理后行擴增。每組設置3個孔，實驗重復3次。以GAPDH為內參。RhoC上游引物序列為5’-AAGTTCCCTTTGCCCGTCTG-3’，下游引物序列為5’-ACAGTGGCAACTCAAGGGTC-3’；GAPDH上游引物序列為5’-TGAAATGTGCA-CGCACCAAG-3’，下游引物序列為5’-GGGAAG-CAGCATTCAGGTCT-3’。PCR程序設置：95℃預變性30 s，95℃變性5s，60℃退火30 s，共40個循環。反應結束后，采用2-△△a法比較轉染后各組細胞中RhoC mRNA的表達差異。選擇沉默效率最高的組別作為實驗組（siRNA-RhoC），同時設置陰性對照組和空白對照組，分別轉染siRNA-NC基因和只加入轉染試劑，進行后續細胞學實驗。

1.2.4Westemblot檢測RhoC下游信號通路及EMT相關蛋白的表達

各組細胞經RIPA裂解液處理后提取總蛋白，使用BCA法測定蛋白濃度后測定RhoC下游RO-CKl/p38MAPK/TWISTl信號通路及EMT相關蛋白的相對表達量，方法同1.2.2。ROCKl、p38MA-PK、p-p38MAPK、TWISTl、E-cadherin、N-cad-herin、Vimentin抗體配制濃度為1：1 000；GAPDH為1：5 000。

1.2.5CCK-8實驗檢測細胞增殖能力

沉默目的基因24h后，以1.5×10個/孔細胞密度將SACC-LM和SACC-83接種于96孔板，同時設置對照組僅加入培養液消除其對光密度（optical density，OD）值的影響。在避光環境下以10％CCK-8染色劑和90％RPMI-1640培養基配制反應液。在接種0、24、48、72 h后分別加人上述孔板并于培養箱中培養2h。通過酶標儀檢測波長450 nm的OD值，每組設5個孔，實驗重復3次。

1.2.6流式細胞術檢測細胞凋亡率

沉默目的基因24 h后，加入胰酶消化，PBS沖洗后重懸并調整細胞密度為5X10個/mL。取1 mL細胞懸液，300 g離心5min，棄上清，加入500 uL稀釋的Annexin V Binding Buffer重懸細胞。細胞懸液中加入5 uL Annexin V-FITC Reagent和5 uL PI Reagent（50 ug/mL）。渦旋混勻后，室溫避光孵育15～20 min，立即上機檢測，實驗重復3次。

1.2.7Transwell實驗檢測細胞侵襲能力

將基質膠置于4℃冰箱中過夜解凍并與預冷的RPMI-1640基礎培養基以1：8比例配制。取60 uL基質膠垂直均勻加入上室，避免產生氣泡和貼壁，培養箱中孵育3h后聚合成膜，棄上室余液。上下室每孔加入500 uL RPMI-1640基礎培養基后，培養2h使膜水化。轉染后24 h取各組細胞，以RPMI-1640無血清培養基調整細胞密度為2.5x10個/mL，下室加入600 uL含20％胎牛血清的RPMI-1640培養基，上室加入200 uL上述細胞懸液并培養48h。棄上下室液體，PBS沖洗，4％多聚甲醛固定15 min，0.1％結晶紫染色15 min，PBS沖洗，棉棒輕擦上室。隨機選取5個區域顯微鏡下拍照，計算穿膜細胞數量，實驗重復3次。

1.2.8傷口愈合實驗檢測細胞遷移能力

沉默目的基因24h后，將SACC-LM及SACC-83細胞以5x10個/孔接種于6孔板，待細胞密度達80％～90％時，用同一支1 000 uL移液槍頭垂直孔板底部按直線劃痕。PBS沖凈劃下細胞，每孔加入2 mL RPMI-1640基礎培養基，以消除細胞增殖對實驗的影響。而后分別于培養后0、24、48h在倒置顯微鏡下觀察各組細胞遷移情況，每組取上、中、下3個視野，實驗重復3次。使用Image J軟件進行測量并記錄各組細胞的相對愈合率。計算公式：相對愈合率=（Oh劃痕寬度-24h或48 h劃痕寬度）／0 h劃痕寬度。

1.2.9生物信息學預測SACC中RhoC的上游mi-RNA

從美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）中GEO（Gene Expression Omnibus）（https：//www.ncbi.nlmnih.gov/geo/）數據庫下載包含SACC患者miRNA表達數據的GSE59700和GSE117275數據集。使用RNA相互作用數據庫（Encyclopedia ofRNAinteractomes，ENCORI，Starbase） （https：//rnasysu.com/encori/），miRNA靶向預測綜合分析網站（miRmap） （https：//mirmap.ezlab.org）查詢與RhoC可能存在靶向關系的miRNA，與上述數據庫取交集并繪制韋恩（Venn）圖。選擇差異明顯（llogFCIgt;1，Plt;0.05）且miRmap score較高者繪制火山圖。使用ENCORI預測RhoC與上游miRNA的結合位點。

1.2.10雙熒光索酶報告基因實驗驗證RhoC與上游miRNA的結合位點

針對ENCORI預測的結合位點設計報告基因質粒。將293T細胞以1X10個/孔接種于24孔板，每組設置3個孔，實驗重復3次。實驗分4組：1）RhoC野生型報告基因質粒+m1R-138-5p mimic；2）RhoC野生型報告基因質粒+miR-138-5p mimic對照；3）RhoC突變型報告基因質粒+miR-138-5pmimlc；4）RhoC突變型報告基因質粒+miR-138-5p mimic對照。各組細胞分別于無血清RPMI-1640中共轉染，轉染6h后更換完全培養基。轉染48h后，棄液，PBS沖洗。每孔加入100 uL Passive Lysis Buffer裂解液處理15 min。裂解液收集至1.5 mLEP管中，12 000 r-min-l離心1 min，上清液收集至新EP管中。不透光96孔板中加入100 uL LARⅡ，再加入20 uL裂解上清液，混勻后測量Firefly luciferase值為報告基因發光值。加入100 uL Stop＆Glo Reagent，混勻后測定記錄Renilla luciferase值為內參。

1.3統計學分析

使用SPSS 18.0及GraphPad Prism 8.0分析各組結果。K-S檢驗（Kolmogorov-Smirnov test）對正態性進行評估，同時使用萊文檢驗（Levene test）檢驗方差齊性。計量資料符合正態分布者用均數士標準差表示，采用方差分析（ANOVA）進行多組間比較；方差齊者選擇LSD-t檢驗行進一步的兩兩比較，方差不齊者則選用Games-Howell法。符合偏態分布者用M（P25，P75）表示，選擇Kruskal-WallisH檢驗進行多組間比較，進一步比較選擇用Bonferroni校正的Mann-Whitney U檢驗。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1RhoC在SACC中的表達

Westem blot結果顯示：RhoC在6例SACC中的蛋白相對表達量顯著高于6例正常唾液腺組織，差異具有統計學意義（Plt;0.05，圖1）。免疫組化結果顯示：RhoC主要表達在細胞漿，在SACC中的陽性表達率為66.67％ （14/21），顯著高于正常唾液腺組織的28.57％ （6/21），差異具有統計學意義（Plt;0.05，圖2）。由此說明，RhoC在SACC中過表達。

2.2siRNA的轉染效率

qRT-PCR結果顯示：在SACC-LM與SACC-83兩種細胞系中，與空白對照組和陰性對照組相比，轉染后siRNA-RhoC 1#組、siRNA-RhoC 2#組和siRNA-RhoC 3#組RhoC mRNA相對表達量均顯著降低，差異具有統計學意義（Plt;0.05，圖3）。同時空白對照組和陰性對照組相比差異無統計學意義（Pgt;0.05，圖3），由此說明轉染成功。其中siR-NA-RhoC 3#組轉染效率最高，選擇為實驗組進行后續研究。

2.3RhoC下游信號通路相關蛋白的表達

Westem blot結果顯示：在SACC-LM與SACC，83兩種細胞系中，與空白對照組和陰性對照組相比，轉染后RhoC、ROCK1、p-p38MAPK、TWIS-Tl的蛋白相對表達量顯著下降，差異具有統計學意義（Plt;0.05，圖4）；p38MAPK的蛋白相對表達量差異無統計學意義（Pgt;0.05，圖4）。同時空白對照組和陰性對照組相比差異無統計學意義（Pgt;0.05，圖4）。由此說明，沉默RhoC可能抑制其下游ROCKl/p38MAPIOTWISTI信號通路而對SACC惡性行為產生影響。

2.4EMT相關蛋白的表達

Westem blot結果顯示：在SACC-LM與SACC83兩種細胞系中，與空白對照組和陰性對照組相比，轉染后N-cadherin、Vimentin的蛋白相對表達量顯著下降，E-cadherin的蛋白相對表達量顯著上升，差異具有統計學意義（均Plt;0.05，圖5）。同時空白對照維和陰性對照組相比差異無統計學意義（Pgt;0.05，圖5）。由此說明，沉默RhoC可顯著抑制SACC的EMT水平。

2.5沉默RhoC對SACC增殖的影響

CCK-8實驗結果顯示：在SACC-LM和SACC-83中，接種Oh后，實驗組的OD值與空白對照組和陰性對照組的OD值相比差異均無統計學意義（Pgt;0.05）；接種24、48、72 h后，實驗組的OD值均顯著低于空白對照組和陰性對照組，差異具有統計學意義（Plt;0.05，表2）。同時空白對照組和陰性對照組相比差異無統計學意義（Pgt;0.05，表2）。由此說明，沉默RhoC可顯著抑制SACC的增殖能力。

2.6沉默RhoC對SACC凋亡的影響

Annexin FITC/PI染色結果顯示：在SACCLM中，轉染后實驗組的細胞凋亡率（11.30％±0.87％）顯著高于空白對照組（4.40％±0.21％）和陰性對照組（5.22％±0.82％），差異具有統計學意義（Plt;0.05，圖6）；在SACC-83中，轉染后實驗組的細胞凋亡率（11.45％±0.78％）顯著高于空白對照組（5.25％±1.01％）和陰性對照組（5.43％±0.88％），差異具有統計學意義（Plt;0.05，圖6）。同時空白對照組和陰性對照組相比差異無統計學意義（Pgt;0.05，圖6）。由此說明，沉默RhoC可顯著促進SACC的凋亡。

2.7沉默RhoC對SACC侵襲的影響

Transwell實驗結果顯示：在SACC-LM中，轉染后實驗組的穿膜細胞數量（348.73±39.00）顯著低于空白對照組（797.07±36.58）和陰性對照組（766.67±49.89），差異具有統計學意義（Plt;0.05，圖7）；在SACC-83中，轉染后實驗組的穿膜細胞數量（266.60±43.32）顯著低于空白對照組（512.20±45.37）和陰性對照組（524.40±38.08），差異具有統計學意義（Plt;0.05，圖7）。同時空白對照組和陰性對照組相比差異無統計學意義（Pgt;0.05，圖7）。由此說明，沉默RhoC可顯著抑制SACC的侵襲能力。

2.8沉默RhoC對SACC遷移的影響

傷口愈合實驗結果顯示：在SACC-LM中，處理后24 h實驗組的相對愈合率（19.38％±7.15％），顯著低于空白對照組（39.55％±3.75％）和陰性對照組（43.08％±3.42％），差異具有統計學意義（Plt;0.05，圖8）；處理后48 h實驗組的相對愈合率（40.82％±5.14％）顯著低于空白對照組（77.06％±2.46％）和陰性對照組（77.05％±2.82％），差異具有統計學意義（Plt;0.05，圖8）。在SACC-83中，處理后24 h實驗組的相對愈合率（25.65％±1.99％）顯著低于空白對照組（34.82％±3.57％）和陰性對照組（36.28％±3.03％），差異具有統計學意義（Plt;0.05，圖8）；處理后48 h實驗組的相對愈合率（49.69％±4.27％）顯著低予空白對照維（74.51％±2.89％）和陰性對照組（72.00％±2.44％），差異具有統計學意義（Plt;0.05，圖8）。同時空白對照組和陰性對照組相比差異無統計學意義（Pgt;0.05，圖8）。由此說明，沉默RhoC可顯著抑制SACC的遷移能力。

2.9RhoC與上游靶點miR-138-5p存在結合位點

ENCORI、miRmap、GSE59700和GSE117275數據分析結果顯示，miR-17、miR-31、miR-93、miR-138-5p、miR-9、miR-150、miR-106b、miR-331、miR-486和miR-455共10種miRNA可能與RhoC存在結合位點（圖9）。其中miR-138-5p的可能性最強（miRmap score=88.51），且在SACC中表達顯著降低，差異具有統計學意義（logFC=-2.41，Plt;0.05，圖10）。ENCORI分析顯示RhoC與miR-138-5p可能存在結合位點（圖11）。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示：miR-138-5p mimic可以顯著下調轉染RhoC野生型質粒的293T細胞的熒光素酶活性，差異具有統計學意義（Plt;0.05），而對轉染RhoC突變型質粒的293T細胞的熒光素酶活性沒有影響（Pgt;b0.05），且miR-138-5p mimic對照對轉染RhoC野生型及突變型質粒的293T細胞的熒光素酶活性均無影響（Pgt;0.05）。由此說明，miR-138-5p可靶向結合RhoC，可能成為后者的調控靶點（圖12）。

3討論

SACC是一種兼具嗜神經生長、極易復發和遠處轉移等惡性生物學行為的唾液腺上皮腫瘤，手術、放化療等療法對治療其效果不佳，且國際上關于復發性或轉移性SACC尚無獲批的靶向藥物，上述多種原因導致SACC死亡率高、預后較差。因此，研究SACC的病因及其分子機制，積極探索高特異性治療靶點，對于提高其臨床診療水平具有關鍵意義。

Rho家族屬于RAS超家族，該家族成員由20個小信號轉導G蛋白組成，與癌癥的惡性進展密切相關。Rho家族蛋白具有結合GDP和GTP的特性，定位于細胞膜時可被鳥嘌呤核苷酸交換因子（guanine nucleotide exchange factors，GEF）激活為GTP結合態，隨后充當“分子開關”激活下游效應蛋白如p21活化激酶（p21-activated kinases，PAK）和ROCK，影響細胞生長、遷移和外滲，進而調控惡性腫瘤的增殖、侵襲和轉移。作為Rho家族中最常見的一種異構體，RhoC已被證實在胰腺癌、肝癌、乳腺癌等惡性腫瘤中過表達，并促進其發生發展州。而在本研究中，RhoC在SA-cc中同樣高表達，提示該基因可能促進SACC的惡性生物學行為。

ROCK1是一種屬于AGC超家族的絲氨酸，蘇氨酸蛋白激酶，也是作用于Rho家族蛋白下游的關鍵因子，在多種癌癥中表達顯著升高。該蛋白可通過Rho蛋白依賴性的方式被激活，誘導下游信號如肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC）和磷脂酰肌醇受體磷酸化，刺激Ca2+內流，從而促進細胞遷移；而抑制該蛋白可降低肌動蛋白收縮性和調節其細胞骨架，使細胞形態變為長而不規則的扁平態，這種變化會抑制腫瘤細胞的集落形成并誘導其凋亡。本研究中，沉默RhoC后ROCK1的表達顯著下降，同時細胞增殖、遷移能力下降，凋亡率上升。說明沉默RhoC可能通過抑制ROCK1的Rho依賴性激活，繼而對SACC的惡性行為起負向調控作用。

p38MAPK屬于絲裂原活化蛋白激酶（Mito-gen-activated protein kinases，MAPK）家族，與多種癌癥密切相關。該蛋白能將細胞外信號與細胞內信號相聯系，從而調控細胞增殖、凋亡和分化等多種生物過程。p38MAPK的激活由激酶級聯介導，即MAP3K激活MAPK2K，后者又激活p38，MAPK，p38MAPK上具有能結合特定底物的激活基序，能與多種底物如脂質運載蛋白2（Li-poca-lin 2，LCN2）上的特異性對接結構域結合，影響癌細胞的形成、侵襲和轉移等多種惡性行為。有研究表明，Rho家族蛋白中細胞分裂周期蛋白42（cell division cycle 42，Cdc42）可與絲裂原活化蛋白激酶激酶1（mitogen-activated protein kinase klnase 1，MEKl）結合，MEK1可作為MAP3K的上游激活物達到激活p38MAPK的目的。在本研究中，沉默RhoC后ROCK1與p38MAPK的表達同時下降，提示RhoC的低表達可能抑制ROCK-1級聯介導的p38MAPK激活，繼而起到抑制SA-cc的作用。

TWIST1是堿性螺旋-環-螺旋轉錄因子家族的成員，該家族蛋白擁有一段堿性氨基酸的E-box結合域，在上皮細胞的間充質轉化中發揮重要作用，通過體內外研究證明敲除TWIST1可顯著抑制乳腺癌的惡性行為。在腫瘤形成過程中，凋亡主要由ARF/p53信號通路觸發，而TWIST1不僅與p53啟動子的有效反式激活劑HOXA5發生相互作用并抑制其活性，還能抑制ADP核糖基化因子（ADP-ribosylation factors，ARF）的表達及穩定性從而阻止其翻譯后修飾，繼而抑制細胞凋亡㈣。EMT是指極化、不易運動的上皮細胞經一系列復雜生化過程，如細胞骨架重組，轉變為非極化、易運動的間充質細胞，同時獲得高侵襲性和抗凋亡能力的過程。TWIST1已被證實可誘導E-cad-herin下調，并增加間質標記物如Vimentin和N-cadherin的表達，其主要機制是通過與E-cad-herin啟動子中的多個E-box結合域結合從而抑制其轉錄。本研究中，沉默RhoC后p-p38-MAPK、TWIST1、N-cadherin和Vimentin的表達均下降，E-cadhenn的表達顯著上升，同時SACC侵襲能力減弱，凋亡率上升。由此推測，沉默R-hoC可能會阻止p38MAPK與底物TWIST1上特異性對接結構域的結合，減弱后者對ARF/p53等下游通路的抑制作用以及與EMT相關蛋白上E-box結合域的結合能力，最終促進SACC的凋亡，抑制其侵襲和EMT。

近年來，隨著競爭性內源RNA假說的提出和大量實驗驗證，學者們愈發重視IncRNA-miRNA-mRNA三者互作在癌癥中的重要調控作用，該理論認為miRNA可以與多個靶基因的mRNA上3'UTR區域結合并將其沉默，抑制單個miRNA可能導致多個致癌基因的表達下調，從而發揮顯著的抗癌作用。由于SACC的罕見性，國內對其miRNA-mRNA互作的研究甚少。本研究在觀察RhoC及其下游信號對SACC的影響之外，利用生物信息學方法預測了RhoC的上游miRNA，以期為SACC的分子靶向治療提供新思路。

綜上所述，本研究利用siRNA沉默SACC-LM和SACC-83中的RhoC基因，觀察到其下游信號通路ROCKl/p38MAPK/TWISTl及EMT相關蛋白的表達顯著降低，SACC的惡性生物學行為顯著減弱。由此推測，沉默RhoC后ROCK1的Rho依賴性激活減少，使得下游p38MAPK的激酶級聯激活受到抑制，p38MAPK無法與TWIST1的特異性對接結構域結合，導致后者與細胞凋亡及EMT相關蛋白上E-box結合域的結合減弱，最終起到抑制SACC增殖、侵襲、遷移和EMT的作用。本研究在分析RhoC下游信號的同時預測其上游信號，為其成為SACC靶向治療的重要位點提供了依據，而有關RhoC在SACC中的具體作用機制仍待進一步研究。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。